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树突状细胞体外分离扩增技术研究进展彭卫斌１综述；沙卫红２＋审校摘要：树突状细胞（ＤＣ）是目前所知的体内功能最强的专职抗原呈递细胞，是机体免疫反应的始动者，被称为机体防御病原微生物侵袭的重要“哨兵”，在移植排斥、抗肿瘤、抗病毒感染和自身免疫疾病中发挥着重要作用。
获得大量高纯度且表型、功能典型的ＤＣ是上述基础和临床研究的前提。
从直接分离提取到添加细胞因子诱导扩增ＤＣ研究获得很大进展，成为当今免疫学及肿瘤治疗学等相关学科的研究热点。
本文对ＤＣ体外分离、纯化及扩增方法作一简要综述。
关键词：树突状细胞；分离；扩增；细胞培养中图分类号：Ｑ８１３文献标识码：Ａ文章编号：１００４－２３６９１２００９）１１－０６７９－０４ＳｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏＰＥＮＧＷｅｉ－ｂｉｎ。
ＳＨＡＷｅｉ—ｈｏｎｇ”．１ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，ＧｕａｎｇｚｈｏｕＦｉｒｓｔＰｅｏｐｌｅ，ｓｔｔｏｓｐｉｔａｌ，ＡｆｆｉｌｉａｔｅｄｔｏＧｕａｎｇｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕａｎ磐ｚｈｏｕ５１０１８０．Ｃｈｉｎａ；２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１００８０，Ｃｈｉｎａ；‘Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｈ－ｓｈａ＠１６３．ｅｏｍＡｂｓｔｒａｃｔ：Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ（ＤＣ）ｗｈｉｃｈｐｌａｙｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎａｌｌｏｇｒａｆｔｒｅｊｅｃｔｉｏｎ，ａｎｔｉ—ｔｕｍｏｒ，ａｎｔｉ—ｖｉｒａｌｉｎ－ｆｅｅｔｉｏｎｓａｎｄａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｄｉｓｅａｓｅｓｉｓｋｎｏｗｎａｓｔｈｅｍｏｓｔｐｏｗｅｒｆｕｌａｎｄｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｃｅｌｌｉｎｖｉ—ＶＯ．ＨｏｗｔｏｃｕｌｔｉｖａｔｅａｎｄｐｕｒｉｆｙＤＣｗｉｔｈｈｉ。
DC在机体免疫监视机制中起着哨兵作用，它能对肿瘤抗原进行识别、处理和提呈，从而启动机体对肿瘤的特异性免疫应答。
目前制备的以DC为基础的肿瘤疫苗就是利用DC这一特性，因此有效地在体外扩增培养DC是制备DC肿瘤疫苗的重要前提。
以下我们将就DC前体细胞选择以及DC培养所需细胞因子进行介绍。
一、DC前体细胞的选择1.直接分离骨髓、脐带血或外周血中DC：DC在组织中含量甚微，在血液中仅占单个核细胞总数的0.5％～1.0％，难以分离、纯化，且呈高度分化状，体外不易长期培养，更难建系。
因此该分离方法目前仅用于DC免疫活性，表面标志及DC亚型功能差异的研究；2.从人骨髓或脐带血的CD34+造血干细胞诱导DC：我们通常所指的DC均为髓系DC，其来源于人CD34+造血干细胞。
CD34+造血干细胞是具有多向分化潜能和大量增生能力的细胞，其可从人骨髓或脐带血中分离，在体外通过联合GM—CSF、SCF、IL—6、IL—3等多种细胞因子培养，诱导扩增生成大量的DC，但其缺点在于取材不方便，不利于广泛使用；3.分离外周血中CDl4+单核细胞：此方法为目前最常选用的分离获取DC前体细胞的途径。
通过淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，利用免疫磁珠分选出CDl4+单核细胞，采用GM—CSF与IL—4(或IL—13，其与IL—4具有相似性质)联合培养体系，经7～10天即可诱导出大量的典型的DC；4.由高度纯化的中性粒细胞前体细胞诱导DC：利用高度纯化乳铁蛋白阳性的中性粒细胞前体细胞，在培养体系中加入6MCSF，IL—4和TNF—d，可得到DC样形态及具有DC相关表面分子的细胞。
从功能上比较，这些中性粒细胞诱生的DC特征与经典DC的群体相似；5.从人外周血或脐血CD34+前体细胞诱导DC：由于CD34+造血干细胞含量非常少，因此应用受到限制。
