红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验

红细胞凝集实验（HA）与红细胞凝集抑制实验（HI）一：实验设备及仪器1.离心机一台（30000转）2.冰箱一台（存放抗原）3.振荡器一台（震荡96孔V型板）4.抗原：禽流感（AI）抗原，从厂家购买5.多孔移液器即排枪一把（量程为5到50微升，做稀释血清用）6.一次性枪头（高压灭菌后使用）7.1%到0.5%体积的鸡红细胞悬液（健康成年鸡的红细胞，但须严格洗五次）8.柠檬酸三钠（配置3.8%抗凝剂使用，制作红细胞悬液采鸡血时加入血液，防止血液凝固）9.吸管一毫升跟十毫升量程10.吸耳球：跟吸管配套使用11.蒸馏水：即无菌双蒸水，清洗96孔V型板12.10毫升离心管，离心红细胞用13.生理盐水：做血清稀释液用，及配置4单位抗原二：实验前准备1.抗原：根据指定免疫类型从生物公司购买稳定的浓缩抗原2.抗凝剂的配制：用分析天平称取3.8克柠檬酸三钠，溶解于100毫升生理盐水中，待溶解完全后即可使用。

3.1%红细胞悬液制作：去菜市场找杀鸡的，去找他们用试管接新鲜鸡血，试管中提前加入抗凝剂，加入的抗凝剂与你所接血液的比例大概为1:2，并迅速混匀，在离心机中以3000转离心五分钟，用吸管吸取上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，不要弄碎了红细胞，再在离心机中3000转离心五分钟，弃去上清，再加生理盐水混匀，如此往复四到五次。

最后一次离心后，去掉上清，管低即为红细胞泥，用吸管吸取0.1毫升红细胞泥，然后加入9.9毫升的生理盐水就是1%的红细胞悬液，现用现配不要长时间存放。

4.被检血清：乡镇送来的血液，离心取上清即为被检验血清，注意做标记，一管一标记，别弄混了。

5.血清稀释液：为灭菌生理盐水，即高压过的生理盐水三：实验步骤第一步：血凝（HA）实验，目的是测定抗原效价，即为了制作后面的四单位抗原1.首先用微量移液器向96孔V型板的每一孔加生理盐水25微升2.用微量移液器吸取待测抗原（就是你买的抗原）的25微升于第一孔中并且挤压六次混合，后吸出25微升至第二孔，依次倍比稀释到第11孔，11孔中弃去25微升。

红细胞凝集试验(HA)与红细胞凝集抑制试验(HI)
红细胞凝集试验(HA)和红细胞凝集抑制试验(HI)是两种常见的检验手段，用于检测血液中是否存在抗体，从而诊断某些疾病或病原体感染。

