第二章 菌种扩大培养

经典分类鉴定方法：形态特征、生理生化特 征、血清学试验等。
现代分类鉴定方法：遗传特性、细胞化学组 分、计算机数值分析。
（6）毒性试验
自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将 其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有 关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中 除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆 菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食 用，均需通过两年以上的毒性试验。
中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。
5）抗生素菌种保藏管理中心（CACC）；
中圈医学科学院抗生素研究所，北京和四川抗生素工业研究所，成都：新 抗生素菌种。
华北药厂抗生素研究所，石家庄：生产用抗生素菌种 6）兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）； 农业部兽医药品监察所，北京。
（二）菌种的衰退与复壮
（3） IAM （Institute of Applied Microbiology）， University of Tokyo，Japan。
日本东京大学应用微生物研究所，日本东京。
（4） IFO （Institute for Fermentation）， Osaka， Japan。
发酵研究所，日本大阪。
在我国为了推动菌种保臧事业的发展，1970午7月在国家 科委和中国科学院主持下，召开了第一次全国菌种保藏工作 会议，在会上成立了中国微生物菌种保减管理委员会 （CCCMS）委托中国科学院负责担负全国菌种保臧管理业务， 下设六个菌种保藏管理中心。
l）普通微生物菌种保臧管理中心（CCGMC）；
中国科学院微生物研究所，北京（AS）：真菌，细菌。
实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必 须重新进行分离纯化。
有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合 理先进的设备与之配合。

实例
放线菌(抗生素生产) 放线菌的细胞生长繁殖速度较慢， 放线菌(抗生素生产)：放线菌的细胞生长繁殖速度较慢，常 常用三级种子扩大培养， 常用三级种子扩大培养，即将种子罐中之菌丝移植到较大的 种子罐中扩大培养后，再移入发酵罐中， 种子罐中扩大培养后，再移入发酵罐中，这种流程称为三级 发酵。一般50t发酵罐多采用三级发酵， 50t发酵罐多采用三级发酵 发酵。一般50t发酵罐多采用三级发酵，有的甚至采用四级 发酵，如链霉素生产。 发酵，如链霉素生产。 霉菌（酶制剂）：酶制剂发酵生产也采用三级发酵。 ）：酶制剂发酵生产也采用三级发酵 霉菌（酶制剂）：酶制剂发酵生产也采用三级发酵。 细菌(谷氨酸)：谷氨酸及其他氨基酸发酵所用的菌种是细菌， 细菌(谷氨酸) 谷氨酸及其他氨基酸发酵所用的菌种是细菌， 生长繁殖速度很快，所以采用二级发酵。 生长繁殖速度很快，所以采用二级发酵。
第二节、 第二节、种子扩大培养
扩大培养的目的：为每次发酵罐的投料，提供相当 扩大培养的目的：为每次发酵罐的投料， 数量的代谢旺盛的种子，以提高发酵效率。 数量的代谢旺盛的种子，以提高发酵效率。 种子的要求：一定的数量、代谢旺盛、不能染菌。 种子的要求：一定的数量、代谢旺盛、不能染菌。 种子扩大培养流程如下： 种子扩大培养流程如下： 斜面菌种---一级种子摇床培养---二级种子罐培 斜面菌种---一级种子摇床培养---二级种子罐培 ---一级种子摇床培养------发酵罐 发酵罐。 养----发酵罐。
接种量的确定
大量地接入成熟的菌种， 大量地接入成熟的菌种，可以缩短生长过程的缓慢 因而缩短发酵周期， 期，因而缩短发酵周期，节约了发酵培养的动力消 提高了设备利用率，并有利于减少染菌机会。 耗，提高了设备利用率，并有利于减少染菌机会。 接种量过多也无必要，因种子培养费时， 接种量过多也无必要，因种子培养费时，而且过多 地移入代谢废物，反而会影响正常发酵。 地移入代谢废物，反而会影响正常发酵。 接种量与菌种的生长速度有关， 接种量与菌种的生长速度有关，如霉菌接种量一般 10%，酵母5 10%，细菌1 5%。 为10%，酵母5-10%，细菌1-5%。 接种量与菌液中菌体的浓度有关，如使用孢子接种， 接种量与菌液中菌体的浓度有关，如使用孢子接种， 接种量可明高的营养缺陷型突 根据代谢控制的要求， 变菌株或调节突变菌株或野生菌株； 变菌株或调节突变菌株或野生菌株； 抗噬菌体能力强的菌株，不易感染噬菌体； 抗噬菌体能力强的菌株，不易感染噬菌体； 菌种纯粹，不易变异退化， 菌种纯粹，不易变异退化，以保证发酵生产和产品 质量的稳定性； 质量的稳定性； 不是病源菌， 不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒 包括抗生素、激素和毒素等) 以保证安全。 素(包括抗生素、激素和毒素等)，以保证安全。