为克服这一难点，有人即采取分离外周血或脐血中含量较高的CD34+前体细胞联合细胞因子大量培养扩增，诱导生成DC；6.由白血病细胞诱导分化生成DC：目前的研究发现，可将白血病细胞诱导分化为功能成熟的DC，且这些白血病细胞来源的DC可提供大量的白血病相关抗原并进行肿瘤抗原呈递，而无需体外预激过程，从而减少了污染的机会，这种体外扩增的方法在临床治疗应用上极具吸引力。
第１０卷 第２期２０１９年３月Ｖｏｌ． １０ Ｎｏ． ２Ｍａｒ． ２０１９器官移植Ｏｒｇａｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ【摘要】 树突状细胞（DC ）虽然数量少，但其在机体免疫系统中发挥的作用却逐渐受到认可和重视。
研究表明DC 由不同的亚群组成，具有不同的处理抗原的能力和激活不同效应淋巴细胞等能力。
其中，调节性树突状细胞（DCreg ）是一群具有负向免疫调控功能的DC 亚群。
DCreg 能够通过不同的机制诱导机体免疫耐受，在器官移植、自身免疫性疾病、肿瘤等不同领域均发挥着重要作用。
但DC 在体内分布广泛，且含量少，生理情况下半衰期短，建立成熟的DC 培养技术，特别是如何获取足量的DCreg ，是目前免疫学界研究的重要领域。
本文就DC 的分类和DCreg 体外获取方式进行综述。
【关键词】 树突状细胞；调节性树突状细胞；细胞因子；间充质干细胞；免疫抑制剂；凋亡；基因工程技术【中图分类号】R392，R789 【文献标识码】A 【文章编号】1674-7445（2019）02-0014-04·综述·众所周知，树突状细胞（dendritic cell ，DC ）最主要的功能是抗原提呈，它也被认为是功能最强的专职抗原提呈细胞（antigen presenting cell ，APC ）。
几十年来，在学者的不断探索中，不同的DC 亚群及其免疫功能被认识。
DC 不但能提呈抗原、激活免疫反应，更重要的是其还能诱导自身免疫耐受。
正因如此，DC 开始作为免疫治疗的一种新手段，在感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等领域崭露头角。
近年来的研究表明，不同来源、不同部位、不同发育阶段的DC 往往具备不同的细胞表型，分泌不同的细胞因子，发挥不同的免疫作用，成为不同的DC 亚群。
其中，调节性树突状细胞（regulatory DC ，DCreg ）则是一群具有负向免疫调控功能的亚群，它能够通过不同的机制诱导自身免疫耐受，成为免疫学界关注的对象。
树突状细胞研究进展摘要：树突状细胞（dendritic cells ,DC）是目前已知的功能最强的专职性抗原呈递细胞（APC），1973年Steiman和Cohn首次从脾脏中分离出一类与粒细胞、巨噬细胞、和淋巴细胞形态和功能都不相同的白细胞，因其细胞膜向外伸出，形成与神经细胞轴突相似的膜性树突状突起，故命名为树突状细胞。
DC膜表面高度表达MHC的I类和MHCⅡ类分子以及其他多种与免疫应答有关的细胞因子，DC能有效摄取、加工、提呈抗原，并能显著刺激初始型T淋巴细胞的增殖分化和成熟，并在免疫应答中起着重要作用，本文就DC的免疫应答研究进展作一综述。
关键词：树突状细胞结构功能免疫激活免疫耐受近年来随着免疫学与分子生物学的最新进展，人们认识到树突状细胞是机体抗原提呈细胞中最主要的和最有效的成分，在调控机体细胞免疫中起重要的作用。
树突状细胞是开启免疫反应的始动细胞，也是机体免疫应答反应过程中的关键环节。
因此对DC的生物学特征研究越来越受到人们的关注。
1 DC的生物学特征1.1 DC的来源在研究中人们发现DC的来源主要起源于两种途径：1）骨髓来源的DC，大多数DC 来源于骨髓，由骨髓CD34+细胞分化而来，数量较少仅占外周血单核细胞的1％以下。
骨髓CD34+具有双潜能，由M-CSF可诱生为巨噬细胞，而由Ⅵ-CSF／TNF-α可诱生为DC。
骨髓来源的DC 分布广泛，外周血中存在有骨髓来源的DC前体细胞，DC前体细胞进入外周血后进一步分化成熟。
2）淋巴组织来源的DC，是胸腺中分离的前体细胞发育而来，表达低水平的CD34，无其他T细胞标志，主要分布于胸腺髓质T细胞居留区，这类细胞可能与自身及外来抗原的免疫耐受有关。
1.2 DC的形态特征及表面标志不同发育阶段的DC具有不同的形态特征，谢遵江等在体外培养小鼠骨髓树突状细胞的观察研究中，在无菌条件下提取小鼠骨髓细胞进行分化增殖，在光镜下观察。
培养7天后可见，细胞体积增大，周边刺突十分明显，突起较粗大，分支较明显，细胞形态似星形或梭形，细胞核明显，细胞聚集生长。
体外活性试验相关知识以健康人外周血单核细胞为前体细胞，体外诱导其为树突状细胞（DC ），分别负载多肽抗原，产生特异性细胞毒性T 淋巴细胞（CTL ），以探讨其对靶细胞的杀伤作用。