红细胞凝集试验(HA)
红细胞凝集试验(HA)是一种检测抗体与抗原反应的常规方法。

在这个测试中，医生或实验室技术人员将被测血浆放入红细胞凝集剂中，然后与已知抗原混合，比如病毒、细菌或其他病原体。

如果血浆中含有与已知抗原相应的抗体，那么红细胞就会和抗原结合在一起形成凝集。

如果血浆中没有抗体，红细胞就会分散在凝集剂中。

HA 可以检测出许多病原体的抗体，包括流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和风疹病毒等。

红细胞凝集抑制试验(HI)
红细胞凝集抑制试验(HI)也是一种检测抗体和抗原反应的常规方法。

在这个测试中，被测血液中的抗体与已知抗原结合，形成抗原-抗体复合物。

然后，在复合物中加入未和抗原混合的红细胞，如果血浆中含有抗体，它们会与复合物结合，使得红细胞不会凝集。

如果血液中没有相应的抗体，红细胞就会在复合物中凝集。

与HA相比，HI适用于检测一些病原体，比如肝炎病毒和流感病毒等，但不是所有病原体都适合使用HI进行检测。

红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）是检测抗体和抗原反应的两种常见方法。

这两种技术可用于诊断许多疾病和病原体感染，但需要在临床实验室或医疗机构进行，由专业人员执行。

尽管这些测试非常有用和重要，但仍需要与其他诊断工具和检查方法相结合，以确保诊断的准确性和病人的治疗。

红细胞凝集试验及红细胞凝集抑制试验1．红细胞凝集试验 采用50孔板或试管法按表1，若采用96孔微量板法按表2进行，用生理盐水将待检抗原按术式稀释成不同倍数，加入1%鸡红细胞悬液。

将50孔板或试管前后左右摇匀；将96孔微量板在振荡器上摇匀，置于20～30℃，20～40分钟后（微量板法时间短, 15～30分钟）判定结果，使50%红细胞凝集的最高稀释度，作为判定终点。

表1 50孔板或试管法测定凝集价 单位：ml孔或管号对照1 2 3 4 5 6 7 8…… 血凝素稀释倍数 10 20 40 80 160 320 640 1280…… 0.5生理盐水0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5……} } } } } } } } 弃0.5待检抗原 0.1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1%鸡红细胞悬液0.50.50.50.50.50.50.50.50.5表2 96孔微量板法测定凝集价 单位：μl孔号对照1 2 3 4 5 6 7 8...... 稀释倍数 2 4 8 16 32 64 128 256 (25)生理盐水25 25 25 25 25 25 25 25…… } } } } } } } } 弃25 待检抗原 25 25 25 25 25 25 25 25 1%鸡红细胞悬液2525252525252525252．红细胞凝集抑制试验 2.1血凝素凝集价测定 50孔板或试管法按表3，若采用96孔微量板法按表4进行。

表3 50孔板或试管法测定凝集价 单位：ml孔或管号对照1 234567 8……血凝素稀释倍数5 10 20 40 80 160 320 640……0.25生理盐水0.4 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25……}} } } } } } } 弃0.25血凝素 0.1 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.251%鸡红细胞悬液 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.250.25 0.25 生理盐水0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.250.25 0.25表4 96孔微量板法测定凝集价 单位：μl孔号对照1 2 3 4 5 6 7 8…… 稀释倍数 2 4 8 16 32 64 128 256……25生理盐水25 25 25 25 25 25 25 25……血凝素 25 25 25 25 25 25 25 25 1%鸡红细胞悬液 25 25 25 25 25 25 25 25 25 生理盐水252525252525 2525252.2.1 4单位抗原工作液配制 选用上述2.1项抗原进行。

血凝和血凝抑制试验一些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(Hemagglutination，HA)。

正粘病毒和副粘病毒是最主要的红细胞凝集性病毒；其他病毒包括披膜病毒、细小病毒、某些肠道病毒和腺病毒等也有凝集红细胞的作用，但常要求比较严格的反应条件，例如一定的pH范围等。

各种病毒的血凝素性质不尽相同。

某些病毒可在很广的pH条件下呈现血凝作用，某些病毒则只在很窄的pH范围内才能凝集红细胞。

某些病毒的血凝作用具有温度依赖性，也就是只在一定温度范围内才出现血凝现象；但另一些病毒却可在4℃、室温和37℃呈现同样的血凝作用。

病毒凝集的红细胞种类，也随病毒种类而不同，例如某些病毒主要对人和禽的红细胞呈现凝集作用，另一些病毒则可凝集豚鼠或大鼠等的红细胞。

当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以封闭病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触，这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制(HemagglutinationInhibition，HI)，也称为血凝抑制反应。