力下降
过短：菌种数量不够，适应能力弱，生长 慢，发酵时间长，引起污染
（2）种量 接种种子量与发酵液比1:10左右,较大，长
得快，发酵周期短，开始占优势，不易 染杂菌，但不能过大，也不能过小
接种பைடு நூலகம்过大： 菌繁殖过快，营养成份消耗过快，供氧不足，
菌体生长不好，代谢产物下降 接种量过小： 生长繁殖速度慢，易染菌 接种量大小决定于种子生长、繁殖速度 细菌，繁殖快，接种量小 1％－10％ 霉菌、放线菌繁殖慢，接种量大7％－15％ 酵母菌两者之间，通风快，不通风慢，10％
子悬浮液→一级种子罐→发酵罐发酵
三、种子扩大培养旳质量要求
1、种子要纯粹，无杂菌和噬菌体 2、种子要壮
GA菌 V型分裂要多，整齐，代谢旺盛活力强 酒精 酵母要呈圆形或椭圆形，饱满，耗糖快，
出芽率20％以上，染色率1％下列，霉菌孢子 要丰满，色正常
3、要有足够旳菌数 GA生产 104 －109 个/ml O.D净增0.－0.5 酒精 0.8－1亿个
思索题
1、什么是发酵工程，应用范围有哪些？ 2、了解EMP TCA DCA 3、什么是烈性噬菌体，温和噬菌体，敏
感性细菌，溶原性细菌 4、双层琼脂法检验噬菌体 5、微生物工业对菌种有何要求？ 6、怎样预防菌种衰退？ 7、了解种子培养工艺过程。 8、影响种子质量旳原因有哪些？
静置培养——厌氧性微生物、酒精、乳酸 发酵
液体培养：摇瓶培养－种子三角瓶 深层通风培养
浅盘固定培养——米曲 厚层固定培养——厚层通风制曲、酒精、
酱油 载体培养（泡沫型料）——色素（红曲霉）
二、种子培养旳工艺过程
1、菌体接种法——多用于细菌、酵母菌 原菌种→斜面试管培养→液体试管培养→
三角瓶培养→一级种子罐培养→发酵 2、孢子接种法——用于霉菌、放线菌 原菌种→试管斜面培养→茄子瓶培养→孢

生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程上归
为发酵车间管理。
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第二章 菌种扩 大培养
2．1 实验室种子制备
2．1．1 种子保藏 2．1．2 菌种移接
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第二章 菌种扩 大培养
菌种保藏的意义
菌种 –微生物学以及生命科学研究的基本材料 –世代时期很短，传代过程中易发生变异、死亡 –造成工业生产菌种的退化、使优良菌种丢失。 菌种保藏是微生物学研究和微生物育种工作的重要 组成部分 要采用最合适的保存方法使菌种的变异和死亡减少 到最低限度
第二章 菌种扩 大培养
生物反应工程
陈宏文 博士 华侨大学生物工程与技术系
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第二章 菌种扩 大培养
第二章 菌种及其扩大培养
引言 种子扩大培养的目的与种子要求 2.1 实验室种子制备 2.2 生产车间种子制备 2.3 影响种子质量的因素 2.4 种子质量控制措施
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第二章 菌种扩 大培养
目前工业规模的发酵发酵罐容积已达几十立方米 或几百立方米。如按百分之十左右的种子量计算， 就要投入几立方米或几十立方米的种子。 要从保藏在试管中的微生物菌种逐级扩大为生产 用种子，是一个由实验室制备到车间生产的过程。
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第二章 菌种扩 大培养

斜面冰箱保藏法（低温）
短期、过渡的保藏方法 新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子 生长丰满后，放在4°C冰箱保存。 一般保存期为三个月到六个月。
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第二章 保藏法（缺营养、低温）
适合于产孢子或芽孢的微生物。制备方法： 将沙与土洗净烘干过筛后，按沙与土的比例为1—2： 1混合均匀，分装于小试管中，装料高度约为1厘米左 右，121°C间歇灭菌三次，灭菌试验合格后烘干备用。 一般沙用80目过滤，土用80一100目过筛。 将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢 子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干， 放在冰箱内保存。一般保存期为一年左右。

孢子丝盘卷成球形孢囊，内形成孢酵母菌
单细胞真核，主 分布于含糖质较多的 偏酸性环境中，如水 果、蔬菜、花蜜和植 物叶子上，以及果园 土壤中。
1、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)
又称啤酒酵母。细胞多为圆形、 卵形，能产生子囊孢子。能发酵 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和半乳糖 等多种糖类，但不发酵乳糖和蜜 二糖。
5、白地霉 ( Geotrichum candidum )
➢ 节孢子单个或连接成链。
➢ 白地霉菌体蛋白营养价值很高，可供食用和饲 料用，也可用来提取核酸，在废料废水的利用上很 用价值。
6、产黄头孢霉 ( Cephalosporium chrysogen ) 头孢霉素、先锋霉素
3、游动放线菌属 （Actinoplanes）
➢ 一般不形成气生菌丝，孢子球形，有时端生1-40 根鞭毛，能运动。 ➢ 济南游动放线菌生产创新霉素(creatmycin; 1964).
4、诺卡氏菌属 (Norcadia)
➢ 菌落较小，边缘多呈树根 毛状。 ➢ 生产利福霉素、蚊霉素等
5、孢囊链霉菌属 (Streptosporangium)
4、青霉 ( Penicillum )
产黄青霉 ( Penicillum chrysogenum ) 生产青霉素，也可用来生产葡萄
糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏 血酸。
娄地青霉 ( Penicillum roqueforti ) 属不对称青霉组，具有分解油
脂和蛋白质的能力，用于制造干酪； 该菌孢子能将甘油三酯氧化为甲基 酮。
第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
第一节 发酵工业常用微生物 第二节 菌种来源 第三节 菌种选育 第四节 种子扩大培养 第五节 菌种保藏

