下载文档原格式
基因工程绪论1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。
作动词：基因的分离和重组的过程。
2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。
供体、受体和载体是基因工程的三大要素。
3、基因工程诞生的基础三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。
以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。
三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。
2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。
5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。
6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。
7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。
8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。
9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
10、RNAH降解与DNA杂交的RNA，用于cDNA文库建立时除去RNA以进行第二链的合成。
第三章原核生物分子克隆载体第三章分子克隆载体§3.1 质粒载体质粒是独立于寄主染色体以外的自主复制的共价、闭合、环形的双链DNA分子(covalently closed circular DNA, cccDNA)。
除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所有的质粒都是DNA。
但是质粒DNA的复制又必须依赖于寄主提供核酸酶及蛋白质。
质粒DNA分子大小：小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质；大的可达105KD，两者相差上百倍。
质粒DNA与寄主染色体DNA间的关系：一般情况下，质粒DNA 可持续地处于寄主染色体外的游离状态，但在一定条件下又可以可逆地整合到寄主染色体上，并随之一道复制和细胞分裂而传到后代。
一、质粒的一般特征1.质粒DNA编码的表型质粒DNA的分子量较小，仅占细胞染色体的一小部分，一般约为3%，但却编码着重要的遗传性状：a.抗性特征：抗菌素抗性、重金属抗性、毒性阴离子抗性，以及其它抗性。
b.代谢特征：抗菌素及细菌素合成；简单的碳水化合物(例如乳糖、蔗糖等)的新陈代谢；复杂碳水化合物(甲苯、苯胺)及卤代化合物的新陈代谢；蛋白质新陈代谢；……c.修饰寄主生活方式的因子：大肠杆菌肠毒素的合成；金黄色葡萄球菌剥脱性毒素的合成；2.质粒DNA的转移①接合型质粒和非接合型质粒*接合型质粒(conjugative plasmid)：又叫自我转移质粒，具有自我复制基因。
控制细菌配对和质粒接合转移的基因；*非接合型质粒(non- conjugative plasmid)：亦叫不能自我转移的质粒，具有自我复制基因，但失去了控制细胞配对和接合转移的基因，因此不能够从一个细胞转移到另一个细胞。
②质粒DNA的转移过程质粒自主转移质粒的辅助转移质粒的重组转移3.质粒DNA的复制类型根据寄主细胞中所含拷贝数的多少，讲质粒分为：①低拷贝数质粒——“严紧型”控制的质粒(stringent plasmid)：每个寄主细胞中仅含有1-3份拷贝；②高拷贝数质粒——“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)：每个寄主细胞中可高达10-60份拷贝。
分子克隆载体（vector）载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。
载体同外源DNA在体外重组成DNA 重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。
重组DNA 技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。
载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。
载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。
因此，作为载体应该满足以下几方面的要求：①有某种限制酶的一个切点，最好是有许多种限制酶的切点，而且每种酶的切点只有一个；②外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自我复制，载体应对受体细胞无害，以及载体能接纳尽可能大的外源DNA片段；③有利于选择的标记基因，可以很方便地知道外源DNA已经插入，以及把接受了载体的受体细胞选出；④具有促进外源DNA表达的调控区。
重组DNA技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。
它们的受体细胞都是大肠杆菌。
这四种载体的大小和结构尽管各不相同，但它们的共同特点是：①都能在大肠杆菌中自主复制，而且能连同所带的外源DNA一起复制；②都很容易同细菌DNA分开并加以纯化；③都有一段DNA对于它们自身在细菌中的增殖不是必需的。
