DNA和蛋白银染步骤(独门绝技--有图)

常用的蛋白质染色试剂分为已考马斯亮蓝为代表的有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。

其中考马斯亮蓝染色法的应用较为广泛，现将其与其他的蛋白质染色方法（主要是银染法）作一比较，帮助大家更好地去选择合适的蛋白质染色方法。

蛋白质的染色常用的有4类：有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色.其中有机试剂染色以考马斯亮蓝染色法（Coomasie brilliant blue,CBB)为代表,在蛋白质分析中常用,但对低丰度蛋白质的显现较差；银染灵敏度虽高,却常与质谱不兼容；荧光染色以SYPRO试剂为主，蛋白质检测灵敏度高,能兼容质谱,但由于需要配备特殊的检测仪器及试剂的昂贵，未被作为常规方法使用；而同位素显色则存在安全性和操作局限性等问题。

因此，筛选简便、节约、检测灵敏度高、质谱兼容的蛋白质着色法是蛋白质组研究所需。

由于考马斯亮蓝染色法的广泛运用，近年来就考马斯亮蓝染色法在提高其灵敏性方面研究者们作了许多改进，方法众多，评价不一.我们在作双向凝胶电泳时，将常用的几种考马斯亮蓝染色法及银染进行了比较，并就其染色影响因素作出分析。

试剂固相pH梯度干胶条(IPG strip pH3—10NL,IPG strip pH5—8,17cm)、urea、CHAPS、TBP、DTT、Bio—Lyte 3/10 Ampholyte、IAM、SDS、Tris、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、CBB-G250均为BIO-RAD公司产品。

硫酸铵及磷酸均购自成都科龙试剂厂.AgNO3为Sigma公司出品。

Protein molecular weight marker ＃SW0431为MBI公司出品.甲醛、Na2S2O3与Na2CO3分别为成都天华科技股份有限公司、重庆北碚化学试剂厂和天津市塘沽鹏达化工厂产品。

仪器IPGphor等电聚焦仪、proTEANⅡ垂直电泳仪、Power PAC1000电泳仪、加样溶胀槽、GS—800 Calibrated Densitometer扫描仪、PDQuest凝胶图像分析软件均为BIO-RAD公司产品。

银染质谱脱色银染质谱脱色是一种常见的实验技术，广泛应用于蛋白质研究中的质谱分析和蛋白质组学研究中。

通过银染质谱脱色技术，我们可以实现对复杂样品中蛋白质的分离、鉴定和定量分析。

下面将从原理、方法和应用三个方面进行详细介绍。

一、原理银染质谱脱色技术是在传统的银染技术基础上发展而来的。

传统的银染技术利用氨基化银络合物与蛋白质中的氨基酸残基和硫醇基团反应，生成一种可见的银沉淀物，从而实现对蛋白质的染色和检测。

而银染质谱脱色技术则在银染的基础上引入了脱色步骤，通过选择性脱除与银染原料不结合的污染物，使得质谱分析所需的样品纯净度得以提高。

常用的脱色方法包括硫代醇还原、溶解交换和鹰式脱色等。

其中，硫代醇还原法是最常用的方法，它可以有效地去除银染剂和产生的银盐，使蛋白质样品能够更好地适应质谱分析的要求。

二、方法1. 样品准备：将待分析的蛋白质样品经过酯胶电泳分离后，将蛋白质条带剪下，并将其放置在含有染料的染色溶液中进行染色反应。

2. 染色反应：将蛋白质条带置于银染溶液中，经过适当时间的染色反应，直至蛋白质条带呈现可见的银染色。

3. 脱色处理：将银染后的蛋白质条带接受脱色处理，通常采用硫代醇还原法。

首先，将蛋白质条带转移到脱色溶液中，作为还原剂的硫代醇将银离子还原为金属银，同时还会发生与氨基酸残基和硫醇基团的结合。

然后，将脱色溶液去除，再进行洗涤处理。

4. 洗涤处理：将脱色处理后的蛋白质条带经过多次洗涤，以除去硫代醇和其他污染物。

常用的洗涤溶液包括酒精、甲醇和乙醇等有机溶剂，以及去离子水等。

5. 干燥处理：将洗涤后的蛋白质条带放置于通风良好的环境中进行干燥处理，或利用专用的脱水设备进行脱水处理。

三、应用银染质谱脱色技术在蛋白质组学研究和质谱分析中扮演着重要的角色，具有以下应用价值：1. 蛋白质分离与鉴定：银染质谱脱色技术能够高效地分离和检测蛋白质，为蛋白质的鉴定提供重要依据。

通过与质谱分析相结合，可以准确地鉴定蛋白质样品中的各个组分。

银染方法1.搪瓷盘中倒入2000ml左右70%乙醇，把胶做好标记卸入乙醇中，摇床上固定15min2.回收乙醇(可重复用3-5次)，蒸馏水洗2遍，每遍2-3min，尽可能把水倒净3.190ml蒸馏水中加入3.6%的NaOH4.2ml、20%AgNO33.6ml、氨水2ml混匀配成染色液。

