SDS-PAGE电泳操作流程—含考染 银染 碘染

XXX有限公司SDS-PAGE 电泳的测定方法文件编号XXXX-02制定部门研发部版本A/0页码1/3生效日期2014/4/9一、目的建立SDS-PAGE电泳的测定方法,确保电泳检测的准确性，保证电泳的安全性、有效性。

二、范围与权责适用于本公司的所有成品以及中间体的分析，由化验员负责采样检测。

品控主管负责审核。

三、原理SDS-PAGE电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS,SDS会与变性的多肽结合，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：lgMw=k-bX。

式中：Mw为分子量；X为迁移率；k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对数分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

四、实验仪器及试剂1.DYCZ-24DN 双垂直电泳仪2.DYY-8C 电泳仪电源3.STS-2A 脱色摇床（水平）4.标准蛋白Marker5.平皿：直径150mm6.TEMED:四甲基乙二胺7.DTT:二硫苏糖醇8.储存液①2M Tris-HCl缓冲液：称取24.2g Tris，用50ml蒸馏水溶解后，滴加HCl调节pH至8.8，待室温，加蒸馏水至100ml。

②1 M Tris-HCl缓冲液：称取12.1g Tris，用50ml蒸馏水溶解后，滴加HCl调节pH至6.8，待室温，加蒸馏水至100ml。

③10%SDS溶液：称取10g SDS ，加蒸馏水溶解至100ml。

④50%甘油：50ml甘油加50ml蒸馏水，混合均匀。

⑤1%溴酚蓝：100mg溴酚蓝，加蒸馏水至10ml，搅拌至完全溶解，水相针式过滤器过滤除去聚合的染料。

SDS-PAGE蛋白电泳标准操作----(纯度检测)一.目的：检测蛋白质的纯度是否达到生产抗体的要求。

二.依据：《分子克隆手册》，Ab-mart公司内部标准。

三. 职责：质量控制部。

四.试剂与水：所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。

五. 器皿与耗品：所有玻璃器皿使用前用玻璃清洁剂清洗, 80℃烤干。

tube、tip一次性使用。

六. 仪器设备：电泳仪（电源1--300V）电泳槽灌胶模具染色具凝胶扫描仪七. 环境要求：相对洁净环境，室温。

八. 溶液的配置：1.A液：1.5MTris·HCl pH8.8称取18.15gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至8.8,加超纯水定容至100 ml。

贴上标贴，4℃保存。

此溶液有效使用期限为三个月。

（溶液配置台帐见附件）2.B液: 1MTris·HCl pH6.8称取12.1gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至6.8,加超纯水定容至100 ml。

贴上标贴，4℃保存。

此溶液有效使用期限为三个月。

（溶液配置台帐见附件）3.C液: 30%丙烯酰胺称取29.2g丙烯酰胺(分析纯),0.8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺(分析纯), 加适量的超纯水溶解,再定容至100 ml,用滤纸过滤,。

贴上标贴，避光4℃保存。

此溶液有效使用期限为三个月。

（溶液配置台帐见附件）4.D液:10%SDS称取10gSDS(分析纯),用超纯水溶解至100 ml.贴上标贴，室温储存。

此溶液有效使用期限为三个月。

（溶液配置台帐见附件）5.E液:10%过硫酸胺称取10g过硫酸胺(分析纯), 用超纯水溶解至100 ml。

贴上标贴，-20℃保存。

此溶液有效使用期限为三个月。

（溶液配置台帐见附件）6.F液:TEMED(amersco)7.电泳缓冲液(10X)称取60.57g Tris碱(分析纯),288.268g甘氨酸(分析纯),20gSDS(分析纯),加超纯水定容至2000ml，临用前加超纯水稀释10倍，贴上标贴，室温储存。

