SDS-PAGE蛋白胶银染注意事项

SDS是阴离子去污剂，能断裂分子内和分子间的氢键，破坏蛋白分子的二、三级结构。

作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。

在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS 胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。

分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。

电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。

2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。

电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。

蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。

电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。

过硫酸铵（AP）为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。

在聚合过程中，TEMED 催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

PAGE凝胶快速银染试剂盒使用说明货号:G7210规格:1L保存:室温(15℃-25℃)干燥保存，复检期12个月。

试剂盒内容：G7210染色液A200ml染色液B1ml染色液C100ml显色液D100ml试剂E2g注：1L规格指可配制的银染液的体积，实际使用次数根据PAGE胶大小不同而不同。

产品说明:蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合，然后用还原剂如甲醛在碱性环境下使Ag+还原成银颗粒，可把蛋白电泳带染成黑褐色。

它主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色。

其灵敏度比考马斯亮蓝高，PAGE凝胶快速银染试剂盒整个过程操作简单，灵敏度高，能检测到10ng以下的蛋白条带。

操作步骤:一、染色液配制(无水乙醇自备)需要配制的染色液体积根据PAGE胶的大小而定，一般的mini-PAGE胶需要20-30mL。

配制用的器皿清洗干净后用去离子水涮洗，染色液须用去离子水配制，现用现配。

如果配制的溶液体积不是100mL，可以按比例改变各成分用量。

1.固定液：取40ml无水乙醇，10ml染色液A加去离子水至100ml，混匀；2.敏化液：取30ml无水乙醇，10ml染色液C加去离子水至100ml，混匀；3.银染液：称取0.12g试剂E，用50ml去离子水溶解，加入10ul染色液B混匀，加去离子水至100ml现用现配。

4.显色液：10ml显色液D和30ul染色液B加入去离子水至100ml，混匀，现用现配。

5.终止液：取5ml染色液A加去离子水稀释至100ml，现用现配。

二、染色：1.PAGE电泳结束后，将PAGE蛋白胶转移至玻璃平皿或搪瓷盘中，用固定液固定30min。

2.将PAGE胶转移至敏化液中，使染液没过PAGE胶，室温作用30min。

可置于摇床上缓慢摇晃3.弃去敏化液，用去离子水漂洗三次，每次10min。

4.将PAGE胶转移至银染液中，使染液没过PAGE胶，室温摇晃40min。

5.将PAGE胶转移至显色液中，使显色液没过PAGE胶，室温摇晃，该显色一般在10min 左右。

蛋白快速银染试剂盒操作步骤及注意事项蛋白快速银染试剂盒操作步骤及注意事项货号：G0180规格：20T有效期：6个月有效。

产品内容：试剂(A):Silver Stain Sensitizer(500×)2×1ml RT试剂(B):Silver Stain(100×)10ml RT避光试剂(C):Silver Stain Developer(5×)2×100ml RT避光试剂(D):Silver Stain Stop Buffer(10×)100ml RT产品说明：蛋白快速银染试剂盒(Protein Fast Silver Stain Kit)是一种快速的可用于SDS-PAGE 或非变性PAGE等蛋白银染染色的试剂盒，该试剂盒含有增敏步骤，可明显降低背景。

其优点还在于：1、操作简单、快速；2、可用于2D凝胶的银染，并可进行后续的质谱检测；3、目的条带清晰；4、不含甲醇。

Protein Fast Silver Stain Kit与Protein Silver Stain Kit 相比，前者操作速度更快，当检测灵敏度可能低于后者，尤其是在检测小分子量蛋白质的时候。

本试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

自备材料：1、水平摇床或侧摆摇床2、去离子水(超纯)3、乙醇、冰乙酸操作步骤(仅供参考)：1、准备工作：以下操作以8.5×5.5cm、厚度为1.0mm的凝胶为例，以凝胶全部浸没到溶液为准，一般用量是25ml，对于凝胶体积较大的，各溶液的使用量需按凝胶体积比例放大。