抗原肽诱导CTL 制备：① 外周血单核细胞（PBMC ）的分离：分别选取（经BCG 免疫，PPD 阳性）HLA-A2.1+、HLA-A3+ 人抗凝外周全血，通过淋巴细胞分离液分离获得PBMC 。
② 树突状细胞的诱导：将PBMC 在24孔板中贴壁培养，分离贴壁的单核细胞，每孔加含FBS 、GM-CSF 和IL-4的1640培养基，于37℃、5%CO2孵箱中，培养至第5天加LPS 诱导成熟，用相差显微镜观察DC 诱导培养过程中的细胞形态学变化。
通过流式细胞术检测CD1a 、CD83、CD80、HLA-DR 的表达。
③ 细胞毒T 淋巴细胞（CTL ）的体外诱导：DC 诱导至第5天，加入待测肽，第7天收获DC 。
于24孔板中加入用免疫磁珠分选的CD8+ T 淋巴细胞作为反应细胞，DC 作为刺激细胞，第2天加IL-2，置37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。
用肽负载的DC 按前述方法再重复刺激3次。
收获CTL 用于检测。
细胞毒性分析：④细胞毒活性检测：CTL杀伤实验用MTT法和4小时51Cr释放法。
以抗原肽诱导CTL为效应细胞(E)，负载抗原肽的T2细胞作为靶细胞(T)。
MTT法按效靶比20:1加入96孔板中，靶细胞每孔1×103个，设单独靶细胞孔和单独CTL孔，每组3复孔，每孔200 μL。
37 ℃、5 %CO2孵育48 h后,加入MTT 0.2 mg/孔，继续培养4-6 h，去上清，加入DMSO 100 μL/孔，显色，酶标仪于波长570 nm下读数。
按以下公式计算杀伤率。
同时以不相关肽诱导的CTL作为阴性对照。
杀伤率=[1－（试验孔A值-效应细胞孔A值）/靶细胞孔A值]×100% 4h51Cr释放法MTT 实验中与阴性对照比较杀伤作用存在显著性差异的候选肽使用更精确的4h51Cr 释放法来验证。
树突状细胞生物学特征及功能的研究进展杨丽红(天津市眼科医院,天津300020)关键词:树突状细胞;成熟化中图分类号:R338.1+2 文献标识码:A 文章编号:1008-0104(2010)05-0099-02 树突状细胞(dendr itic cell,DC)广泛分布于机体所有的组织和器官中,体内的DC主要有两种来源,即髓源性和血源性。
髓源性DC是指由骨髓和脐血中CD34+造血祖细胞生成的D C;而从外周血单个核细胞来源的DC属于血源性的。
血源性DC在成熟的各个阶段几乎不吞噬和吞饮抗原,并且几乎不表达髓系抗原,故以下的讨论主要围绕髓源性DC展开。
随着近年来研究的深入,人们逐渐认识到DC作为体内唯一能活化初始T细胞的抗原递呈细胞,不仅能激活免疫反应还参与机体的外周耐受,在机体免疫中起着双向调节作用,是目前已知功能最强大的抗原递呈细胞。
在自身免疫、超敏反应、肿瘤免疫和移植免疫等生理病理过程中发挥着重要的免疫介导作用。
为此,本文就树突状细胞生物学特征及功能的研究进展作一综述。
1 D C的成熟化及表面标志鉴于DC前体细胞在不同分化阶段,不同的微环境中,发挥着不同的生物学功能。
Bancher eau[1]将DC的发育分为4个阶段:(1)骨髓中的祖细胞;(2)与病原体相互识别前在血液、淋巴管和淋巴组织中巡逻的DC前体,它们可分泌大量的细胞因子使炎症局限化;(3)驻留组织的不成熟DC,它们拥有强大的吞噬功能便于抗原的摄取;(4)成熟DC,出现于次级淋巴器官中,高表达协同刺激分子进行抗原的提呈。
未成熟D C具有较强的内吞能力,一般认为,D C成熟过程中其吞噬能力会逐渐减弱,伴有明显的形态学改变,如细胞表面伸出许多细而长形态不规则的树枝样突起,胞内囊泡结构减少,细胞器成分增加,而其抗原提呈能力逐渐增强。
同时DC 表面表达分子发生改变。
现一般认为它可作为DC(尤其是L Cs)较特异性的表面标志[2]。
Cov entr y[3]等认为CD1a还可以表达于胸腺细胞,是鉴定人外周血与骨髓中DC的最好标记。
树突状细胞的培养及成熟的鉴定李望，张升宁，冉江华，苏晓三，李来邦，陈奕明（昆明市第一人民医院肝胆胰一科，云南昆明６５０１０１）［摘要］目的探讨人体外周血树突状细胞在体外培养诱导其成熟的方法，通过得到成熟的细胞培养技术，对树突状细胞功能的研究奠定实验基础．方法通过Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ梯度离心法得到单个核细胞，再诱导使其分化、扩增、纯化形成稳定的树突状细胞，通过树突状细胞自身形态、特异性表型，抗原摄取能力，鉴别培养的细胞，从而得到具有典型特征的树突状细胞．结果树突状细胞培养第７天，加入ＬＰＳ后，倒置显微镜及扫描电镜下观察，树突状细胞成熟中，细胞胞质增大，细胞膜表面能形成大量树突状突起，表面标志物ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１ｃ、ＨＬＡ－ＤＲ的表达增高（Ｐ＜０．