蛋白质sds-page凝胶电泳实验步骤嘿，朋友们！今天咱就来讲讲蛋白质 SDS-PAGE 凝胶电泳实验那些事儿。

首先呢，得准备好各种材料和试剂，这就好比要出门得先把鞋穿好一样重要。

什么电泳槽啦、玻璃板啦、丙烯酰胺溶液啦等等，一个都不能少。

然后就是配胶啦！这就像做菜，得把各种材料按照一定的比例调好。

先配分离胶，小心翼翼地把各种溶液倒在一起，搅拌均匀，可别搅出气泡来哟，不然就像蛋糕里有了疙瘩，可不好看啦。

接着让它静置一会儿，等它凝固得差不多了，再倒上浓缩胶，这浓缩胶就像是给蛋糕加上一层漂亮的奶油。

胶配好啦，接下来就是上样啦！把处理好的蛋白质样品加到孔里，就好像是给小格子里放上宝贝。

这时候可得细心点，别把样品洒出来啦。

接着就是电泳啦！通上电，让蛋白质在电场里欢快地奔跑起来。

它们就像一群小朋友在赛跑，跑得快慢不一样，最后就分开啦。

在这个过程中，可别闲着呀，要时刻盯着，就像看着自己的宝贝在比赛一样。

看看电泳液有没有变少呀，电泳的情况怎么样呀。

等电泳结束啦，就可以染色啦！把胶放到染色液里泡一泡，就像给它洗个彩色的澡。

等染上颜色了，就能清楚地看到蛋白质的条带啦。

哎呀，你说这蛋白质 SDS-PAGE 凝胶电泳实验是不是很有趣呀？就像一场小小的冒险，每一步都充满了惊喜和挑战。

虽然过程可能有点繁琐，但当你看到那清晰的条带时，就会觉得一切都值得啦！就好像辛苦种的花儿终于开了一样开心。

所以呀，别害怕，大胆地去尝试吧！只要按照步骤一步一步来，肯定能做出漂亮的结果。

就像学走路一样，一开始可能会跌跌撞撞，但只要坚持，总会走得稳稳当当的。

加油哦，朋友们！相信你们一定能在蛋白质 SDS-PAGE 凝胶电泳实验中找到属于自己的乐趣和成就感！。

文件编号文件名称SDS-PAGE!胶电泳标准操作规程生效日期有效期至审批及颁发:部门签名日期起草质量部审核质量部批准质量受权人颁发质量部会审: 部门签名日期部门签名日期Copy-1Copy-2Copy-3Copy-4Copy-5Copy-6Copy-7Copy-8Copy-9Copy-10Copy-11Copy-12Copy-13Copy-14Copy-15文件编号文件名称SDS-PAGIE!胶电泳标准操作规程生效日期有效期至、目的建立重组人生长激素电泳检查标准操作规程，使中间产品检验有据可依、范围适用丁本公司中间产品“重组人生长激素”的电泳检查。

二、职责1质量部负责制定本规程。

2 QC人员负责按照本操作规程的规定操作，并做好记录。

3 QC室主任负责监督QC人员按照本规程的规定操作实施四、术语无五、内容1仪器、设备包压电源、垂直板泳槽和制胶模具。

2试剂2.1检查所需试剂是否在有效期内，未准备好的及时配制，缺少的试剂及时申购。

2.2所需试剂有：2.2.1 水：电阻率应不低丁18.2MQ .cm。

2.2.2 A 液：（1.5mol/L三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液）称取18.15g三羟基氨基甲烷，加适量水溶解，用盐酸调pH值至8.8，加水稀释至100ml。

2.2.3 B 液：30初烯酰胺-0.8%N, N'-业甲基双丙烯酰胺溶液（避光保存）。

2.2.4 C 液：1咐二烷基磺酸钠溶液。

2.2.5 D 液：10%3甲基乙二胺溶液。

2.2.6 E 液：10%±硫酸铉，临用前配置。

2.2.7 F 液：（0.5mol/L三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液）称取6.05g三羟基氨基甲烷加适量水溶解，用盐酸调pH值至6.8，加水稀释至100ml。

文件名称SDS-PAGE!胶电泳标准操作规程文件编号生效日期有效期至水溶解，用盐酸调PH值至8.3，加水稀释至1000ml。

2.2.9 供试品缓冲液：称取0.303g三羟基氨基甲烷，0.189ml盐酸，4ml甘油，2mg漠酚蓝, 0.8g十二烷基磺酸钠，加水溶解并稀释至10ml，此溶液用丁非还原SDS-PAGE如用丁还原SDS-PAGE则再加2m l6-筑基乙醇。