整个银染过程应在摇床上进行，摇床转速控制在60～70rpm。

提前配制固定液，即按无水乙醇:冰乙酸:去离子水=5:1:4的比例配制。

提前配制洗涤液，即按无水乙醇:去离子水=1:4的比例配制。

2、水洗：电泳结束后，取凝胶放入去离子水中清洗2次，每次5min。

3、固定：取凝胶放入50～100ml固定液中，在摇床上室温摇动15～20min，重复固定步骤1次。

蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

BCA法。

2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。

煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。

煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。

蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。

(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

BCA法。

2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。

煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。

煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。

蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。

(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

文件号: QC-SOP-102 Page 1 of 4 Version: A/0 Print Date:题目：SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳---银染实验流程目的：为了使员工迅速掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳---银染实验而编写的操作过程。

范围：成员负责部门：QC Quality Assurance Department姓名签字日期起草人：批准人：QA：生效日期：文件号: QC-SOP-102 Page 2 of 4Version: A/0 Print Date:1.概要1.1 本操作流程用来描述SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳---银染的标准操作步骤。

2. 适用范围2.1本流程适用于操作人员进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳---银染实验的操作过程。

2.2 本流程适用于在普通实验室中进行操作。

3. 责权3.1质量保证部门有责任确保操作人员接受过该流程相关实验技术及操作的培训。

3.2质量保证部门有责任确保该流程操作完全按照以下规范进行。

3.3质量保证部门有责任定期检查修订本流程。

4. 材料准备4.1 试剂和溶液4.1.1 SDS丙烯酰胺凝胶电泳所需的溶液见SOP-QC-100 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验流程4.1.2 固定液30ml甲醇，12ml乙酸，50ml水，50 µl甲醛（100ml）4.1.3 漂洗液35%乙醇的水溶液4.1.4 致敏液0.02%硫代硫酸钠的水溶液4.1.5 银染液0.2%硝酸银的水溶液4.1.6 显色液6g碳酸钠，50µl甲醛，2ml致敏液，加水定容到100ml4.1.7 终止液38ml甲醇，12ml乙酸，加水定容到100ml4.1.8 保存液1%乙酸的水溶液4.1.9 分子量标准蛋白标准分子量参照物使用Fermentas公司的PageRuler（10KD~170KD）4.1.10 蛋白样品待分离的蛋白样品可为纯化的蛋白，也可为细胞裂解液。

4.2 设备：4.2.1 蛋白电泳仪公司BIO-RAD 电源型号PowerPac Universal4.2.2 单道可调式移液器公司Eppendorf文件号: QC-SOP-102 Page 3 of 4Version: A/0 Print Date:4.2.3电子天平公司Acculab4.3 耗材：吸头（T-20，T-200，T-1000，T-5000）烧杯( 50mL，三个)Eppendof离心管玻璃表面皿（2个）5. 相关文件5.1 SOP-PUB-EQU-009 PH计（PB-10型）的操作使用以及清洁保养5.2 SOP-PUB-EQU-010 Acculab电子天平操作、清洁与校准5.3 SOP-PUB-EQU-013 单道可调式移液器（Thermo/Gilson）的操作、清洁与校准5.4 SOP-QC-100 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验流程6. 操作步骤6.1. 参照SOP-QC-100 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验流程，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。

SDS-PAGE配胶试剂盒使用说明书Cat.No：Lot No：原理：本技术中，待分离的样品在有SDS-PAGE和还原剂的存在下通过加热而变性并被去污剂所包被。

SDS可使蛋白质带上大量的负电荷，其带电荷的多少正好与多肽的长度成正比。

聚丙烯酰胺凝胶上样后，在高电压的作用下，蛋白组分向正极（阳极）迁移。

由于所有的蛋白所带的负电荷与其分子大小成正比，因而蛋白就仅仅根据其分子量的大小不同而被分离—凝胶的分子筛效应。

蛋白质的分子量就可以通过与标准蛋白的凝胶迁移率进行比对而得到。

凝胶电泳后，特定的凝胶条带可以通过染色而观察到，并且可通过被动扩散或电洗脱从凝胶上进行回收。

两种最常用的染色方法是考马斯亮蓝法和银染法，这两种方法的蛋白条带检测灵敏度可分别达到50ng和5ng。

由于考马斯亮蓝法使用简便，并可以对收集的蛋白带作进一步分析，因而较为常用。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳应用范围：1）蛋白质纯度的分析；2）蛋白质分子量的测定；3）蛋白质浓度的测定；4）蛋白质水解的分析；5）免疫沉淀蛋白的鉴定；6）免疫印迹的第一步；7）蛋白质修饰的鉴定；8）分离和浓缩用于产生抗体的抗体的抗原；9）分离放射性标记的蛋白质。