因此，外源DNA可以插入这一段DNA中，或是置换这一段DNA而不影响载体的复制。
根据这一特点，载体又可分成插入型和置换型两大类。
质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。
载体可以分为：克隆载体、表达载体及穿梭载体。
1.克隆载体(cloning vector):通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。
基因工程期末复习第一章：基因工程1. 定义：通过基因操作来定向改变或修饰生物体或人类自身，并具有明确应用目的的活动称为基因工程。
2. 基因工程研究的主要内容或步骤：基因克隆的通用策略：涉及的过程可用分/合成、切、连、转、选、鉴。
①从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段；②在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子；③将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起增殖；④从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了细胞重组DNA分子的受体细胞克隆；⑤从筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用；⑥将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。
3.三大元件：载体、质粒、片段。
第二章：分子克隆工具酶1、工具酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、DNA修饰酶、核酸外切酶、单链核酸内切酶。
2、限制性内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。
三种（Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶）3、甲基化酶：原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA 不被相应的限制酶所切割。
三种（）4、回文结构：双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列，每条单链以任一方向阅读时都是一样的。
5、同裂酶（isoschizomers)：指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。
同裂酶可能进行同样的切割，产生同样的末端。
但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。
6、同尾酶（isocaudamer）：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。
利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。
7、影响核酸内切酶活性的因素：①DNA浓度②DNA的甲基化程度③酶切消化反应的温度（大多数酶的标准反应温度37度）④DNA的分子结构。
基因⼯程复习资料⼀、绪论1、简述基因⼯程的概念。
答：基因⼯程是指按照⼈们的设计，⽤⽣物技术直接操作⽣物的基因组。
通过分离和拷贝⽬的基因或⼈⼯合成外源基因，在体外将外源基因插⼊到载体分⼦中，成为重组DNA，再导⼊宿主细胞内，进⾏扩增和表达。
此过程所涉及的⽅法学称为重组DNA技术，也称分⼦克隆或基因操作。
2、列举基因⼯程中常⽤的⼀些技术。
答：（1）基因敲⼊：以ES细胞培养技术和同源重组为基础，通过转基因将外源基因整合到特定的靶位点，利⽤靶位点全套的表达调控元件以实现特异性的异位表达。
（2）基因敲除：将⼀个特地设计的DNA⽚段导⼊⽣物体中，通过同源重组使靶基因被置换出⽽失活的实验技术。
（3）基因敲落：是⽤反义技术，RNAi等降低或抑制靶基因的表达活性。
（4）基因打靶：是⽤同源重组来瞄准希望改变的特定内源基因。
（5）基因组编辑：⽤基因组编辑核酸酶，如锌指核酸酶（ZFN）、归巢核酸内切酶、转录激活⼦样效应物（TALE）和成簇间隔短回⽂重复（CRISPR）进⾏剪切。
⼆、基因⼯程的分⼦遗传学基础（⼀）名词解释1、基因表达：指DNA分⼦经转录产⽣互补的RNA分⼦。
2、半保留复制：亲代DNA双链分离后的两条单链均可作为新链合成的模板，复制完成后的⼦代DNA分⼦的核苷酸序列均与亲代DNA分⼦相同，但⼦代DNA分⼦的双链⼀条来⾃亲代，另⼀条为新合成的链，故称为半保留复制。
3、半不连续复制：是指DNA复制时，前导链上DNA的合成是连续的，后随链上是不连续的，故称为半不连续复制。
半不连续模型是DNA复制的基本过程。
4、DNA的变性：指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，双链变成单链，从⽽使核酸的天然构象和性质发⽣改变。
变性DNA常发⽣⼀些理化及⽣物学性质的改变：溶液粘度降低、溶液旋光性发⽣改变、增⾊效应。
5、DNA的复性：指变性DNA在适当条件下，两条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，是变性的⼀种逆转过程。