SDS-PAGE蛋白电泳检测标准操作规程（非还原还原）GOOD RESEARCH & DEVELOPMENT PRACTICESDS-PAGE蛋白电泳检测标准操作规程（还原&非还原）编号：SDS-PAGE蛋白电泳检测起草人：部门审核：QA审核：替代：□新订：□日期：日期：日期：修订号：0批准：年月日生效日期：年月日文件分发部门：GOOD RESEARCH & DEVELOPMENT PRACTICESDS-PAGE蛋白电泳检测编号：SDS-PAGE蛋白电泳检测一目的保证产品电泳电泳分子量和纯度检测按规范进行和检定结果的准确可靠。

二范围用于规范电泳电泳分子量和纯度的测定。

三责任质量控制部人员。

四内容1试剂与水：所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。

2 溶液的配制2.1A液：1.5MTris·HCl pH8.8称取90.75gTris碱(分析纯)加适量的超纯水（约400ml）溶解,用6M盐酸调pH值至8.8,加超纯水定容至500 ml。

贴上标贴，室温储存。

此溶液有效使用期限为三个月。

6M盐酸（调pH用）：浓盐酸50ml，加50ml纯化水，混匀。

2.2、B液: 0.5MTris·HCl pH6.8称取60.5gTris碱(分析纯)加适量的超纯水（约400ml）溶解,用6M盐酸调pH值至6.8,加超纯水定容至1000 ml。

贴上标贴，室温储存。

2.3C液: 30%丙烯酰胺-0.8%N,N-亚甲基双丙烯酰胺溶液称取300g丙烯酰胺(分析纯),8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺(分析纯), 加适量的超纯水溶解(一般500ml，因为丙烯酰胺具有溶胀性的特点),再定容至1000 ml,用滤纸过滤。

贴上标贴，避光4℃保存。

2.4D液:1%SDS称取2gSDS(分析纯),用超纯水溶解至200 ml.贴上标贴，4℃保存。

2.5E液:10%过硫酸铵GOOD RESEARCH & DEVELOPMENT PRACTICESDS-PAGE蛋白电泳检测编号：称取10g过硫酸铵(分析纯)，用超纯水溶解至100 ml，以1ml/支分装，贴上标贴，－20℃保存。

SDS-PAGE电泳的标准操作规程（编号：039）1、目的及适用范围SDS-PAGE电泳的分离原理，是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的净电荷，消除了蛋白分子的电荷效应，使蛋白按分子大小分离，主要用于蛋白质分子量的测定、蛋白质混合组分的分离和蛋白质亚基组分的分析等方面。

2、主要仪器恒压或恒流电源、垂直板、制胶模具3、试剂及配制方法试剂配制方法或要求H2O 电阻率不低于18.2 MΩ.cm1.5 M Tris-HCl 1.5 moL/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.830% Acrylamide 30% 丙烯酰胺溶液（避光保存）10% SDS 10% SDS溶液10% APS 10% 过硫酸铵溶液（临用前配制）TEMED TEMED溶液1 M Tris-HCl 1 moL/L Tris-HCl缓冲液，pH 6.815.1g、甘氨酸94 g、SDS 5 g，水稀释至1 L，pH 8.35×电极缓冲液 Tris2×Loading buffer 100 mM Tris-HCl（pH6.8）、4% SDS、0.2% 溴酚蓝、20% 甘油，用于非还原SDS-PAGE电泳，如用于还原SDS-PAGE电泳，则再加2% β-巯基乙醇5×Loading buffer 250 mM Tris-HCl（pH6.8）、10% SDS、0.5% 溴酚蓝、50% 甘油，用于非还原SDS-PAGE电泳，如用于还原SDS-PAGE电泳，则再加5% β-巯基乙醇考马斯亮蓝染色液 0.1%考马斯亮蓝R250、25%异丙醇、10%冰醋酸，水稀释至1 L考马斯亮蓝脱色液醋酸100 mL、乙醇50 mL、水850 mL4、操作步骤4.1 制胶：取合适的密封垫片和两块已清洁的干燥的玻璃板，组装成灌胶的模具，按下表制成分离胶，灌入模具内一定高度（一般离玻璃板上端3.5 cm），小心加水或异丙醇封顶（约0.5 cm高），室温下聚合（温度不同，聚合时间不同，20℃大约需30 min）。

垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一、实验目的学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。