试剂盒组成：1．30%预制聚丙烯酰胺胶（4℃保存）200ml2．1.5M TrisCl（PH=8.8）200ml3．1.0M TrisCl（PH=6.8）50ml4．10%SDS 30ml5．10%过硫酸铵（4℃保存）30ml6．去离子水250ml7．TEMED（4℃闭光保存！）1ml8．5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液250 ml9．考马斯亮蓝染色剂50ml10. 考马斯亮蓝脱色剂250ml5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液用时以去离子水1：4稀释，配成1×-甘氨酸电泳缓冲液工作液。

凝胶的配制：（1）将玻璃板安装固定好切误把玻璃弄坏（2）进行分离胶的配制（3）加入TEMED后立即混匀内容物倒入到固定好的玻璃板中，同时留出灌注浓缩胶所需空间（梳子的齿长再加0.5cm）再在胶液面上小心注入一层水（约2—3mm高）以排除气泡和阻止氧气进入凝胶溶液。

sds page凝胶电泳步骤以SDS-PAGE凝胶电泳步骤为标题的文章SDS-PAGE凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和测量方法，其步骤包括蛋白质样品的制备、样品加载、电泳运行、染色和图像分析等。

本文将详细介绍SDS-PAGE凝胶电泳的步骤及相关注意事项。

一、蛋白质样品的制备准备要分离的蛋白质样品，并将其加入样品缓冲液中，以使蛋白质溶解并保持其天然构象。

样品缓冲液通常包含Tris-HCl缓冲液、甘油、SDS和β-巯基乙醇等成分，用于维持样品的pH值和还原环境，使蛋白质完全展开。

二、样品加载将制备好的蛋白质样品加载到凝胶孔中。

通常使用微量吸管或微量注射器将样品缓冲液缓慢地注入凝胶孔中，确保样品完全进入凝胶中。

三、电泳运行将已加载样品的凝胶板放置在电泳槽中，确保凝胶完全浸泡在电泳缓冲液中。

然后将电泳槽连接到电源，并设置合适的电压和电流参数。

根据需要，可以选择常规电泳或快速电泳。

在电泳过程中，蛋白质样品会在凝胶中被电场推动，根据其分子大小和电荷不同，被分离成不同的带状条带。

较小的蛋白质分子迁移速度较快，而较大的蛋白质分子迁移速度较慢。

四、染色电泳结束后，需要对凝胶进行染色以可视化蛋白质带状条带。

常用的染色方法有银染色和Coomassie蓝染色。

银染色对蛋白质敏感性高，但操作繁琐；而Coomassie蓝染色操作简单，但对蛋白质敏感性相对较低。

五、图像分析通过使用分析软件或图像扫描仪，将染色后的凝胶图像数字化，并进行分析。

可以测量蛋白质带状条带的相对迁移距离和相对强度，进而确定蛋白质的分子大小和相对丰度。

在进行SDS-PAGE凝胶电泳实验时，还需要注意以下事项：1. 准备工作确保操作台和仪器干净，并准备好所需的试剂和设备。

避免在实验过程中发生交叉污染。

2. 样品加载在加载样品时，应避免空气泡和溢出。

确保样品均匀地加载到凝胶孔中，以获得清晰的带状条带。

3. 电泳运行条件根据蛋白质样品的大小和分离需求，选择合适的电压和电流参数。

1. 电泳完成后，用超纯水洗胶2次，每次洗涤5分钟。

2. 固定：将凝胶浸泡在 25 ml 的固定液中，固定液充分覆盖胶。

放于摇床上室温摇动 15 分钟。

更换固定液，重复一次。

固定液的配制：超纯水：乙醇：冰醋酸=6:3:1.3. 固定完成后，配制 10%乙醇，洗胶 2 次，每次洗涤 5 分钟。

4. 再用超纯水洗胶 2 次，每次洗涤 5 分钟。

5. 配制银染增敏工作液：取 50 ul Silver Stain Sensitizer（500×）加入到 25 ml 超纯水中，混匀。

6. 将步骤 4 洗好的凝胶置于银染增敏工作液中，室温下准确孵育 1 分钟（这里时间可以适当延长的），之后用超纯水洗胶 3 次，每次洗涤 20 秒。

7. 弃去超纯水，将凝胶置于 Silver Stain 中孵育 30 分钟（我做的时候是孵育45min-1h）。

8. 配制终止液：5%冰醋酸。

9. 用超纯水快速洗胶 3 次，每次洗涤 20 秒（时间不用很准确）。

10. 立即将洗好的凝胶浸没在 Silver Stain Developer 中，室温孵育 2-3 分钟，直至蛋白条带显示清晰（我做的时候室温孵育时间比较长，因为我也是为了找到差异条带打质谱的，10分钟甚至更长都是可以的，建议最好一直在旁边看着，直至出现满意的结果）。

