分子克隆载体的选择共17页

（4）具有与同源序列质粒进行重组的能力。
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四、酵母细胞的克隆载体
♪1、整合型载体（YIP）
♪ YIP型载体是由大肠杆菌质粒和酵母的 DNA片段构成的。这类载体在细菌中复 制、扩增，进入酵母后可整合表达。 YIP型载体的特点是转化率低(只有110转化子/微克DNA)，但转化子遗传性 稳定，多用于遗传分析工作。
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3.M13噬菌体载体的优点
与其它载体相比，M13载体具有两个十分有用 的优点：
①这类载体的基因组中有一条饰变的β-半乳糖苷酶 基因片段，其中插入了一段具有密集的多克隆位 点的序列。
②M13载体系列是应用基因工程技术成对地构建的， 可以有效地克隆双链DNA分子的每一条链。
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三、柯斯质粒载体
sup-细菌
尾部基因 （琥珀突变型）
组装尾部所需要的组分 “无头部”的提取物
转录复制 蛋白质合成
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组装头部所需要的组分 “无尾部”的提取物
温育 完整的噬菌体
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二、M13噬菌体载体
M13是丝状噬菌体，有长约 6500个核苷酸的闭环DNA基 因组。M13附着在大肠杆菌 的F性菌毛上，所以它们只 能感染雄性细菌。不过M13 噬菌体DNA亦可通过转染作 用导入雌性大肠杆菌细胞。
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2、复制型载体（YRP）
♪ YRP型载体是带有选择标记和复制子的酵母 的DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。 因为它同时含有大肠杆菌和酵母的自主复 制基因，所以能在两种细胞中存在和复制
♪ 可以在两种截然不同的生物细胞中复制的 载体称为穿梭载体，穿梭载体在基因工程 中广泛使用。
分子克隆常用载体

黏粒载体(cosmid vector)
基本特征： 1 是质粒的衍生物，是带有cos位点的质粒。 2 其组成有质粒的复制起点(ColE1)、抗性基
因、cos位点、MCS。 3 大小为5～7kb 4 能克隆的外源DNA片段最大达40kb。
黏粒载体的特点：
（1）具有λ 噬菌体的特性（但因不含λ 噬菌 体的全部必需基因，因此不能通过溶菌周 期，无法形成子代噬菌体颗粒）；
质粒的存在形式：
一般以超螺旋共价闭环DNA分子(ccc-DNA) 的形式存在。
也可以开环DNA分子(oc-DNA)和线性DNA分 子(L-DNA)的形式存在。
质粒DNA的大小
质粒
宿主
pPbs
蓝藻
CoLE1
大肠杆菌
PV21
三叶草根瘤菌
多数在10kb左右
大小（kb） 1.5 6.4 700
质粒的基本性质： 1 复制
利用染色体的复制功能来驱动外源DNA片段 复制的载体。
1 酵母人工染色体载体(YAC) 2 细菌人工染色体载体(BAC)
酵母人工染色体载体(YAC)
利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体。 复制的必须元件：
作为克隆载体的DNA分子具备的条件：
1 具有对受体细胞的可转移性，能携带外源 基因进入宿主细胞；
2 能在宿主细胞中自主复制，一限制酶识别位点组成的多克隆 位点(MCS）；
4 克隆载体必须具有用于选择克隆子的标记 基因；
5 克隆载体必须是安全的，不应含有对受体 细胞有害的基因，并且不会任意转入除受 体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人 的细胞。
MCS
lacZ`
Ampr Ori
含四个部分：
（1）来自pBR322的质粒 复制起点（ori）；