血凝的原理因病毒而有所不同，如痘病毒对鸡红细胞发生凝集作用并非是病毒的本身，而是痘病毒的产物类脂蛋白的作用。

而流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。

病毒的血凝现象大致可以分为可逆转型、不可逆转性、凝集条件严格型三类。

血凝和血凝抑制试验有常量法和微量法两种，目前国内外广泛使用的都是微量法，各要素用量均为25ul，微量法省时、省料、高效。

以下简要介绍本次试验的主要内容，详细内容参见各国标。

各实验室所采用的HA和HI试验程序不同，下面的例子是应用V型微量板进行的试验，两种方法反应总体积都为75ul，本试验所用试剂为如下：1.生理盐水：用蒸馏水或去离子水配制成0.85％NaCl溶液，高压灭菌备用。

2.红细胞悬液：采鸡血液，加于倍量的红细胞保存液-阿氏液中，置4℃普通冰箱保存，可用一个月。

鸡新城疫病毒的红细胞凝集试验和凝集抑制试验操作方法摘要：NDV是引起新城疫的病原体，新城疫又叫亚洲鸡瘟。

本病具有高度的传染性，发病急，致死率高。

对养禽业发展构成了严重威胁，是世界养禽业最重要的疾病之一。

为有效地控制新城疫病毒，对21日龄的1000雏鸡注射鸡新城疫灭活苗进行免疫，并对其抗体效价进行监测。

红细胞凝集试验和凝集抑制试验是监测鸡新城疫免疫状态的一种简便，快捷，经济的血清学方法。

次试验可作为监测鸡群免疫效果，疫苗使用效果和制定合理免疫程序的依据。

关键词：鸡新城疫抗体效价监测试验为掌握病毒的红细胞凝集试验和凝集抑制试验的操作方法，对21日龄的1000只雏鸡注射了鸡新城疫灭活苗后9天，进行随机抽样检查。

作HI抗体滴度的测定，操作方法如：1.原理:NDV一个很重要的生物学特性就是能吸附于鸡，火鸡，鸭，鹅及某些哺乳动物（人，豚鼠）的红细胞表面，并引起红细胞凝集，而这种血凝现象能被NDV的抗体的抑制。

2.器材：2---5mL注射器、离心管、离心机、试管架、生理盐水、鸡新城疫疫苗弱毒Ⅳ系、1％鸡红细胞悬液。

3.操作步骤：①红细胞悬液的制作（0.7—1﹪）浓度低反应时间越长。

阿氏液：血液=1：1 肝素：血液=1：10取2mL阿氏液加2mL成年鸡血液于离心管中摇匀，放入离心机1500rPm,5min.吸取上清液及上层白细胞后加适量生理盐水混匀离心，重复三次，用生理盐水配成1﹪浓度。

②HA孔号(uL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12生理盐水50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50}↘}↘}↘}↘}↘}↘}↘}↘}↘}↘}↘50鸡新城疫病毒50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50红细胞50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50振荡器上振荡1—2min. 18℃--22℃作用15min后观察结果。

结果# # # # # # # + ————结果表示病毒液的HA效价为27 ，HI时病毒Ag液50uL内须含4个凝集单位，测病毒Ag液作32倍稀释。

红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验流感病毒表面的血凝素（HA）蛋白，含有识别和结合宿主细胞表面受体的结构，能使一些特定的红细胞发生凝集现象。

当红细胞和病毒按适当的比例混合后，由于病毒的作用使红细胞发生凝集，此为凝集现象。

含有特异的抗流感病毒HA蛋白的抗血清，能抑制红细胞凝集现象的出现，即抗体与病毒结合后，可以使血凝素不能吸附于红细胞表面的受体上，此为红细胞凝集抑制（HAI）。

微量红细胞凝集抑制试验是目前最常用的一种鉴定流感病毒型/亚型及分析流感病毒HA抗原性变异的试验方法，也可以用于对一般人群抗体水平的检测和疫苗效果的评价等方面。

用于HAI试验的标准参照血清必须及时更新，用于鉴定流感病毒型/亚型应包括当年的国际疫苗株或国内流行代表株的抗血清，可以用羊、鸡、雪貂、兔等实验动物的抗血清；用于抗原分析的抗血清建议包括同一型别和亚型不同毒株免疫的标准参考抗血清，由于用雪貂制备的抗流感病毒血清特异性高，易将不同毒株间抗原性差异显示出来，因此常用免疫雪貂的抗血清进行抗原分析。