倒入染色液，染色30min。

4.倒掉染色液，蒸馏水洗3遍，每遍2-3min，尽可能把水倒净5.200ml蒸馏水中加入1%柠檬酸钠1ml，甲醛100ul混匀配成显色液。

倒入显色液显色至清晰。

6.倒掉显色液，加蒸馏水停显，并洗2-3遍测序板的硅化处理1:每块玻璃板的面都需硅化处理，以防止凝胶与两块玻璃板紧贴并减少电泳完毕后从胶模中取出凝胶时凝胶发生破裂的可能性。

硅化方法为；将拟硅化的玻璃板置于通风橱中，并戴手套操作，在拟硅化板面上加2-3ml 5％二氯二甲基硅烷(二氯二甲基硅烷5％溶于氯仿中)，用纸巾将硅化液涂布均匀，然后用去离子水洗净玻璃板,再用乙醇冲洗后晾干。

如需要从玻璃板上去除原有的硅，可用KOH-甲醇擦拭之。

KOH-甲醇配制为100ml甲醇中加5g片状KOH即可。

测序板的硅化处理2:1.浓度：4%二氯二甲基硅烷2.成分：二氯二甲基硅烷，三氯甲烷4.用途：制备聚丙稀酰胺凝胶时，可用Repel-silane处理小玻板，使凝胶易于剥离。

5.使用方法：测序用玻璃板必须彻底洗净。

先用温水和洗涤剂洗净，用水洗掉洗涤剂,再用去离子水冲洗干净。

最后用乙醇洗板。

1）长玻璃板的处理每次铺胶前均需用亲和硅烷对长玻璃板进行处理。

1、用镜头纸蘸取亲和硅烷溶液少许（1ml左右），涂在长玻璃板上。

要将整块板都涂满、涂匀。

2、4~5分钟后，用95%乙醇洗长玻璃板三次，以去除多余的亲和硅烷。

2）短玻璃板的处理每次铺胶前均需用剥离硅烷对短玻璃板进行硅化处理。

1、处理短玻璃板前先更换手套，以防与亲和硅烷交叉污染。

2、用镜头纸蘸取剥离硅烷溶液适量（1.5ml左右），涂在短玻璃板上。

试剂准备（所有试剂均用超纯水制备）：
1）固定液：甲醇50ml，乙酸12ml，甲醛（37%）135ul，加水至100ml；
2）35% 乙醇；
3）2% Na2S2O3：0.1克Na2S2O3用水稀释到5ml使用；
4）染色液（现配现用）：AgNO3 0.1g，甲醛（37%）100ul，加水至50ml；
5）显色液（现配现用）：Na2CO36g，甲醛（37%）135ul，Na2S2O3（2%）20ul，加水至100ml；
6）终止液：甲醇50ml，乙酸12ml，加水至100ml。

步骤：
1）取下2.7电泳分离蛋白样品后的聚丙烯酰胺凝胶，泡在固定液中，摇床上低速、室温固定2h或过夜（以下步骤均可摇床上低速晃动完成）；
2）弃去固定液，加入35%乙醇洗涤，隔20min换新的35%乙醇再次洗涤，共洗三次；
3）弃去35%乙醇，于0.02%的Na2S2O3溶液中激活凝胶，2min；
4）弃去3）的Na2S2O3溶液，用高纯水洗涤凝胶三次，每次5min；
5）弃去高纯水，用染色液浸泡凝胶，染色20min；
6）弃去染色液，用高纯水洗涤凝胶两次，每次1min；
7）弃去高纯水，加入显色液，密切关注显色情况，以清晰看到条带为宜；
8）弃去显色液，加入终止液，5min；
9）弃去终止液，凝胶可泡在1%的乙酸溶液中，4℃保存。

一、实验名称：银染法-电泳检测目标条带
二、实验目的：测定样品中蛋白组成
三、实验材料
1.主要试剂耗材
名称厂家/品牌
30%丙烯酰胺SIGMA
三羟甲基氨基甲烷Amresco
十二烷基硫酸钠（SDS）北京新经科生物技术有限公司
氯化钠北京化工厂
四、实验内容：
A.加样量计算
B.样品定量，浓度计算，吸取等量的待测样品至各EP管中，向管中加入适当体积的5×SDS凝胶加样
缓冲液，100℃加热5min，使蛋白变性。

C.小心拔出上样梳，按预定的顺序加样，上样量根据所选板子的厚度而定，在预留的一个上样孔中
加入分子量Maker
D.样品煮沸10分钟，13000rpm离心5分钟，取上清。