０５），共聚焦显微镜下，成熟的树突状细胞对抗原的吞噬能力减弱．结论Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ梯度离心法能够得到稳定的树突状细胞体外培养体系．［关键词］Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ梯度离心法；树突状细胞；表型；抗原；吞噬［中图分类号］Ｒ３９２．１２［文献标识码］Ａ［文章编号］２０９５－６１０Ｘ（２０１５）０３－００３４－０４ＴｈｅＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄＩｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＭａｔｕｒｅＤｅｎｄｒｉｔｉｃＣｅｌｌｓＬＩＷａｎｇ，ＺＨＡＮＧＳｈｅｎｇ－ｎｉｎｇ，ＲＡＮＪｉａｎｇ－ｈｕａ，ＳＵＸｉａｏ－ｓａｎ，ＬＩＬａｉ－ｂａｎｇ，ＣＨＥＮＹｉ－ｍｉｎｇ（Dept.of Hepato-biliary-pancreatic Surgery ，The 1st People ’s Hospital of Kunming ，Kunming Yunnan６５０１０１，China ）［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｉｎｄｕｃｉｎｇａｎｄｃｕｌｔｕｒｉｎｇｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｉｎｖｉｔｒｏ，ｉｎｔｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｐｒｅｐａｒｉｎｇｔｈｅｆｕｒｔｈｅｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｆｏｒｅｘｐｌｏｒｉｎｇｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ（ＤＣｓ）．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅＣＤ１４＋ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ（ＰＢＭＣ）ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．ＴｈｅｓｔａｂｌｅｍａｔｕｒｅＤＣｓｗｅｒｅｈａｒｖｅｓｔｅｄｂｙｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＴｈｅｔｙｐｉｃａｌＤＣｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙａｎａｌｙｚｉｎｇｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｐｈｅｎｏｔｙｐｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆＤＣｓｗａｓｉｒｒｅｇｕｌａｒ，ａｎｄｐｌｅｎｔｙｏｆｒａｄｉａｌｄｅｎｄｒｉｔｅｓｆｒｏｍｃｅｌｌｂｏｄｉｅｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｔｈｅｉｎｖｅｒｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅａｎｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＣＤ８３，ＣＤ８０，ＣＤ８６ａｎｄＨＬＲ－ＤＲｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｉｎｇａｓｔｈｅｍａｔｕｒａｔｉｎｇｏｆＤＣｓａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒｔｅｓｔｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓ（Ｐ＜０．０５）．ＴｈｅａｎｔｉｇｅｎｅｎｇｕｌｆｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｉｍＤＣｓｗａｓｅｎｈａｎｃｅｄ，ｗｈｉｌｅｉｔｗａｓｗｅａｋｅｎｅｄｉｎｍＤＣｓ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｉｍＤＣｓｃｏｕｌｄｂｅｉｎｄｕｃｅｄｔｏＤＣｓｂｙＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ；Ｄｅｎｒｄｉｔｉｃｃｅｌｌｓ；Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ；Ａｎｔｉｇｅｎ；ＰｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓJournal of Kunming Medical UniversityCN 53-1221/R昆明医科大学学报2015，36（3）：34～37［基金项目］云南省科技厅－昆明医科大学联合专项基金资助项目（２０１１ＦＺ２９９）［作者简介］李望（１９８６～），男，湖南株洲市人，医学硕士，住院医师，主要从事肝胆外科临床及研究工作．［通讯作者］张升宁．Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｓｎ８１３＠１６３．ｃｏｍ树突状细胞是机体内发现的具有最强专职抗原提呈细胞，因其在成熟过程中能伸出大量树突样突起而得名，人体树突状细胞起源于造血干细胞，外周血树突状细胞在数量上不足外周血单个核细胞的１％，它能摄取、加工处理抗原，并能将处理后的抗原递呈给Ｔ淋巴细胞．未成熟的树突状细胞具有较强的迁移能力及摄取、加工抗原能力，成熟的树突状细胞能有效激活初始型Ｔ淋巴细胞，并能启动、调控并维持免疫应答［１］．１材料和方法１．１材料外周血细胞由健康、成人自愿捐献，淋巴细胞分离液（ｈｙｃｌｏｎｅＵ．Ｓ．Ａ），ＲＰＭＩ－１６４０培养液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ），重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＲｈＧＭ－ＣＳＦ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ），重组人白介素４（ｒｈＩＬ－４）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ），脂多糖（ＬＰＳ）（ｓｉｇｍａＵ．Ｓ．Ａ），胎牛血清（ｈｙｃｌｏｎｅＵ．Ｓ．Ａ），ＰＥ－ＣＤ８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ），ＦＩＴＣ－ＣＤ８６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ），ＰＥ－ＣＤ１１ｃ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ），ＰＥ－５．５ＨＬＡ－ＤＲ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ），ＯＬＹＭＰＵＳ倒置显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｊａｐａｎ），微型扫描电镜（日立，ＴＭ１０００），流式细胞仪（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ），激光共聚焦显微镜（ＬｅｉｃａＳＰ５０）．１．２实验方法１．２．１树突状细胞培养抽取空腹、健康成人外周血细胞，肝素抗凝，将细胞生理盐水稀释，加入淋巴细胞分离液离心分层，取第二层单个核层细胞层，３７℃５％ＣＯ２培养箱中孵育２．５ｈ，获取贴壁的单个核细胞层，经含ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ），ｒｈＩＬ－４（５０ｎｇ／ｍＬ）的用ＲＰＭＩ－１６４０完全培养基孵育１ｄ后，即得到未成熟的树突状细胞，诱导树突状细胞第６天用脂多糖（ＬＰＳ）刺激产生成熟的树突状细胞．１．２．２树突状细胞形态学观察分别于树突状细胞培养第１天，第６天，第７天，倒置显微镜下观察树突状细胞形态的改变．收集培养７ｄ的树突状细胞，经多聚赖氨酸沉淀于盖玻片上，用３％的戊二醛和１％饿酸固定，经乙醇梯度脱水，扫描电镜下观察树突状细胞形态．１．２．３细胞表型检测在２．０×１０５／ｍＬ的树突状细胞悬液中，分别加入ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１ｃ、ＨＬＡ－ＤＲ单抗，２ｈ后，经ＰＢＳ离心洗涤，加入抗原，４５ｍｉｎ后流式细胞检测．１．２．４分别于树突状细胞培养第６天及第７天，加入ＦＩＴＣ－ＯＶＡ抗原，３７℃５％ＣＯ２培养箱中继续孵育１ｄ，准备ＰＥ－ＣＤ１１ｃ荧光素标记的单克隆抗体于２００μＬ的ＰＢＳ，至期望浓度．单抗放置于冰上．低温保存，共聚焦显微镜下观察树突状细胞吞噬抗原能力．１．