选择标记基因：(用于鉴别目的DNA的存在， 将成功转化了载体的宿主挑选出来）
(1)氨苄青霉素抗性基因 (ampr apr) (2)卡那霉素抗性基因 (kanr kmr)
(3)四环素抗性基因 （tcr tetr）
(4)氯霉素抗性基因 (cmpr cmr)
(5)新霉素抗性基因（neor）
pBR322
多克隆位点
MCS
复制起始点
ori
Ampr
遗传标记
克隆载体
按功能分： 克隆载体
表达载体
质粒克隆载体 (plasmid cloning vector)
质粒(plasmid):是一种寓于宿主细胞中染色体外裸露 的dsDNA分子。 一个质粒就是一个DNA分子。
Plasmid
chromosome
存在于细菌、真菌、蓝藻和绿藻的细胞中，在细菌细胞中最多。
构建质粒载体的基本原则
3 组装合适的选择标记基因 构建供转化大肠杆菌用的质粒载体，可组 装蓝/白颜色进行选择的(B-半乳糖苷酶基 因)lacz’基因。 但构建供转化蓝藻用的质粒载体不能用这 个基因。因为蓝藻含有大量的藻蓝蛋白。
构建质粒载体的基本原则
4 选用合适的启动子
如果用真核生物基因的启动子作为原核 生物表达克隆载体的启动子，其功效下降； 原核生物和病毒基因的启动子用作真核 生物表达克隆载体的启动子，可保留外源DNA片段的大小 为0～7.2kb。基因lac5编码区终止密码子之 前有一个E.coRI，可以用于外源DNA的插入。
置换型载体
在填充片段两端有对称分布的MCS，这两 个载体的差别是MCS位点的排列位置相反。
M13噬菌体载体
基因工程中常对单链DNA测序、制备探针或 实施定点突变，应用此载体就可以获得单链DNA。

第7页，共41页。
质粒自主转移
导 入
+ 自 主 转 移 +
H H
无 D N A 转 移
d o n o r
H
+
辅 助 转 移
H
+
质粒的辅助转移
质粒的重组转移
H
H
+
Notransfer 重 组
R-重组DNA分子
R + R DNA转 移 +R
第8页，共41页。
4.质粒DNA的复制和调节控制
1) 复制机制—复制方向、终止和方式 2) 质粒拷贝数的控制—抑制剂模型：高拷贝质粒需高浓度
由于λ载体或重组DNA是通过感染途径进入宿主细胞的，因而形成 的噬菌斑就是一个明显的标记。用于重组子检测的遗传标记基因主 要有lacZ 基因。不管是用插入或取代法，该标记基因均会失活。 利用spi-选择重组子：野生型λ不能在P2溶源化菌种中成活，称之为 spi+(sensitive to P2 interference)，这与red和gam基因有关。若用外 源DNA将这些基因取代，形成的重组DNA分子可在P2菌中株中存活， 并形成噬菌斑。λ载体λ1059、λL47.1均属此类，这种选择方式亦称 之为显性选择。
ii. 基因结构—46个基因，分为以下四类：
ⅰ) 调控基因：CⅢ、N、CI、Cro、CⅡ—决定进入溶源化还是裂 解状态
ⅱ) DNA复制：O、P、Q ⅲ)λ重组：int、xis、redβ和gam ⅳ)噬菌体颗粒形成与细胞裂解：头(A-F)、尾(E-J)、S & R
（细胞裂解）λ中部约1/3的DNA(b2)与λ存活无关。
p UC1 9
LacZ
Ap r (2.68kb)

✓ 选择标记基因selective marker gene 用于鉴别目标DNA的存在，将成功转化了质粒的
宿主挑选出来 抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记
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•氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr） •四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tetr） •氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat） •卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor）
• 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质 粒可分为两大复制类型：
• 松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 relaxed plasmid • 严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 stringent plasmid
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2）质粒的不相容性plasmids incompatibility
当外源 DNA 片段插入 tetr 基因后，导致 tetr 基因 失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通 过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片 段插入到载体中。
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二、质粒载体的种类
1. pBR322之前 2. 天然质粒：没有经过以基因克隆为目标
的体外修饰改造的质粒。 在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天
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•正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因 产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活。 如蔗糖致死基因 SacB ，来自淀粉水解芽胞杆菌 （Bacillus amyloliquefaciens） ，编码果聚糖蔗糖酶。 在含蔗糖的培养基上 sacB 基因的表达对大肠杆菌来 说是致死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组 子。