HAI试验中所用的血清必须经特殊处理以去除非特异性抑制素及非特异性凝集素。

（一）生物安全要求所有有关试验操作都应在相应生物安全级别的实验室中进行，必须遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程和废弃物管理规定，做好个人防护要求。

季节性流感病毒病毒或经完全灭活的高致病性禽流感病毒操作可以在BSL-2实验室里进行，高致病性禽流感病毒的操作在BSL-3级实验室中进行。

（二）实验所用试剂1．标准参考抗原：以国际疫苗株和国内流行株作为标准参考抗原，新分离的毒株作为待测抗原。

2.标准参考抗血清：以国际疫苗株和国内流行株制备的抗血清作为标准参考血清。

血清要经RDE处理。

（三）其他试剂/材料/仪器1.红细胞悬液2.PH7.4的PBS缓冲液3.RDE（日本生研）4.水浴箱（37U,56C）5.台式离心机6.多道可调加样器、单道可调加样器7.离心管8.96孔微量血凝板（使用豚鼠和人红细胞进行实验须用“U”底板，使用火鸡红细胞进行实验用“V”底板）9.200L、1000LTIP头、水槽表1.流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较红细胞火鸡豚鼠人“0”型血终浓度0.50.50.5孔底部形状V型U型U型孵育时间25-30min45-60min45-60min红细胞沉积形状细胞沉积成点状，倾细胞沉积细胞沉积成斜时细胞向下流成泪成环状环状滴状（四）流感病毒鉴定和抗原分析步骤1.实验前准备（1）标准参考抗血清的处理1）去除血清中的非特异性抑制素a）所谓抑制素是指各种动物血清、体液、组织液中所含与红细胞表面受体相似的物质，它们能与红细胞受体一起竞争性地被病毒表面血凝素所识别和结合。

红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）用疫苗按一定免疫程序进行免疫接种是控制鸡病流行的主要途径之一，这种观点已被广大养殖户接受并引起足够重视。

但鸡群免疫抗体的产生及维持时间受到鸡群免疫应答能力、所用疫苗种类、免疫方法、免疫次数、疫病流行状况等方面的影响，良好的免疫接种不等于鸡群能够产生良好的保护力。

因而通过对鸡群进行抗体监测，及时检查鸡群的免疫状态、疫苗使用效果，为制定合理的免疫程序提供依据就显得非常重要。

通过对广大养殖户的大量调查发现，由于缺乏有效的监测手段，养殖户普遍存在盲目免疫的现象。

因此，建立合理的抗体监测制度，开展免疫抗体监测工作，已经成为我们当前养鸡生产中急需开展的一项重要工作。

下面将抗体监测所需设备及监测过程向大家做一说明。

一、实验用设备：1、离心机1台*（3000转离心红细胞）2、冰箱1台*（存放抗原）3、振荡器1台*（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规厂家进。

5、96孔V型板稀释血清清洗后可重复使用6、八道移液器1把（5-50微升稀释血清）7、吸头和八道移液器配套使用，清洗后重复使用）8、积液槽配制4个单位抗原及盛放生理盐水加样用9、一次性采血管采血用10、2毫升注射器采血用11、红细胞非免疫鸡心脏采血或免疫鸡也可，但需离心5次后使用。

12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂用13、重铬酸钾配制清洁液用14、硫酸配制清洁液用15、吸管1毫升、10毫升16、吸耳球和吸管配套使用17、针头9*13（采雏鸡）、9*25（采大鸡）18、蒸馏水当地买。