11. 用终止液洗去凝胶上的 Silver Stain Developer 后，将凝胶浸泡在新的终止液中反应10 分钟。

(注：孵育是摇床速度调到最小，洗涤时速度要加快，和western洗膜的速度一样就行)用一般的SDS-PAGE胶就可以。

1. 分离胶(12%)配制所需试剂所需体积分离胶(12％) 30％丙烯酰胺 6.0 ml1.5 mol/l Tris-HCl 3.8 ml10%SDS 150 μl10%过硫酸铵 150 μlTEMED 6 μl蒸馏水 4.9 ml2. 浓缩胶(5%)配制所需试剂所需体积浓缩胶(5％) 30％丙烯酰胺 1.3 ml1.5 mol/l Tris-HCl 1.0 ml10%SDS 80 μl10%过硫酸铵 80 μlTEMED 8 μl蒸馏水 5.5 ml3. 分离胶缓冲液(pH8.9)配制所需试剂所需体积分离胶缓冲液Tris 36.6 g1 mol/l HCl 48 ml蒸馏水补足至100 ml4. 浓缩胶缓冲液(pH6.7)配制所需试剂所需体积浓缩胶缓冲液（pH6.7）Tris 5.98 g1 mol/l HCl 48 ml蒸馏水补足至100 ml5. 30%丙烯酰胺(pH≤7.0)配制所需试剂所需体积30%丙烯酰胺（pH≤7.0）丙烯酰胺29 g甲叉-双丙烯酰胺 1 g蒸馏水补足至100 ml6. 10%过硫酸铵(W/V)：1g过硫酸铵溶于10ml水中，4℃保存数周，尽量现用现配。

SDS-PAGE蛋白电泳标准操作----(纯度检测)一.目的：检测蛋白质的纯度是否达到生产抗体的要求。

二.依据：《分子克隆手册》，Ab-mart公司内部标准。

三. 职责：质量控制部。

四.试剂与水：所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。

五. 器皿与耗品：所有玻璃器皿使用前用玻璃清洁剂清洗, 80℃烤干。

tube、tip一次性使用。

六. 仪器设备：电泳仪（电源1--300V）电泳槽灌胶模具染色具凝胶扫描仪七. 环境要求：相对洁净环境，室温。

八. 溶液的配置：1.A液：1.5MTris·HCl pH8.8称取18.15gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至8.8,加超纯水定容至100 ml。

贴上标贴，4℃保存。

此溶液有效使用期限为三个月。

（溶液配置台帐见附件）2.B液: 1MTris·HCl pH6.8称取12.1gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至6.8,加超纯水定容至100 ml。

贴上标贴，4℃保存。

此溶液有效使用期限为三个月。

（溶液配置台帐见附件）3.C液: 30%丙烯酰胺称取29.2g丙烯酰胺(分析纯),0.8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺(分析纯), 加适量的超纯水溶解,再定容至100 ml,用滤纸过滤,。

贴上标贴，避光4℃保存。

此溶液有效使用期限为三个月。

（溶液配置台帐见附件）4.D液:10%SDS称取10gSDS(分析纯),用超纯水溶解至100 ml.贴上标贴，室温储存。

此溶液有效使用期限为三个月。

（溶液配置台帐见附件）5.E液:10%过硫酸胺称取10g过硫酸胺(分析纯), 用超纯水溶解至100 ml。

贴上标贴，-20℃保存。

此溶液有效使用期限为三个月。

（溶液配置台帐见附件）6.F液:TEMED(amersco)7.电泳缓冲液(10X)称取60.57g Tris碱(分析纯),288.268g甘氨酸(分析纯),20gSDS(分析纯),加超纯水定容至2000ml，临用前加超纯水稀释10倍，贴上标贴，室温储存。

