5第五讲分子克隆载体共69页文档
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分子克隆技术实验讲义黑龙江大学生命科学学院2016年3月甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆与鉴定一、实验目的1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。
2、学习和掌握质粒、T载体的特点。
3、学习和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。
4、学习和掌握XcmⅠ酶切制备T载体的过程及方法。
5、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。
6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。
7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。
8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。
二、相关知识(一)T载体的制备pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物(T-A Cloning)的商业化专用载体,由pΜC 18载体改建而成。
在pΜC 18多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了EcoRⅤ识别位点,用EcoRⅤ进行酶切反应后,再左两侧的3′端添加“T”而成,可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
相关知识点:(1)质粒的提取;(2)酶切;(3)PCR等。
(二)DNA的重组与连接(PCR产物的克隆)把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中,例如从某种质粒克隆到另一种质粒,这个过程称为亚克隆。
所谓重组,就是把外源目的基因“装进”载体的过程,即DNA的重新组合。
为了将目的基因重组于载体分子中,需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理,一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子,使其与相同酶切过的载体分子相互连接,彼此成为配伍末端(compatible end),以产生末端连接。
现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段的专用载体,如专门用于克隆PCR产物的载体,大大方便了实验操作。
相关知识点:(1)克隆与亚克隆;(2)DNA重组;(3)内切酶;(4)粘性末端与平末端;(5)连接酶;(6)连接酶的分类及功能等。
(三)大肠杆菌感受态细胞的制备外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后,需将其导入受体细胞进行扩增和筛选,得到大量、单一的重组体分子,这就是外源基因的无性繁殖,或称为克隆。
分子克隆载体(vector)载体(vector)是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。
载体同外源DNA在体外重组成DNA 重组分子,在进入受体后形成一个复制子,即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。
重组DNA 技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ,柯斯质粒(cosmid)和噬菌体M13。
载体(vector)是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。
载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子,在进入受体后形成一个复制子,即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。
因此,作为载体应该满足以下几方面的要求:①有某种限制酶的一个切点,最好是有许多种限制酶的切点,而且每种酶的切点只有一个;②外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自我复制,载体应对受体细胞无害,以及载体能接纳尽可能大的外源DNA片段;③有利于选择的标记基因,可以很方便地知道外源DNA已经插入,以及把接受了载体的受体细胞选出;④具有促进外源DNA表达的调控区。
重组DNA技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ,柯斯质粒(cosmid)和噬菌体M13。
它们的受体细胞都是大肠杆菌。
这四种载体的大小和结构尽管各不相同,但它们的共同特点是:①都能在大肠杆菌中自主复制,而且能连同所带的外源DNA一起复制;②都很容易同细菌DNA分开并加以纯化;③都有一段DNA对于它们自身在细菌中的增殖不是必需的。
因此,外源DNA可以插入这一段DNA中,或是置换这一段DNA而不影响载体的复制。
根据这一特点,载体又可分成插入型和置换型两大类。
质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移,可以独立复制,也可整合到细菌染色体DNA中,随着染色体DNA的复制而复制。
载体可以分为:克隆载体、表达载体及穿梭载体。
1.克隆载体(cloning vector):通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体,在载体上插入合适大小的外源DNA片段,并注意不能破坏载体的自我复制性质。
第三章 分子克隆载体第一节 分子克隆载体如果只有基因而没有负责运载它的载体,则基因就不可能发挥作用。
基因工程载体决定了外源基因的复制、扩增和表达。
载体的本质DNA。
载体(vector)就是指携带外源DNA片段进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。
目前常用有载体有很多种,它们分别由从细菌质粒、噬菌体DNA、病毒DNA分离出的元件组装而成。
它们可分为克隆载体和表达载体,表达载体又分胞内表达和分泌表达载体。
从表达所用的受体细胞,又可分为原核细胞和真核细胞载体。
从功能上又可分为测序载体、克隆-转录载体和基因调控报告载体等多功能载体。
1.1 克隆载体1.1.1 克隆载体具备的条件①载体都能携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞,或停留在细胞质中自我复制,或整合到染色体DNA上,随着染色体DNA的复制而同步复制。
②载体都具有合适的筛选遗传标记。
③载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶位点,即多克隆位点。
④载体都必须是安全的,不应含有对受体细胞有害的基因,并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物细胞,尤其是人的细胞。
⑤载体本身的分子量都比较小,可容纳较大的外源基因片段。
⑥载体在细胞内的拷贝数要高,方便外源基因在细胞内大量扩增。
⑦载体在细胞内稳定性要高,保证重组体稳定传代而不易丢失。
⑧载体的特征都是充分掌握的,包括它的全部核苷酸序列。
克隆载体在基因工程中占有十分重要的地位,目的基因能否有效转入受体细胞,并在其中维持和高效表达,在很大程度上取决于克隆载体。
基因工程是随着克隆载体系统的建立才发展起来的。
原核生物基因工程之所以起步早,发展快,成果大,就是因为最早建立了适用于原核生物的克隆载体系统,并且至今已建立了种类繁多的用于原核生物的大量克隆载体。
近十年来,植物基因工程所发展,同样是因为成功地构建了适用于植物的一系列的克隆载体。
因此,国内外把构建新的克隆载体始终作为基因工程基础研究的优先项目,构建的克隆载体可以申请专利保护。