３统计学处理实验数据以均值±标准差（x±s）表示，数据处理应用ＳＰＳＳ软件包进行．流式细胞组间差异比较采用配对ｔ检验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义．２结果２．１倒置显微镜下观察树突状细胞的形态从倒置显微镜下可以看出，树突状细胞在培养第２天细胞呈均匀分布，形态单一，散在排列．晃动培养板可见随板晃动的细胞．在散在排列的细胞中，可分辨出呈团簇状排列的细胞团块．细胞培养第６天，加入ＬＰＳ后，可见细胞较大，胞质丰富，悬浮的细胞，细胞膜表面分布许多分枝状突起，见图１．ＡＢＣＤ图１树突状细胞经分离、诱导、培养后不同时期树突状细胞的生长变化Ｆｉｇ．１ＴｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｅｒｉｏｄｏｆＤＣｓａｆｔｅｒｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎＡ：０ｄ（２００×）；Ｂ：２ｄ（４００ｘ）；Ｃ：６ｄ（４００×）；Ｄ：７ｄ（４００×）．３５第３期李望，等．树突状细胞的培养及成熟的鉴定表１树突状细胞成熟前后细胞表型阳性细胞数改变［％，（x ±ｓ）］Ｔａｂ．１ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｈｅｎｏｔｙｐｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＤＣｓａｆｔｅｒａｎｄｂｅｆｏｒｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎ［％，（x ±ｓ）］树突状细胞ＣＤ１１ｃＣＤ８０ＣＤ８６ＨＬＡ－ＤＲ加入ＬＰＳ前３７．０±１．５１７．０±１．１１７．２±０．９５４．２±０．４加入ＬＰＳ后３９．０±２．５２４．９±０．７＊５９．３±２．５＊６５．９±１．６＊图２培养第７天树突状细胞（５０００×）Ｆｉｇ．２ＴｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆＤＣｓｏｎｔｈｅ７ｔｈｄａｙａｆｔｅｒｃｕｌｔｕｒｅ（５０００×）加入ＬＰＳ后加入ＬＰＳ前图３树突状细胞成熟前后细胞表型的变化Ｆｉｇ．３ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｈｅｎｏｔｙｐｅｏｆＤＣｓａｆｔｅｒａｎｄｂｅｆｏｒｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎ与加入ＬＰＳ前比较，＊Ｐ＜０．０５．２．２扫描电镜观察树突状细胞形态电镜下观察树突状细胞，细胞表面粗糙，有层叠状褶皱，细胞膜上分布大量外生的突起，见图２．２．３树突细胞表型变化加入ＬＰＳ前后，树突状细胞表型有明显改变．ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＤＲ在加入ＬＰＳ前后，其细胞阳性表达率明显增加，差别都具有统计学意义（Ｐ＜０．０５），说明加入ＬＰＳ后，树突状细胞共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６及ＭＨＣ－ＩＩ类分子的表达增加．而ＣＤ１１ｃ加入ＬＰＳ前后，差别无统计学意义（Ｐ＞０．０５），提示ＬＰＳ对ＣＤ１１ｃ无明显影响，见图３、图４及表１．２．４共聚焦显微镜下观察树突状细胞吞噬抗原能力图中细胞膜经ＰＥ－ＣＤ１１ｃ标记，共聚焦显微镜下呈红色荧光，抗原为ＦＩＴＣ－ＯＶＡ标记，共聚焦显微镜下呈绿色荧光，见图５．共聚焦显微镜下可看到经ＰＥ－ＣＤ１１ｃ标记的细胞膜，使细胞膜表面呈现红色荧光，并可辨别树突状细胞表面形态，树突状细胞表面不规则，有大量外生的树突状突起，细胞内可见ＦＩＴＣ－ＯＶＡ标记，呈现绿色荧光的抗原，在细胞内部均匀分布．加入ＬＰＳ后，随树突状细胞的成熟，树突表面突起明显增加，但细胞对抗原的摄取明显减弱．第３６卷36昆明医科大学学报图４树突状细胞成熟前后细胞表型的变化Ｆｉｇ．４ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｈｅｎｏｔｙｐｅｏｆＤＣｓａｆｔｅｒａｎｄｂｅｆｏｒｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎ加入ＬＰＳ后加入ＬＰＳ前图５示树突状细胞成熟前后抗原吞噬能力的比较（×８００）Ｆｉｇ．５ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆａｎｔｉｇｅｎｅｎｇｕｌｆｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＤＣｓａｆｔｅｒａｎｄｂｅｆｏｒｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎ（×８００）图中细胞膜经ＰＥ－ＣＤ１１ｃ标记，共聚焦显微镜下呈红色荧光，抗原为ＦＩＴＣ－ＯＶＡ标记，共聚焦显微镜下呈绿色荧光．３７第３期李望，等．树突状细胞的培养及成熟的鉴定３讨论３．１从形态学上分析树突状细胞１９７３年Ｓｔｅｉｎｍａｎ首次发现树突状细胞，研究中发现树突状细胞在免疫应答机免疫耐受中占有重要地位，树突状细胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ，ＤＣ）广泛分布于脑以外的全身组织及器官，仅占人外周血单个核细胞的１％，因其具有许多分枝状突起故名，在倒置显微镜下［２］，树突状细胞培养第１天，在ＩＬ－４及ＧＭ－ＣＳＦ诱导下，细胞由散在、均匀排列的单加入ＬＰＳ前加入ＬＰＳ后加入ＬＰＳ前加入ＬＰＳ前加入ＬＰＳ前加入ＬＰＳ后加入ＬＰＳ后加入ＬＰＳ后独细胞，逐渐形成大量贴壁的细胞集落团块，细胞大小从整体上观察均匀一致，未见明显突起．而树突状细胞培养至第７天，加入ＬＰＳ后，从培养液中可明显辨别出大量细胞质丰富，在细胞培养液中呈悬浮状态的树突状细胞，细胞膜表面呈现许多分枝状突起，细胞集落团块减少或消失．电镜下，观察树突状细胞，细胞较大，细胞表面粗糙，有大量外生型突起．本实验采用Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ梯度离心法，从外周血中分离出ＣＤ１４＋单个核细胞，根据树突状细胞短暂性贴壁的特性，分离出树突状细胞，极大简化实验分离过程，并且能够避免在间接贴壁中收集转移贴壁细胞对前体细胞的丢失，此实验方法在大多实验中得到证实［３，４］．在ＣＤ１４＋细胞诱导成熟过程中，加入ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４，能使ＣＤ１４＋单个核细胞向未成熟的树突状细胞转化，ＧＭ－ＣＳＦ是树突状细胞发育重要的细胞因子，能诱导单个核细胞形成细胞集落，并生产少量树突状细胞，ＩＬ－４的加入，能抑制中性粒细胞及巨噬细胞的产生，促进单核细胞向未成熟树突细胞转化［５］，在试验中，倒置显微镜下观察的大量集落刺激单位形成相一致．脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，加入磷酸脂多糖（ＬＰＳ）后，未成熟细胞摄取ＬＰＳ，并与Ｔｏｌｌ样受体４结合，增强ＩＦＮ的表达，从而导致未成熟树突细胞向成熟树突状细胞转化［６］．３．２从表型上分析树突状细胞未成熟树突状细胞表面表达低水平的共刺激分子及ＭＨＬ－ＩＩ类分子，而高表达一系列受体，如Ｔｏｌｌ样受体、Ｃ型凝集素等，其形态与功能相适应，高表达的受体有利于未成熟细胞识别、摄取抗原相关的物质．一旦未成熟树突状细胞受到炎性刺激，未成熟细胞则会向成熟细胞转化，其中共刺激分子及ＭＨＬ－ＩＩ表达水平显著提高，其意义在提供Ｔ细胞活化的信号．如Ｔ细胞受体与ＭＨＣ－抗原复合体结合传递信号，Ｔ细胞表型ＣＤ２８与ＣＤ８０／ＣＤ８６结合传递信号，从而启动获得性免疫应答［７］．实验中，树突状细胞ＬＰＳ刺激后，ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＤＲ的表型显著较刺激前表达增高，提示未成熟树突状细胞向成熟细胞转化，这种现象与理论相适应．实验中发现，ＣＤ１１ｃ在ＬＰＳ刺激前后，都出现高表达现象，提示ＣＤ１１ｃ可能是树突状细胞共有表型，有待进一步研究证实．从抗原摄取能力分析树突状细胞未成熟树突细胞具有较强的抗原吞噬能力，抗原通过与树突状细胞Ｔｏｌｌ样受体结合，并通过内（下转第４４页）发症和医疗意外；与其他行业相比，医务人员面对的是身有疾病的患者，其工作关系到病人的生命的安全，行业的特殊性要求他们必须要有更强的责任心，其职业行为必须更加严格规范．医院的各项医疗规章制度是对医务人员的基本要求，若不严格执行将给患者带来极大的安全隐患，也使医院和医务人员在面对纠纷时处于十分被动的境地．医疗纠纷虽然不可避免，但是通过医院管理者对其成因的分析，可以在一定的程度上防范医疗纠纷的发生．医院管理部门要不断修订和完善各类制度规范，还要加大宣传、教育和督导力度，提高医务人员的医疗水平和执行力，确保各项制度规范严格落实．只有这样才能有效的控制医疗纠纷的发生，才能为患者就医提供更加舒适、更加轻松的医疗环境．［参考文献］［１］唐春爱．２２４７７例出院病人疾病构成帕累托图分析［Ｊ］．中国医院统计，２００８，１５（４）：３４６－３４７．［２］李雅立．出院患者２２４５９例次疾病构成帕累托图分析［Ｊ］．