二、实验原理蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。

当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。

聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。

本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。

由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。

这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。

同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。

在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。

不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。

由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。

如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。

SDS-PAGE操作流程——考染1、准备溶液30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide【配制方法】将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。

0.45µm微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存。

严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。

使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。

如有沉淀，可以过滤。

【保存条件】4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存【注意事项】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。

称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。

可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。

1MTris-HCL（pH6.8）(浓缩胶buffer)【配制方法】称量121.1gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加>0.7mL的浓HCL调节所需要的pH值（7.4-大约0.7mL，7.6-大约0.6mL，8.0-大约0.42mL），将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。

应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

【保存条件】4℃保存。

【注意事项】对人体有刺激性，请注意适当防护。

1.5MTris-HCL（pH8.8）(分离胶buffer)称量181.7gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加浓HCL调节所需要的pH值=8.8，将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。

（1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。

过滤后40C保存。

）【保存条件】4℃保存【注意事项】应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

文件号: QC-SOP-102 Page 1 of 4 Version: A/0 Print Date:题目：SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳---银染实验流程目的：为了使员工迅速掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳---银染实验而编写的操作过程。

范围：成员负责部门：QC Quality Assurance Department姓名签字日期起草人：批准人：QA：生效日期：文件号: QC-SOP-102 Page 2 of 4Version: A/0 Print Date:1.概要1.1 本操作流程用来描述SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳---银染的标准操作步骤。

2. 适用范围2.1本流程适用于操作人员进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳---银染实验的操作过程。

2.2 本流程适用于在普通实验室中进行操作。

3. 责权3.1质量保证部门有责任确保操作人员接受过该流程相关实验技术及操作的培训。

3.2质量保证部门有责任确保该流程操作完全按照以下规范进行。

3.3质量保证部门有责任定期检查修订本流程。

4. 材料准备4.1 试剂和溶液4.1.1 SDS丙烯酰胺凝胶电泳所需的溶液见SOP-QC-100 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验流程4.1.2 固定液30ml甲醇，12ml乙酸，50ml水，50 µl甲醛（100ml）4.1.3 漂洗液35%乙醇的水溶液4.1.4 致敏液0.02%硫代硫酸钠的水溶液4.1.5 银染液0.2%硝酸银的水溶液4.1.6 显色液6g碳酸钠，50µl甲醛，2ml致敏液，加水定容到100ml4.1.7 终止液38ml甲醇，12ml乙酸，加水定容到100ml4.1.8 保存液1%乙酸的水溶液4.1.9 分子量标准蛋白标准分子量参照物使用Fermentas公司的PageRuler（10KD~170KD）4.1.10 蛋白样品待分离的蛋白样品可为纯化的蛋白，也可为细胞裂解液。

4.2 设备：4.2.1 蛋白电泳仪公司BIO-RAD 电源型号PowerPac Universal4.2.2 单道可调式移液器公司Eppendorf文件号: QC-SOP-102 Page 3 of 4Version: A/0 Print Date:4.2.3电子天平公司Acculab4.3 耗材：吸头（T-20，T-200，T-1000，T-5000）烧杯( 50mL，三个)Eppendof离心管玻璃表面皿（2个）5. 相关文件5.1 SOP-PUB-EQU-009 PH计（PB-10型）的操作使用以及清洁保养5.2 SOP-PUB-EQU-010 Acculab电子天平操作、清洁与校准5.3 SOP-PUB-EQU-013 单道可调式移液器（Thermo/Gilson）的操作、清洁与校准5.4 SOP-QC-100 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验流程6. 操作步骤6.1. 参照SOP-QC-100 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验流程，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。

SDS-PAGE电泳的标准操作规程（编号：039）1、目的及适用范围SDS-PAGE电泳的分离原理，是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的净电荷，消除了蛋白分子的电荷效应，使蛋白按分子大小分离，主要用于蛋白质分子量的测定、蛋白质混合组分的分离和蛋白质亚基组分的分析等方面。