原理：蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合，检测极限是2～5.0ng／蛋白条带。

① SDS-PAGE电泳。

注意：银染检测蛋白质的水平是在100ng左右，与CommassieBlue染色比较，银染加样量要少。

否则难以得到清晰的电泳分辨率。

②电泳结束后，戴手套将PAGE胶转移到干净的玻璃培养皿或TIP头盒盖中。

加入25ml FixingSolution（固定液），室温振荡保温30min。

胶需要完全淹没在固定液中。

③彻底弃去固定液，加入25mlIncubation Solution（保育液），室温振荡保温30min。

胶需要完全淹没在保育液中。

④彻底弃去IncubationSolution（保育液），用50ml去离子水洗3次，每次5min。

⑤准备：取2.5ml 10XSilvering Solution, 加入22.5mL水，混匀后使用。

⑥弃去洗涤的水，加入25mlSilvering Solution (银染液)。

室温振荡保温20min。

⑦彻底弃去银染液，加入25mLDevelopingSolution（显色液），室温振荡保温1~10min。

注意观察目的条带。

如果目的条带出现了，可以考虑终止显色。

显色时间不要过长，否则本底较深。

⑧彻底弃去显色液,加入25mLStopping Solution（终止液），室温振荡保温10min。

⑨彻底弃去StoppingSolution（终止液），用50mL去离子水洗3次，每次5min。

弃去洗涤的水，加入25mL PreservingSolution（保护液），室温振荡保温20min。

银染PAGE胶可以拍照保存，也可以室温玻璃纸干燥。

今天第一次银染，结果出来啥也没有，凝胶就像一块海带一样。

能不能提供详细的银染步骤呢？好像有好几种版本，哪位大侠有经验的希望能点拨一下？hotstoe wrote:1. 取下凝胶,蒸馏水冼胶30秒.2. 0.1% 硝酸银染色10分钟.3. 弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟.4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.显色液配方: 10克氢氧化钠+0.2克碳酸钠+2m甲醛溶液,定溶到500ml.这个染色方法挺好的,我用过.注意染色时间不能长.我的经验是：1.取下凝胶用去离子水冼胶30秒三次，2.0.1% 硝酸银染色10分钟.3.弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟（换2次去离子水）4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.不要试图将所有的条带都显出来，要求越高可能导致背景就深，5.染色后要用固定液（冰乙酸）终止染色，6.固定3分钟后再用去离子水洗涤2遍（整个试验比较费去离子水）。

银染是一种常用的蛋白质染色方法，具有较高的灵敏度，可以染出SDS-PAGE胶中含量低至0.2ng的蛋白。

虽然这是protocol上的说法，但如果操作得当，检测到5ng左右的蛋白应该不成问题。

如果搜索银染的protocol，可能会得到许多种说法。

为什么这样一种重要的实验手段却得不到统一的应用呢？这可能要从银染本身那复杂而又灵活的原理说起。

简单的讲，银染的原理就是将银离子还原，附着在蛋白表面，形成染色。

银染所用的银，基本上是基于两种试剂，一种是硝酸银，另一种是Silver diammine。

基于硝酸银的应用要多于后者（据说Silver diammine比较费“银子”），现在主要说说基于硝酸银的银染的原理。

银离子容易被还原，在PAGE胶上，哪里的银离子先开始被还原，哪里就先开始出现条带。

通常由于蛋白质结构上的复杂性，一部分银离子结合在蛋白质之上后会影响更多银离子的结合，所以有蛋白的地方银离子较少，如果不做任何处理，有蛋白的部位将会染色更浅，所以最初的银染是负染。

那最初的负染是如何演变成正染色的呢？一方面是选用还原速度较慢的还原剂，如甲醛，另一方面，利用慢还原争取到的时间将胶上多余的银离子洗去，由于银离子对蛋白质有一定的结合力，故更多地保留在有蛋白的位置，于是形成了正染。

但是这种染色的方法灵敏度还不是很高，所以人们又在染色之前加入了敏化的步骤，能够使银染敏化的试剂很多，一类是增加蛋白质与银离子的结合位点，如SDS等；还有一类能使银离子和蛋白形成silver sulfide等结合，硫代硫酸盐起到的就是这个作用；还有的试剂兼顾上述两种功能，如戊二醛。