中国冶金工业医学杂志，２０１１，２８（６）：６３０－６３１．［３］张涛．医疗纠纷的成因探讨［Ｊ］．国际护理学杂志，２００７，２３（５）：５３４－５３６．［４］宋会臻．难以避免的医疗意外与对策探讨［Ｊ］．中国误诊学杂志，２００７，７（９）：２０２８－２０２９．（２０１５－０１－０３收稿）吞、胞饮等作用，将抗原摄取进入细胞内，进而完成对抗原的加工处理过程．同时进一步诱导树突状细胞成熟，成熟的树突状细胞对抗原的摄取、加工能力较弱，但能发挥抗原递呈作用，将处理的抗原，递呈给Ｔ淋巴细胞，同时通过一系列共刺激分子、细胞因子等作用，诱导Ｔ淋巴细胞活化．模式抗原卵白蛋白（ＯＶＡ）有良好的免疫原性，是常用的半抗原载体，用用荧光标记的ＦＩＴＣ－ＯＶＡ抗原，能较好的反应树突细胞摄取、加工抗原吞噬能力，在共聚焦显微镜下观察细胞内ＯＶＡ分布、密度状况，可作为树突状细胞成熟能力鉴别方法之一．目前对于人体树突状细胞研究已有大量报道，引起自身的特性，对树突状细胞的研究具有重要的临床意义．Ｇｉｌｉｅｔ等早期发现，在人体血液及组织中有两种特怔性的树突状细胞组群：髓样树突状细胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｍｙｅｌｏｉｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ，ｍＤＣ）以及类浆细胞样树突状细胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ，ｐＤＣ），外周血中ｐＤＣ的比例较ｍＤＣ明显较高时，可诱导出现机体出现免疫耐受［８］．在未来的发展趋势中，树突状细胞将在肿瘤、移植免疫等方面研究中发挥重要的作用．［参考文献］［１］ＷＡＬＬＥＴＭＡ，ＳＥＮＰ，ＴＩＳＣＨＲ．Ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｄｅｎ－ｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＣｌｉｎＭｅｄＲｅｓ，２００５，３（３）：１６６－１７５．［２］ＢＡＮＣＨＥＲＥＡＵＪ，ＳＴＥＩＮＭＡＮＲＭ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆｉｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９２（１９）：２４５－２５５．［３］高伟生，罗荣成，马树东，等．人外周血树突状细胞的分离与鉴定［Ｊ］．中国组织工程研究与临床康复，２００７，１１（１１）：２１０５－２１０９．［４］陶晓根，莫宝定，陈剑，张蕾，等．健康人外周血树突状细胞体外培养及表型鉴定［Ｊ］．临床和实验－医学杂志，２０１２，１１（２３）：１８３７－１８３９．［５］ＢＡＮＣＨＥＲＥＡＵ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙｏｆｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，２０００，１８（４）：７６７－８１１．［６］ＫＡＷＡＩＴ，ＡＫＩＲＡＳ．ＴＬＲｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｆ－ｆｅｒ，２００６，１３（６）：８１６－８２５．［７］ＲＥＩＳＥＳＯＵＳＡ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓｉｎａｍａｔｕｒｅａｇｅ［Ｊ］．ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，２００６，６（６）：４７６－４８３．［８］ＧＩＬＩＥＴＭ，ＬＩＵＹＪ．ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎＣＤ８ＴｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｃｅｌｌｓｐｒｉｍｅＩＬ－１０ｐｒｏｄｕｃｉｎｇＴｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｃｅｌｌｓｂｙｉｎｄｕｃｉｂｌｅｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｌｉｇａｎｄ［Ｊ］．ＪＥｘｐＭｅｄ，２００７，２０４（１５）：１０５－１６１．（２０１５－０１－１３收稿）第３６卷44昆明医科大学学报4444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444（上接第３７页码）。