热变性DNA⼀般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退⽕”。
第三章分子克隆载体§3.1 质粒载体质粒是独立于寄主染色体以外的自主复制的共价、闭合、环形的双链DNA分子(covalently closed circular DNA, cccDNA)。
除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所有的质粒都是DNA。
但是质粒DNA的复制又必须依赖于寄主提供核酸酶及蛋白质。
质粒DNA分子大小：小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质；大的可达105KD，两者相差上百倍。
质粒DNA与寄主染色体DNA间的关系：一般情况下，质粒DNA可持续地处于寄主染色体外的游离状态，但在一定条件下又可以可逆地整合到寄主染色体上，并随之一道复制和细胞分裂而传到后代。
一、质粒的一般特征1.质粒DNA编码的表型质粒DNA的分子量较小，仅占细胞染色体的一小部分，一般约为3%，但却编码着重要的遗传性状：a.抗性特征：抗菌素抗性、重金属抗性、毒性阴离子抗性，以及其它抗性。
b.代谢特征：抗菌素及细菌素合成；简单的碳水化合物(例如乳糖、蔗糖等)的新陈代谢；复杂碳水化合物(甲苯、苯胺)及卤代化合物的新陈代谢；蛋白质新陈代谢；……c.修饰寄主生活方式的因子：大肠杆菌肠毒素的合成；金黄色葡萄球菌剥脱性毒素的合成；2.质粒DNA的转移①接合型质粒和非接合型质粒*接合型质粒(conjugative plasmid)：又叫自我转移质粒，具有自我复制基因。
控制细菌配对和质粒接合转移的基因；*非接合型质粒(non- conjugative plasmid)：亦叫不能自我转移的质粒，具有自我复制基因，但失去了控制细胞配对和接合转移的基因，因此不能够从一个细胞转移到另一个细胞。
②质粒DNA的转移过程质粒自主转移质粒的辅助转移质粒的重组转移3.质粒DNA的复制类型根据寄主细胞中所含拷贝数的多少，讲质粒分为：①低拷贝数质粒——“严紧型”控制的质粒(stringent plasmid)：每个寄主细胞中仅含有1-3份拷贝；②高拷贝数质粒——“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)：每个寄主细胞中可高达10-60份拷贝。
一种质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并非绝对的，它的复制不仅受自身的制约而且还受到寄主的控制4.质粒的不亲和性①定义：是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞中稳定共存的现象。
注意：只有当有确切的证据表明第二种质粒B已经进入含有A质粒的寄主细胞，而且它的DNA不受寄主细胞限制体系的降解作用，但这两种细胞却不能长期共存，只有在这种情况下，我们才能说A和B是不亲和的质粒。
②不亲和群的概念：彼此之间互不相容的质粒，属于同一不亲和群(incompatibility group)。
彼此能够共存的质粒则属于不同的不亲和群。
同一不亲和群的南粒在亲缘关系上则比较接近，以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不亲和pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不亲和p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不亲和③质粒不亲和性的分子基础质粒不亲和性的分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的：*ⅰ. 负反馈调节环(negetive feed-back loop)：大多数质粒产生可控制质粒复制的阻遏蛋白质，其数量与细胞中质粒拷贝数成正比。
当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白时，其复制活动便被抑制了。
当质粒处于低拷贝数和低浓度的阻遏蛋白时，其复制活动更会继续时行。
ⅱ.同一个细胞含两种相容质粒，由于亲缘关系远，故它们所产生的阻遏蛋白质就不会互相影响另一个质粒的复制。
于是这两种质粒在同一细胞中都保持着自己的正常拷贝数。
*ⅲ.同一细胞含两种不相容的质粒，亲缘关系密切，它们所产生的阻遏蛋白质不仅影响自身质粒DNA复制，还会彼此影响对方质粒DNA的复制。
这就出现了两种阻遏蛋白质联合调控质粒复制速率。
*ⅳ两种不相容质粒往往拷贝数不相当，其中高拷贝数的对复制抑制剂的敏感性较低拷贝数的要差一些。
因此在复制抑制剂(阻遏蛋白质)浓度低的情况下，高拷贝质粒仍可复制，从而最终使低拷贝质粒被淘汰掉(稀释掉)。
二、质粒DNA的复制与拷贝数的控制1．ColE1质粒DNA复制调节的机理许多的质粒载体都是由ColE1质粒派生的。
ColE1质粒的复制是从一个特定的复制起点（ori）开始，并沿着环型DNA单向进行。
RNAI和RNAII这两种分子都是由ColE1 DNA 转录产生的，是控制ColE1质粒复制的两种关键因素。
由于这两种RNA分子是根据同一区段DNA的正反链合成的，因此两者的序列是彼此互补的。
RNAI是由ColE1质粒的inc基因编码的一种小分子量的RNA分子，它通过干扰RNAII分子的加工而抑制质粒DNA分子的复制。
RNAII也是由ColE质粒DNA编码的另一种小分子量的RNA分子，并在复制起点形成RNA-DNA杂交分子。