通过敏化过程，银染的灵敏度大大增加，同时也降低了背景。

综上，银染的原理概括如下：让银离子尽可能多的于蛋白结合，尽可能的洗掉胶上的银离子，然后还原显色。

各种各样的protocol基本上都是基于这个原理。

最为经典的一个版本是这样的：谈谈其中一些具体步骤：1. 固定，固定的作用主要是使蛋白变性，防止蛋白在扩散2. 敏化，戊二醛和硫代硫酸钠都是增加蛋白和银离子的结合，但是做质谱兼容银染的时候一般都把戊二醛去掉，原因是对蛋白造成修饰（在我的实验中，有戊二醛存在的时候一般也能鉴定到蛋白，不知道是不是去掉更好）。

原理：蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合，检测极限是2～／蛋白条带。

① SDS-PAGE电泳。

注意：银染检测蛋白质的水平是在100ng左右，与CommassieBlue染色比较，银染加样量要少。

否则难以得到清晰的电泳分辨率。

②电泳结束后，戴手套将PAGE胶转移到干净的玻璃培养皿或TIP头盒盖中。

加入25ml FixingSolution（固定液），室温振荡保温30min。

胶需要完全淹没在固定液中。

③彻底弃去固定液，加入25mlIncubation Solution（保育液），室温振荡保温30min。

胶需要完全淹没在保育液中。

④彻底弃去IncubationSolution（保育液），用50ml去离子水洗3次，每次5min。

⑤准备：取10XSilvering Solution, 加入水，混匀后使用。

⑥弃去洗涤的水，加入25mlSilvering Solution (银染液)。

室温振荡保温20min。

⑦彻底弃去银染液，加入25mLDevelopingSolution（显色液），室温振荡保温1~10min。

注意观察目的条带。

如果目的条带出现了，可以考虑终止显色。

显色时间不要过长，否则本底较深。

⑧彻底弃去显色液,加入25mLStopping Solution（终止液），室温振荡保温10min。

⑨彻底弃去StoppingSolution（终止液），用50mL去离子水洗3次，每次5min。

弃去洗涤的水，加入25mL PreservingSolution（保护液），室温振荡保温20min。

银染PAGE胶可以拍照保存，也可以室温玻璃纸干燥。

今天第一次银染，结果出来啥也没有，凝胶就像一块海带一样。

能不能提供详细的银染步骤呢？好像有好几种版本，哪位大侠有经验的希望能点拨一下？hotstoe wrote:1. 取下凝胶,蒸馏水冼胶30秒.2. % 硝酸银染色10分钟.3. 弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟.4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.显色液配方: 10克氢氧化钠+克碳酸钠+2m甲醛溶液,定溶到500ml.这个染色方法挺好的,我用过.注意染色时间不能长.我的经验是：1.取下凝胶用去离子水冼胶30秒三次，硝酸银染色10分钟.3.弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟（换2次去离子水）4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.不要试图将所有的条带都显出来，要求越高可能导致背景就深，5.染色后要用固定液（冰乙酸）终止染色，6.固定3分钟后再用去离子水洗涤2遍（整个试验比较费去离子水）。

蛋白免疫印迹实验注意事项
1.标记探针：应选择适当的标记方式，例如荧光标记或酶标记，以确保检测结果的准确性和可靠性。

2.样品制备：应根据实验目的和特点制备样品，取样时遵循标准化程序，例如选择适当的组织，确定样品的种类和数量等。

3.准备蛋白样品：可使用常规离心和浮渣等方法来纯化蛋白质样品。

同时，应使用合适的分离条件，例如SDS-PAGE分离等方法。

4.电泳条件：在进行SDS-PAGE分离时应注意电泳条件、电泳时间和电极的电位等参数。

这些参数应经过适当的优化，以确保蛋白质分离的完整性和稳定性。

5.膜修饰：在进行印迹前，应对PVDF或NC膜进行预处理，以提高其亲水性和蛋白吸附性能，例如使用甲醇或乙醇水溶液进行湿润处理。

6.印迹条件：印迹条件应根据探针和样品的特性进行优化，例如印迹的温度、时间和探针浓度等。

在印迹后，应及时清洗膜以去除多余的标记物。

7.数据分析：印迹结果应准确地获取并进行合理的解释和分析，注意4°C或-20°C保存条件。

8.良好的实验室卫生：应保证实验室的卫生和环境良好，以避免外源性影响实验结果。

同时，应加强实验室安全意识，严格按照实验安全规范进行操作。

SDS－PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最常用的就是SDS－PAGE 电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论：Q：SDS－PAGE电泳的基本原理？A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。