2、主要仪器恒压或恒流电源、垂直板、制胶模具3、试剂及配制方法试剂配制方法或要求H2O 电阻率不低于18.2 MΩ.cm1.5 M Tris-HCl 1.5 moL/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.830% Acrylamide 30% 丙烯酰胺溶液（避光保存）10% SDS 10% SDS溶液10% APS 10% 过硫酸铵溶液（临用前配制）TEMED TEMED溶液1 M Tris-HCl 1 moL/L Tris-HCl缓冲液，pH 6.8g、甘氨酸94 g、SDS 5 g，水稀释至1 L，pH 8.315.15×电极缓冲液 Tris2×Loading buffer 100 mM Tris-HCl（pH6.8）、4% SDS、0.2% 溴酚蓝、20% 甘油，用于非还原SDS-PAGE电泳，如用于还原SDS-PAGE电泳，则再加2% β-巯基乙醇5×Loading buffer 250 mM Tris-HCl（pH6.8）、10% SDS、0.5% 溴酚蓝、50% 甘油，用于非还原SDS-PAGE电泳，如用于还原SDS-PAGE电泳，则再加5% β-巯基乙醇考马斯亮蓝染色液 0.1%考马斯亮蓝R250、25%异丙醇、10%冰醋酸，水稀释至1 L考马斯亮蓝脱色液醋酸100 mL、乙醇50 mL、水850 mL4、操作步骤4.1 制胶：取合适的密封垫片和两块已清洁的干燥的玻璃板，组装成灌胶的模具，按下表制成分离胶，灌入模具内一定高度（一般离玻璃板上端3.5 cm），小心加水或异丙醇封顶（约0.5 cm高），室温下聚合（温度不同，聚合时间不同，20℃大约需30 min）。

1. 电泳完成后，用超纯水洗胶2次，每次洗涤5分钟。

2. 固定：将凝胶浸泡在 25 ml 的固定液中，固定液充分覆盖胶。

放于摇床上室温摇动 15 分钟。

更换固定液，重复一次。

固定液的配制：超纯水：乙醇：冰醋酸=6:3:1.3. 固定完成后，配制 10%乙醇，洗胶 2 次，每次洗涤 5 分钟。

4. 再用超纯水洗胶 2 次，每次洗涤 5 分钟。

5. 配制银染增敏工作液：取 50 ul Silver Stain Sensitizer（500×）加入到 25 ml 超纯水中，混匀。

6. 将步骤 4 洗好的凝胶置于银染增敏工作液中，室温下准确孵育 1 分钟（这里时间可以适当延长的），之后用超纯水洗胶 3 次，每次洗涤 20 秒。

7. 弃去超纯水，将凝胶置于 Silver Stain 中孵育 30 分钟（我做的时候是孵育45min-1h）。

8. 配制终止液：5%冰醋酸。

9. 用超纯水快速洗胶 3 次，每次洗涤 20 秒（时间不用很准确）。

10. 立即将洗好的凝胶浸没在 Silver Stain Developer 中，室温孵育 2-3 分钟，直至蛋白条带显示清晰（我做的时候室温孵育时间比较长，因为我也是为了找到差异条带打质谱的，10分钟甚至更长都是可以的，建议最好一直在旁边看着，直至出现满意的结果）。

11. 用终止液洗去凝胶上的 Silver Stain Developer 后，将凝胶浸泡在新的终止液中反应10 分钟。

(注：孵育是摇床速度调到最小，洗涤时速度要加快，和western洗膜的速度一样就行)用一般的SDS-PAGE胶就可以。

1. 分离胶(12%)配制所需试剂所需体积分离胶(12％) 30％丙烯酰胺 6.0 ml1.5 mol/l Tris-HCl 3.8 ml10%SDS 150 μl10%过硫酸铵 150 μlTEMED 6 μl蒸馏水 4.9 ml2. 浓缩胶(5%)配制所需试剂所需体积浓缩胶(5％) 30％丙烯酰胺 1.3 ml1.5 mol/l Tris-HCl 1.0 ml10%SDS 80 μl10%过硫酸铵 80 μlTEMED 8 μl蒸馏水 5.5 ml3. 分离胶缓冲液(pH8.9)配制所需试剂所需体积分离胶缓冲液Tris 36.6 g1 mol/l HCl 48 ml蒸馏水补足至100 ml4. 浓缩胶缓冲液(pH6.7)配制所需试剂所需体积浓缩胶缓冲液（pH6.7）Tris 5.98 g1 mol/l HCl 48 ml蒸馏水补足至100 ml5. 30%丙烯酰胺(pH≤7.0)配制所需试剂所需体积30%丙烯酰胺（pH≤7.0）丙烯酰胺29 g甲叉-双丙烯酰胺 1 g蒸馏水补足至100 ml6. 10%过硫酸铵(W/V)：1g过硫酸铵溶于10ml水中，4℃保存数周，尽量现用现配。