清洗96孔V型板、吸头用19、10毫升离心管离心红细胞用（塑料制）20、生理盐水做血清稀释液用、配制4单位抗原二、实验前的准备：1.抗原：从指定厂家购买稳定浓缩抗原。

2.抗凝剂的配制：用天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。

3.1％红细胞悬液：由鸡心脏或翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内（按抗凝剂：全血＝1：2的比例），迅速混匀。

红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）用疫苗按一定免疫程序进行免疫接种是控制鸡病流行的主要途径之一，这种观点已被广大养殖户接受并引起足够重视。

但鸡群免疫抗体的产生与维持时间受到鸡群免疫应答能力、所用疫苗种类、免疫方法、免疫次数、疫病流行状况等方面的影响，良好的免疫接种不等于鸡群能够产生良好的保护力。

因而通过对鸡群进行抗体监测，与时检查鸡群的免疫状态、疫苗使用效果，为制定合理的免疫程序提供依据就显得非常重要。

通过对广大养殖户的大量调查发现，由于缺乏有效的监测手段，养殖户普遍存在盲目免疫的现象。

因此，建立合理的抗体监测制度，开展免疫抗体监测工作，已经成为我们当前养鸡生产中急需开展的一项重要工作。

下面将抗体监测所需设备与监测过程向大家做一说明。

一、实验用设备：1、离心机 1台*（3000转离心红细胞）2、冰箱 1台*（存放抗原）3、振荡器 1台*（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规厂家进。

5、96孔V型板稀释血清清洗后可重复使用6、八道移液器 1把（5-50微升稀释血清）7、吸头和八道移液器配套使用，清洗后重复使用）8、积液槽配制4个单位抗原与盛放生理盐水加样用9、一次性采血管采血用10、2毫升注射器采血用11、红细胞非免疫鸡心脏采血或免疫鸡也可，但需离心5次后使用。

12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂用13、重铬酸钾配制清洁液用14、硫酸配制清洁液用15、吸管 1毫升、10毫升16、吸耳球和吸管配套使用17、针头 9*13（采雏鸡）、9*25（采大鸡）18、蒸馏水当地买。

清洗96孔V型板、吸头用19、10毫升离心管离心红细胞用（塑料制）20、生理盐水做血清稀释液用、配制4单位抗原二、实验前的准备：1.抗原：从指定厂家购买稳定浓缩抗原。

2.抗凝剂的配制：用天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。

3.1％红细胞悬液：由鸡心脏或翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内（按抗凝剂：全血＝1：2的比例），迅速混匀。

红细胞凝集试验血球凝集(HA)试验: 有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验血球凝集抑制(HI)试验:病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验阿氏液（Alsever）：即红细胞保养液指红细胞凝集的现象。

由病毒、细胞凝集素和抗体而引起的红细胞凝集。

（1）由病毒而引起的凝集：G．H．Hirst（1941）发现流感病毒能使鸡的红细胞发生凝集，其后又发现其它各种病毒也能引起同样的红细胞凝集反应。

即红细胞表面存在着对各种病毒的受体，病毒与受体结合，以红细胞为桥梁的结果而引起凝集。

利用此反应可以进行病毒的定性和定量。

另外，如果存在抗病毒的抗体时，则由病毒引起的凝集作用将被抑制，所以可用于抗病毒抗体的检出。

（2）由抗体引起的凝集：（a）如果存在对红细胞表面决定基的抗体，则红细胞亦将凝集。

可用于测定对抗红细胞的抗体的效价或鉴定人的血型。

（b）在红细胞表面，如果人为地使之吸附或结合特定的抗原物质，则与该抗原相对应的抗体将引起红细胞凝集（被动凝集反应或间接凝集反应，psssive he-magglntination）。

血凝及血凝抑制试验有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。

通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。

[目的要求]掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。

[材料与试剂]1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，50 uL定量移液器，滴头，微型振荡器。

2. 生理盐水，0.5%鸡红细胞悬液，新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。