重要性
菌种扩大培养是微生物实验和工业生 产中的重要环节，它能够提供足够数 量的微生物用于实验或生产，是实现 微生物利用的关键步骤。
菌种扩大培养的基本原理
生长曲线
菌种扩大培养需遵循微生物的生长曲线，即适应期、对数生长期和稳定期。在适应期，微 生物需要适应新的环境；在对数生长期，微生物快速分裂繁殖；在稳定期，微生物繁殖速 度减缓，细胞开始出现分化。
菌种活性检测
定期检测菌种的活性，确保菌种在 培养过程中保持较高的活性。
03
菌种扩大培养的技术与设备
微生物培养技术
微生物培养基
选择适宜的培养基成分，如碳源、氮 源、无机盐等，以支持微生物的生长 和繁殖。
无菌技术
培养条件控制
根据微生物的特性，控制培养温度、 湿度、pH值等条件，以获得最佳生长 效果。
工业生产
在工业生产中，菌种扩大 培养可用于发酵、酶工程 、生物制药等领域，提供 足够数量的目的产物。
农业生产
在农业生产中，菌种扩大 培养可用于菌肥、生物农 药等的生产，提高农作物 的产量和品质。
02
菌种扩大培养的步骤
菌种选择与纯化
菌种选择
选择适合工业化生产的菌种，考 虑其生长速度快、产率高、对环 境的适应性等。
新型发酵技术如连续发酵、分批补料发酵等能够提高菌种的发酵效率和产物得率 ，降低能耗和资源消耗。
新型发酵技术还有助于解决传统发酵工艺中存在的瓶颈问题，如高细胞密度培养 和产物抑制等，为菌种扩大培养提供新的解决方案。
智能化、自动化技术的进一步发展
智能化、自动化技术能够实现菌种扩大培养过程的实时监测 、控制和优化，提高培养过程的稳定性和可重复性。
《菌种扩大培养》PPT课件
目录 Contents

3.同步培养

(1)温度 最适生长温度有利于细菌生长与分裂，不适 宜温度如低温不利于细菌生长与分裂。通过适 宜与不适宜温度的交替处理之后，通过培养可 获得同步细胞。
3.增殖培养


收集到的样品，如含所需菌种较多，可直接 进行分离。 如果样品含所需菌种很少，就要设法增加该 菌的数量，进行增殖(富集)培养。 所谓增殖培养就是给混合菌群提供一些有利 于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条 件以促使所需菌株大量繁殖，从而有利于分 离它们。
增殖培养（培养基）

例如：筛选纤维素酶产生菌时，以纤维素作为唯一碳

挑选出
2、菌种的纯化选优


微生物容易发生变异和染菌。 一般丝状菌的野生菌株多数为异核体。 生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触、吻合后，易 产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然产生突 变株等。 以上会造成细胞内遗传物质的异质化，使遗传性状不 稳定。 如果一个菌种遗传背景复杂，既不稳定，用诱变剂处 理后的变株中，负变率将增加。 特别对诱变史长的菌株，采用强烈诱变剂处理，效果 很差，发酵单位反而变得更低。
③生长圈法




通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌. 工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。 将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物 的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养 物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈。 如：嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合 倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生 长圈的菌落为嘌呤产生菌。 同样，只要是筛选微生物所需营养物的产生菌，都可 采用营养缺陷型作为工具菌通过生长圈法筛选。
基因工 程
生产用菌种

基酸生产中应用较多。控制菌体在不同生 长期的条件。（营养生长与代谢产物积累
时条件不同）
eg: 酶制剂两步法液体深层培养
特点：将菌体生长条件（营养期）与产酶条件（自我繁 殖期）区分开来。 操作：菌种先在营养丰富的培养基上大量繁殖→收 集菌体浓缩物→洗涤→添加诱导物的产酶培养基中 培养
eg: 氨基酸生产的两步法液体深层培养：
二、工业上常用的微生物
微生物在工业上的用途很广，包括化工、
医药、食品、水产、国防、纺织、石油 勘探及石油化工等方面。 微生物的代谢产物多，已超过1300多种， 而用于大规模工业生产的不足100多种； 微生物酶有近千种，而工业上用的不过 40－50种。微生物具有巨大的潜力可挖 掘。 工业上常用菌种举例：
A、固体培养 （曲法培养）
浅盘固体培养 深层固体培养
B、液体培养
浅盘液体培养 液体深层培养：
目前几乎所有的好
气发酵均采用液体深
层发酵法；
C、载体培养：用天然（或人工）多孔材料
（如脲脘泡沫塑料）代替麦麸之类固态基质作 微生物生长的载体，营养成分可严格控制。
D、两步法液体深层培养：在酶制剂和氨
保藏时首先要挑选优良纯种，最好是它们的休眠体 （孢子、芽孢等），其次是要创造一个最有利于休眠的 环境，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等，以达到 降低其代谢活动，延长保存期的目的。
3、菌种保藏的方法：
斜面保藏法、矿物油保藏法、砂土保管保藏法、真空 冷冻干燥法、冷冻法、液态真空干燥法、琼脂穿刺封 口保藏法、曲法保藏、麦粒保藏法、无水硅胶保藏法。
四、防止菌种退化的措施
1、菌种退化：菌种的发酵能力降低、繁
殖能力降低、发酵产品的得率降低
区别于杂菌污染：