SDS-PAGE一. 实验原理SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。

在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。

由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。

SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。

蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。

基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。

二. 试剂器材30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制；注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。

分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；电泳缓冲液(1L)：称取试剂Tris 3.03g和甘氨酸 14.4g置于500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液1.0mL，以双蒸水定容至1L (自然pH值为8.3，无需再调)，4℃ 贮存，可重复使用5-6次；2×加样缓冲液(10mL)：取下列试剂置于10mL塑料离心管中0.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8) 2.0mL10%SDS溶液 4.0mL甘油 2.0mL巯基乙醇 2.0mL溴酚蓝 0.02g，混匀后1mL分装，-70℃可贮存6个月；10%AP：称取(NH4)2S2O3 1.0 g，溶于10.0mL双蒸水中，分装成每份1mL，-20℃贮存；TEMED：分装成每份1mL，4℃避光贮存；水饱和正丁醇(100mL)：在玻璃瓶中加入50mL双蒸水和50mL正丁醇，振摇。

SDS-PAGE蛋白电泳标准操作----(纯度检测)一.目的：检测蛋白质的纯度是否达到生产抗体的要求。

二.依据：《分子克隆手册》，Ab-mart公司内部标准。

三. 职责：质量控制部。

四.试剂与水：所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。

五. 器皿与耗品：所有玻璃器皿使用前用玻璃清洁剂清洗, 80℃烤干。

tube、tip一次性使用。

六. 仪器设备：电泳仪（电源1--300V）电泳槽灌胶模具染色具凝胶扫描仪七. 环境要求：相对洁净环境，室温。

八. 溶液的配置：1.A液：1.5MTris·HCl pH8.8称取18.15gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至8.8,加超纯水定容至100 ml。

贴上标贴，4℃保存。

此溶液有效使用期限为三个月。

（溶液配置台帐见附件）2.B液: 1MTris·HCl pH6.8称取12.1gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至6.8,加超纯水定容至100 ml。

贴上标贴，4℃保存。

此溶液有效使用期限为三个月。

（溶液配置台帐见附件）3.C液: 30%丙烯酰胺称取29.2g丙烯酰胺(分析纯),0.8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺(分析纯), 加适量的超纯水溶解,再定容至100 ml,用滤纸过滤,。

贴上标贴，避光4℃保存。

此溶液有效使用期限为三个月。

（溶液配置台帐见附件）4.D液:10%SDS称取10gSDS(分析纯),用超纯水溶解至100 ml.贴上标贴，室温储存。

此溶液有效使用期限为三个月。

（溶液配置台帐见附件）5.E液:10%过硫酸胺称取10g过硫酸胺(分析纯), 用超纯水溶解至100 ml。

贴上标贴，-20℃保存。

此溶液有效使用期限为三个月。

（溶液配置台帐见附件）6.F液:TEMED(amersco)7.电泳缓冲液(10X)称取60.57g Tris碱(分析纯),288.268g甘氨酸(分析纯),20gSDS(分析纯),加超纯水定容至2000ml，临用前加超纯水稀释10倍，贴上标贴，室温储存。

SDSPAGE原理和流程操作步骤详解SDS-（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种电泳技术，用于分离蛋白质。

它是目前最常用的蛋白质分离方法之一、以下将详细介绍SDS-的原理和操作步骤。

一、原理SDS-利用凝胶电泳原理，在电场作用下，将蛋白质按照其分子量大小分离。

其中SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）是一种阴离子表面活性剂，它会使蛋白质解离成单个多聚体，并赋予了所有蛋白质相同的电荷密度，使其仅以分子量来分离。