在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。

由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。

当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。

所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。

匀浆:1.匀浆缓冲液含有多种蛋白酶抑制剂，降低蛋白酶活性，以防蛋白降解。

2.SDS在匀浆以后再加入，以防起沫。

3.所有操作尽量在冰上进行。

4.94C水浴（或沸水浴）处理的作用是为了是蛋白变性，以防降解（水浴锅事先要打开升温）。

5.PMSF是有毒试剂，处理时注意。

6.操作过程尽量带上手套，以防人手表面的蛋白和脂肪的污染。

7.热水浴后，离心是用的可以控温的离心机，使用前15分钟打开使温度降到4C,即可。

8.离心后分装，可以用枪头先把表面的一层吸走，换取新的枪头在分装。

9.SDS,DDT,PMS是用时临时加入缓冲业的，根据母液的浓度计算所需的量。

制胶：10.APS和TEME是促凝的，根据温度加入的量是可以变动，一般不超过30%。

11.玻璃板一定要洗干净，否则制胶是会有气泡。

12.丙烯酰胺是有毒的，操作时注意安全。

（凝胶以后，聚丙烯酰胺毒性降低。

）13.1.5mm的玻璃板有黑色条带封低，1mm勺玻璃板用白色条带封底。

（封紧以防漏胶）14.凝胶的时间要严格控制好，一般在20-30min。

15.样品处理时，沸水浴使蛋白充分变性以防在电泳时产热蛋白质降解。

一般要5-10分钟。

而且要注意把样品的管口封好，以防沸水浴时冲开（出错了）。

16.点样时，如果孔比较多，尽量点在中央。

（点在边上时，跑出的带是斜的）17.点样前要排尽胶底部的气泡，防止干扰电泳。

18.开始电泳时，电压调到80V,当跑过浓缩胶时电压调到100V。

19.电泳结束后，取胶时，小心把玻璃板翘起（防止再次落下）20.脱色时，尽量多次进行换水。

21.上样量不宜太高，蛋白含量每个孔控制在10卩g-50卩g,，一般V 15卩I.22.做胶时，凝胶时间控制在25min。

梳子不能歪来歪去。

23.上样时，Mark最好标在中间，边上的孔尽量不要上样。

24.制胶时，在加APS前尽量不要搅拌，加入APS后可以轻轻搅拌，不要产生气泡。

注意：温度，时间，光照，APS和TEMEDfE会对凝胶产生影响。

SDS-PAGE操作流程——考染1、准备溶液30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide【配制方法】将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。

0.45µm微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存。

严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。

使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。

如有沉淀，可以过滤。

【保存条件】4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存【注意事项】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。

称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。

可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。

1MTris-HCL（pH6.8）(浓缩胶buffer)【配制方法】称量121.1gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加>0.7mL的浓HCL调节所需要的pH值（7.4-大约0.7mL，7.6-大约0.6mL，8.0-大约0.42mL），将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。

应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

【保存条件】4℃保存。

【注意事项】对人体有刺激性，请注意适当防护。

1.5MTris-HCL（pH8.8）(分离胶buffer)称量181.7gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加浓HCL调节所需要的pH值=8.8，将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。

（1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。

过滤后40C保存。

）【保存条件】4℃保存【注意事项】应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

SDS-PAGE一. 实验原理SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。

在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。

由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。

SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。

蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。

基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。

二. 试剂器材30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制；注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。

分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；电泳缓冲液(1L)：称取试剂Tris 3.03g和甘氨酸 14.4g置于500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液1.0mL，以双蒸水定容至1L (自然pH值为8.3，无需再调)，4℃ 贮存，可重复使用5-6次；2×加样缓冲液(10mL)：取下列试剂置于10mL塑料离心管中0.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8) 2.0mL10%SDS溶液 4.0mL甘油 2.0mL巯基乙醇 2.0mL溴酚蓝 0.02g，混匀后1mL分装，-70℃可贮存6个月；10%AP：称取(NH4)2S2O3 1.0 g，溶于10.0mL双蒸水中，分装成每份1mL，-20℃贮存；TEMED：分装成每份1mL，4℃避光贮存；水饱和正丁醇(100mL)：在玻璃瓶中加入50mL双蒸水和50mL正丁醇，振摇。