5. 合适的克隆位点
单克隆位点和多克隆位点
第九节
分子克隆载体的组建
构建克隆载体必须考虑的条件：复制起点，克隆位点， 标记基因，载体容量等。
1. 克隆位点的建立
1) 体外重组
i. 减少限制酶识别位点 ii. 增加限制酶识别位点： 人工接头，匹配接头
2) 体内重组或突变
i. 减少限制酶识别位点 体内自发突变和体外限制酶切富集。如在构建pSUPV系 列载体时，去除Kanr 基因中的indIII位点就采用了以下技 术路线： 培养有pNG35的大肠杆菌细胞 提取质粒DNA 用HindIII 完全酶切 转化大肠杆菌 再提取质粒DNA 再酶切，
2. 标记基因的建立
1）启动子 2）编码区—密码子偏爱性，基因产物适用范围 3）终止子
3. 载体容量
尽可能除去无关的DNA序列。
第二章 练习题
1．当一DNA片段插入终止子探针型载体pBU10的HindⅢ克隆位 点后，重组质粒仍可转化E.coli (CmlsTcs) 为CmlrTcr ，为什么? 可设计什么实验证明其假设? 2．当一DNA片段插入pUC18后，在x-gal平板上出现两类菌落， 兰色菌落和白色菌落。从白色菌落中分离纯化的质粒经电泳 检查，均比原载体DNA分子大；但从兰色菌落随机分离的质 粒DNA却有两类，其中一类与载体大小相同，另一类却与白 色菌落中分离的质粒大小相同。如何解释这一实验结果? 可 设计何种实验证明你的解释是正确的? 3．当把一外源DNA插入一克隆载体后，重组DNA分子转化 E.coli 细胞所获得的重组子分子可根据其限制酶图谱分为两类， 即这两类转化子中所含的重组DNA分子的限制酶图谱不一样， 从这两类转化细胞中分离到的重组DNA分子可用限制酶回收 插入的片段。而从这两类转化细胞培养液所分离到的DNA却

第四页，讲稿共六十五页哦
作为克隆载体的DNA分子具备的条件： 1 具有对受体细胞的可转移性，能携带外源基
因进入宿主细胞； 2 能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因
的增殖；
第五页，讲稿共六十五页哦
3 具有由单一限制酶识别位点组成的多克隆位 点(MCS）；
4 克隆载体必须具有用于选择克隆子的标记基 因；
拷贝数少，为1～5个 2 ）松散型质粒(relaxed plasmid)
拷贝数多，可达10个拷贝以上
第十四页，讲稿共六十五页哦
某种质粒属于严谨型或是松散型的，与 宿主有一定的关系。
例子：质粒ColE1-K30在大肠杆菌中属 于松散型的，在奇异变形杆菌中是严谨型的 。
一般来说，希望构建的质粒克隆载体是 松散型的，所以在构建的克隆载体中应含有 松散型的复制起始位点和调控复制拷贝数的 基因。
第九页，讲稿共六十五页哦
质粒(plasmid):是一种寓于宿主细胞中染色体外裸露的
dsDNA分子。
一个质粒就是一个DNA分子。
Plasmid
chromosome
存在于细菌、真菌、蓝藻和绿藻的细胞中，在细菌细胞中最多。
第十页，讲稿共六十五页哦
第十一页，讲稿共六十五页哦
质粒的存在形式： 一般以超螺旋共价闭环DNA分子(ccc-DNA)的
第三十四页，讲稿共六十五页哦
MCS
lacZ`
Ampr
Ori
含四个部分：
（1）来自pBR322的质粒复 制起点（ori）；
（2）ampr ;
（3）大肠杆菌β半乳糖苷酶基
因（lacZ）的启动子及其编码α-
肽链的DNA序列；
（4）多克隆位点（MCS）
pUC18
pUC19