此外，SDS还能够疏水化蛋白质，使其保持线性构象。

二、流程操作步骤1.制备凝胶：a.准备获得所需蛋白质分子量范围内的分离凝胶（通常为8-20%)和浓缩凝胶（通常为4%）。

b.根据实验需要，自制聚丙烯酰胺凝胶，或购买预铸凝胶片。

c. 使用缓冲液（常见的是Tris-HCl缓冲液）将凝胶片激活。

d.将激活的凝胶放在垂直电泳仓中，然后在最上层加入新鲜的蒽胺溶液以形成平整的上胶液面。

2.蛋白质样品处理：a. 将样品蛋白质进行还原处理，可以使用还原剂如β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）或二巯基甘油（dithiothreitol）。

b.加入相应体积的SDS缓冲液（含有SDS和甘油），将样品加热至100°C，以使其完全变性。

c.在样品中加入跟踪染色剂，常用的有溴酚蓝。

3.加载样品：a.打开电泳仓的盖子并插入试验板。

b.将样品架（通常是细长的注射器或者微量吸管）插入样品孔中，并缓慢地向内注入样品。

c.尽量确保样品的数量均匀，然后小心地将试验板放入电泳槽中。

4.电泳：a. 确保试验板完全浸没在含有缓冲液（如Tris-Glycine缓冲液）的电泳槽中。

b.调整电泳仓的参数，如电流和电压。

c.开启电源，运行电泳，直到跟踪染色剂移动到凝胶底部。

5.凝胶染色和成像：a.将凝胶从电泳槽中取出，并进行染色。

垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一、实验目的学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术.二、实验原理蛋白质是两性电解质,在一定的pH条件下解离而带电荷。

当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。

聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。

本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率.由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。

这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。

同时，在制备上层胶（浓缩胶）和下层胶（分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7-6.8，下层胶pH＝8。

9；Tris—HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。

在pH6。

8时，缓冲液中的Gly—为尾随离子,而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性,控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。

不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后,各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。

由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应,使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离.如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS），由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合,形成带负电性的蛋白质-SDS复合物；此时,蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。

SDS-PAGE电泳标准操作规程（网上）3.程序：3.1. 制胶3.1.1组装胶架将洁净、无水的玻片对齐，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭头向上，并确保下端平齐。

放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。

3.1.2 分离胶的配置梳齿下缘约1cm)。

3.1．2.3液封在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，使胶面平整。

静置约30min观察胶面变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干残留的水液。

3.1.3浓缩胶的配置3.1.3.1 5%浓缩胶配方下表：3.1.3.2插入制胶梳混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方)，轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。

约30分钟，聚合完全。

3.2. 电泳3.2.1 安装电泳槽将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。

两块10%的凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。

将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。

倒入1X tris-gly电泳缓冲液。

3.2.2 样品处理对于蛋白样品直接取80µl的样品，依次加上20µl 5x buffer (加了B-巯基乙醇)，混匀。

对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul 2x buffer (加了B-巯基乙醇)煮沸10分钟。

3.2.3 加样用移液枪取处理过的样品溶液10μl，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker 加入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。

3.2.4 电泳将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。

电压调至约150v保持恒压。

待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。

3.2.5剥离胶把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，再把浓缩胶刮掉，取下。

3.3. 染色放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，完成后染液倒掉并用水洗掉染液。

SDS-PAGE电泳标准操作规程（网上）3.程序：3.1. 制胶3.1.1组装胶架将洁净、无水的玻片对齐，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭头向上，并确保下端平齐。

放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。

3.1.2 分离胶的配置梳齿下缘约1cm)。

3.1．2.3液封在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，使胶面平整。

静置约30min观察胶面变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干残留的水液。

3.1.3浓缩胶的配置3.1.3.1 5%浓缩胶配方下表：3.1.3.2插入制胶梳混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方)，轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。

约30分钟，聚合完全。

3.2. 电泳3.2.1 安装电泳槽将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。

两块10%的凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。

将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。

倒入1X tris-gly电泳缓冲液。

3.2.2 样品处理对于蛋白样品直接取80µl的样品，依次加上20µl 5x buffer (加了B-巯基乙醇)，混匀。

对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul 2x buffer (加了B-巯基乙醇)煮沸10分钟。

3.2.3 加样用移液枪取处理过的样品溶液10μl，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker 加入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。

3.2.4 电泳将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。

电压调至约150v保持恒压。

待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。

3.2.5剥离胶把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，再把浓缩胶刮掉，取下。

3.3. 染色放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，完成后染液倒掉并用水洗掉染液。

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