RNase是一种核酸内切酶，它切割RNAII分子释放出3 -OH作为DNA聚合酶I催化的DNA复制的引物。
所以控制ColE1质粒复制的关键点就是在复制起点形成RNAⅡ-DNA双链分子，而它的关键步骤却是由RNAⅠ控制。
ColE1的复制同样也受一种RNA调节剂Rom的控制，它可以使RNAI和RNAIIII之间的碱基配对作用保持稳定，从而阻止RNA Ⅱ与模板DNA杂交2．质粒复制控制的分子模型目前公认的阐明质粒复制控制机理的分子模型有两个:自体阻遏蛋白质模型:核心是阻遏蛋白质的合成受负反馈调节机理调节。
关键论点是：阻遏蛋白质的合成受负反馈机理调节，而且其浓度是恒定的。
抑制蛋白质稀释模型:阻遏蛋白质是组成型合成,其浓度同质粒的拷贝数成正比。
关键论点是：阻遏蛋白质是组成型合成，其浓度同质粒的拷贝数成正比。
①抑制蛋白质稀释模型质粒DNA的复制是受一种由质粒编码的抑制蛋白Cop调控的。
Cop蛋白质的浓度同质粒的拷贝数成正比。
它通过两种途径质粒的复制：一种是通过同质粒DNA的复制起点(ori)结合，直接抑制质粒复制.另一种是通过阻断起始蛋白质Rep的合成，间接地抑制质粒DNA的合成。
一般认为,单体状态的Cop蛋白质是没有活性的，当处于多体状态时，才具有活性，而这两种蛋白之间的平衡,取决于细胞中抑制蛋白质自身的浓度。
由于细胞在生长过程中体积不断增大，蛋白浓度下降,形成单体形式，失去抑制作用，质粒拷贝数增加。
但由于拷贝数增加抑制蛋白编码基因数目也随之增加到一定程度又导致质粒复制受抑制。
②自体阻遏蛋白质模型质粒的复制是由起始蛋白Rep引发的,该蛋白是复制启动作用的限速因子.它的浓度决定着每个细胞每个世代的质粒的最终复制总数. Rep蛋白编码基因rep和自体阻遏蛋白质编码基因atr是属于同一个操纵子,共转录成同一个mRNA分子.自体阻遏蛋白同启动子-操纵子区(P/O)的结合作用,调节质粒的转录,以维持细胞中Atr和Rep蛋白处于恒定的水平.,而由Atr蛋白调节产生的Rep蛋白,则是通过同复制起点(ori)的结合来引发质粒复制.另一种解释是Rep蛋白具有双重功能,既具有自体阻遏蛋白的功能,也可同(P/O)的结合抑制转录,又具有起始蛋白功能,引发质粒复制.三、质粒DNA的分离与纯化1．氯化铯密度梯度离心法原理：由于质粒DNA与染色体DNA在化学结构上并没有什么差别，因此，要使质粒DNA 与其寄主染色体DNA区分开来，就必须从两者DNA的高级结构上寻找突破口。
实验表明，在细胞裂解和DNA的分离过程中，大分子量的细胞染色体DNA容易断裂成相应的线性片段，而质粒DNA由于分子量小，结构紧密，因此仍能保持完整的状态。
氯化铯-EtBr密度梯度离心法，就是根据这种寄主染色体DNA与质粒DNA在高级结构上的差别(或说是异质性)而分离纯化的技术。
在氯化铯密度梯度离心中，氯化铯是作为介质其密度为1.7g/cm3，经过一段超速离心平衡之后，便形成了1-1.9052g/cm3的连续的浮力密度梯度。
已知大肠杆菌寄主染色体DNA、质粒DNA、大肠杆菌寄主染色体DNA和RNA等4种大分子物质，具有不同的浮力密度，因此经过超离心平衡之后，便会分布在CsCl连续密度梯度介质的等密度位置上，从而达到了彼此分离的目的。
缺陷：尽管氯化铯-EtBr密度梯度离心法可以得到高纯度高质量的质粒DNA，但是操作复杂，且需要昂贵的氯化铯和超离心设备，并且溴化乙锭又是极强的致癌物质。
所以目前最流行的分离纯化质粒DNA地方法是碱变性法。
2.碱变性法原理：是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当通过致冷或恢复中性pH值，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能准确复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
四、质粒载体的构建及其类型质粒载体必须具备的条件a.具有复制起点：这是质粒增殖所必不可少的条件，亦可帮助维持正常的质粒拷贝数b.具有抗菌素抗性基因：提供转化子的选择记号，理想的质粒载体应具两个抗菌素抗性基因。
在外源DNA插入之后，仍应保留一个强选择记号。
c.具有若干种限制酶单一识别位点：这一特点可满足克隆需求，而且要求在插入了外源DNA 片段之后，应不影响质粒DNA的复制功能。
d.具有较小的分子量和较高的拷贝数：易于操作，而且在插入了外源DNA(一般不超过15Kb)仍可有效地转化受体细胞。
天然质粒用作克隆载体的局限性：（图）1.质粒载体选择记号在基因克隆中采用的质粒载体，大多数都是使用抗菌素抗性记号，一方面是由于许多质粒本身就带有抗菌素抗性基因的抗药性R因子，另一方面因为抗菌素抗性记号具有便于操作、易于选择等优点。
下面是克隆中常用的几种抗菌素：a.氨苄青霉素抗性基因(ampr)b.氯霉素抗性基因(cmlr)c.卡那霉素抗生基因(Kanr)d.链霉素抗性基因(strr)e.四环素抗性基因(tetr)2.不同类型的质粒载体（图）五、重要的大肠杆菌质粒载体1．pSC101质粒载体是一种典型的严紧型控制的低拷贝的大肠杆菌质粒载体，是第一个成功地用于在E.coli中克隆真核DNA的大肠杆菌质粒载体：拷贝数：1-2个/cell分子大小：9.09Kb抗性表型：ter r2. pBR322质粒载体（图）①pBR322质粒载体的构建pBR322质粒按照标准的质粒载体命名法则命名的.”P”表示它是一种质粒;而”BR”分别取自该质粒的两位主要构建者F.BolivarR.L.Rodriguez姓氏的头一个字母.”322”实验编号,和其他质粒载体pBR325、pBR327相区别。