的DNA进行复性分析时，DNA分子间不会发生复性，但把从不 同类转化细胞培养液分离到的DNA进行同样的实验时，发现在 电镜下可观察到十分类似于8字形的结构。如何解释上述实验结 果? 可利用图示法解释。 4. 由于分子克隆载体的大小决定外源DNA插入片段的大小，两者 呈反比关系，因而在建立载体时千方百计地减小载体分子量。
7．当YIp整合到染色体DNA中后，偶尔还会发生再次重组，导 致突变基因被野生型基因所取代，现已知有两个转化体分别 属于上述两种情况，可用何种方法区别这两种不同的转化体?
8．当YRp质粒转移到酵母细胞后，有时也会发生整合现象，即 这种自主复制是质粒可插入到染色体DNA中，现有一个含 URA3的YRp质粒，可用何种方法筛选到这种整合型的转化体? 如何证明?
文 家 。汉 族 ，东 晋 浔阳 柴桑 人 （今 江西 九江 ） 。曾 做过 几 年小 官， 后辞 官 回家 ，从 此 隐居 ，田 园生 活 是陶 渊明 诗 的主 要题 材， 相 关作 品有 《饮 酒 》 、 《 归 园 田 居 》 、 《 桃花 源 记 》 、 《 五 柳先 生 传 》 、 《 归 去来 兮 辞 》 等 。
分子克隆载体的选择
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、
露
凝
无
游
氛
，
天
高
风
景
澈
。
7、翩翩新 来燕，双双入我庐 ，先巢故尚在，相 将还旧居。
8
、
吁
嗟
身
后
名
ห้องสมุดไป่ตู้
，
于
我
若
浮
烟
。
9、 陶渊 明（ 约 365年 —427年 ），字 元亮， （又 一说名 潜，字 渊明 ）号五 柳先生 ，私 谥“靖 节”， 东晋 末期南 朝宋初 期诗 人、文 学家、 辞赋 家、散

ⅰ) 调控基因：CⅢ、N、CI、Cro、CⅡ—决定进入溶源化还是裂 解状态
ⅱ) DNA复制：O、P、Q
ⅲ)λ重组：int、xis、redβ和gam ⅳ)噬菌体颗粒形成与细胞裂解：头(A-F)、尾(E-J)、S & R
（细胞裂解）λ中部约1/3的DNA(b2)与λ存活无关。
当前您浏览的)
ori
A m pr
当前您浏览的位置是第十五页，共四十二页。
三. 噬菌体载体
1. 噬菌体λ载体
1）λ的结构和特点 i. 一般结构：48,502bp，线状ds-DNA，两端具有12n.t 5‘-
突起（5’-GGGCGGCGACCT-3’）该末端称为cos位点， 可被λ编码的末端酶所识别（该酶由λ末端的两个基因 Nul和A编码蛋白gpNul和gpA组成） ii. 基因结构—46个基因，分为以下四类：
ⅲ.转移过程所需的全部酶类—反式作用
3）质粒转移类型
ⅰ.自我转移（Self-transmissible）
ⅱ.辅助转移（Donation）—可转移质粒仅具备oriT，若无辅助 质粒，前者不会发生接合转移。若辅助质粒可提供所有反式 作用的蛋白质，前者便会发生接合转移。
ⅲ.重组转移（conduction）—若质粒无oriT，该质粒只有整合到辅 助质粒DNA中，重组质粒便可转移。
大肠杆菌λ噬菌体的基因和表达调控
头
尾
w
A
BC DE Z UVG T H M LK I J
N
OP
Q SR
整合 切除、重组
att PI
免疫和调控
OL
OR
tL PL
t M P M PR
D N A 合成
tR1
Ori
TR2