谷氨酸菌斜面
赖氨酸菌斜面
与
三角瓶培养
三角瓶培养
菌
种
特
30m3种子罐培养
3m3种子罐培养
性
有 关
300m3发酵罐发酵
30m3种子罐培养
300m3发酵罐发酵
（三）种子扩大培养的阶段
实验室种子制备阶段
生产车间种子制备阶段
实验室种子制备阶段一般包括斜面种子的培养、实验室内 进行的固体或液体培养基的种子扩大培养。 在无菌操作条件下，将试管斜面接种到摇瓶中，经恒温振 荡培养形成大量菌体的过程，称为摇瓶培养。
实例二： 葡萄糖 45g/L，MgSO4·7H2O 0.7 g/L ， 磷酸二氢钾 1.5 g/L ，糖蜜 125g/L ， 玉米浆 250g/L，纯生物素18.8 μg/L， 硫酸亚铁、硫酸锰 各2ppm ，实消， 121℃保温10min，实消前不需调节pH， 实消降温后用液氨调节至pH7.0。
2. 培养条件
接种量 培养温度
0.03~0.5% 32~34℃
种子罐有夹套或盘管或列管等装置。 采用循环冷却水进行降温。
搅拌转速
150~200 r/min
根据种子罐容积和搅拌叶径而定，通常容积大的种子罐 设计搅拌速度会小一些。
通气比
0.15~0.44 vvm
vvm ：1m3液体1min通入空气的体积。
OD 650 值
1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
1
3
5
7
9 11 13
培养时间（小时）
流加液氨培养 添加尿素培养
实例一与实例二的培养结果， 说明了什么问题？
无菌空气
5. 二级种子接入发酵罐的操作

自然选育（自然分离）的一般程序，是把菌种制备 成单孢子悬浮液，经过适当的稀释以后，在固体平板 上进行分离，挑取部分单菌落进行生产能力的测定， 经反复筛选，以确定生产能力更高的菌株代替原来的 菌株。
在过去40年间曾筛选出许多产生新的 有用的次级代谢物的菌种。这些菌种 多半是以经验式的筛选方法获得的。 大多数的抗生素均由放线菌纲产生。
2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。
3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去 表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁 的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样 时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土 样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐 步分批寄回，以便及时分离。
前述介绍放线菌纲为主的分离方法 原理和发展:
选择性分离方法大致可分为五个步骤： 含微生物材料的选择；材料的预处理；所需
菌种的分离；培养；菌落的选择和纯化。
小结：菌种的分离简介
一、菌种的来源
根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂 或菌种保藏部门索取或购买；
从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
菌种筛选主要步骤
调查ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ究及查阅充分的资料 ↓
设计实验方案 ↓确定采集样品的生态环境
采样 ↓确定特定的增殖条件
增殖培养 ↓确定特殊的选择培养基及可能的 ↓定性或半定量快速检出法
平板分离 ↓
原种斜面 ↓确定发酵培养基础条件
筛选
↓ 初筛（1株1瓶）
↓ 复筛（1株3～5瓶）
↓结合初步工艺条件摸索 再复筛（1株3～5瓶）
本节思考题
1、什么是自然选育？自然选育（自然分离） 的一般程序是什么？
2. 3工业微生物菌种的选育
一、微生物菌种的自然选育