E.开始电泳，电压150V 跑70min。

F.结束电泳，将15%胶拆开固定15min—水洗6min—致敏5min—水洗1min—银染15min—水洗5s—
显色至条带清晰—终止1min后换水保存。

银染核仁组织区技术方法及应用
银染核仁组织区技术是一种常用的细胞学染色方法，主要用于观察细胞核仁的形态和数量，并且在病理学检测中有着广泛的应用。

该技术利用银离子的亲和性，使核仁区的核糖体DNA成为黑色或棕色的颗粒，从而使其在显微镜下更加清晰可见。

具体的方法是先将组织切片，并进行脱水和脱蜡处理。

随后在核仁区添加银离子染剂，并通过还原剂促进银离子的还原，使染剂和核糖体DNA发生反应，形成黑色或棕色颗粒。

最后使用显微镜观察细胞核仁的形态和数量。

银染核仁组织区技术在病理学中有着广泛的应用，例如在肿瘤组织中观察核仁大小和数量的变化，以及诊断癌症和炎症等疾病时，都可以使用该技术。

此外，该技术还可以在细胞生物学研究中用于观察细胞核仁的形态和数量变化，从而深入探究细胞的功能和调节机制。

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银染是一种常用的蛋白质染色方法，具有较高的灵敏度，可以染出SDS-PAGE胶中含量低至0.2ng的蛋白。

虽然这是protocol上的说法，但如果操作得当，检测到5ng左右的蛋白应该不成问题。

如果搜索银染的protocol，可能会得到许多种说法。

为什么这样一种重要的实验手段却得不到统一的应用呢？这可能要从银染本身那复杂而又灵活的原理说起。

简单的讲，银染的原理就是将银离子还原，附着在蛋白表面，形成染色。

银染所用的银，基本上是基于两种试剂，一种是硝酸银，另一种是Silver diammine。

基于硝酸银的应用要多于后者（据说Silver diammine比较费“银子”），现在主要说说基于硝酸银的银染的原理。

银离子容易被还原，在PAGE胶上，哪里的银离子先开始被还原，哪里就先开始出现条带。

通常由于蛋白质结构上的复杂性，一部分银离子结合在蛋白质之上后会影响更多银离子的结合，所以有蛋白的地方银离子较少，如果不做任何处理，有蛋白的部位将会染色更浅，所以最初的银染是负染。

那最初的负染是如何演变成正染色的呢？一方面是选用还原速度较慢的还原剂，如甲醛，另一方面，利用慢还原争取到的时间将胶上多余的银离子洗去，由于银离子对蛋白质有一定的结合力，故更多地保留在有蛋白的位置，于是形成了正染。

但是这种染色的方法灵敏度还不是很高，所以人们又在染色之前加入了敏化的步骤，能够使银染敏化的试剂很多，一类是增加蛋白质与银离子的结合位点，如SDS等；还有一类能使银离子和蛋白形成silver sulfide等结合，硫代硫酸盐起到的就是这个作用；还有的试剂兼顾上述两种功能，如戊二醛。

通过敏化过程，银染的灵敏度大大增加，同时也降低了背景。

综上，银染的原理概括如下：让银离子尽可能多的于蛋白结合，尽可能的洗掉胶上的银离子，然后还原显色。

各种各样的protocol基本上都是基于这个原理。

最为经典的一个版本是这样的：谈谈其中一些具体步骤：1. 固定，固定的作用主要是使蛋白变性，防止蛋白在扩散2. 敏化，戊二醛和硫代硫酸钠都是增加蛋白和银离子的结合，但是做质谱兼容银染的时候一般都把戊二醛去掉，原因是对蛋白造成修饰（在我的实验中，有戊二醛存在的时候一般也能鉴定到蛋白，不知道是不是去掉更好）。

银染aav纯度鉴定原理银染（Silver Staining）是一种常用的蛋白质染色技术，非常适用于核酸电泳分析和研究。

而纯度鉴定是确保蛋白质样品中目标蛋白的含量高，且无杂质的重要步骤。

在银染aav （Adeno-Associated Virus，腺相关病毒）纯度鉴定中，我们可以采用以下原理：1.样品制备：将含有目标aav的样品进行破碎和裂解，释放出其中的蛋白质。

经过离心等步骤，得到蛋白质上清液。

这是进行纯度鉴定的起点。

2.蛋白质凝胶电泳：将样品中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。

通常使用的是SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）技术，它能够使蛋白质在电场中按照分子量进行迁移。

3.银染法：将经过电泳分离的蛋白质在凝胶上进行银离子反应，形成深紫色或黑色的沉淀，从而可视化蛋白质的分布情况。

银染法对蛋白质含量敏感，且具有较高的分辨能力。

4.分析结果评估：通过观察银染后的凝胶，我们可以根据目标aav蛋白与其他蛋白质之间的迁移距离和沉淀程度，来初步评估样品中目标蛋白的纯度。

较高的纯度将表现为目标蛋白清晰的单个带状沉淀。

5.图像分析：使用图像分析软件可以量化评估银染结果，测量蛋白质带状沉淀的强度和宽度，进而计算出目标蛋白的相对含量。

这种定量分析可以更精确地确定aav样品的纯度。

总结而言，银染aav纯度鉴定基于蛋白质的分离和银染反应，通过观察和分析蛋白质在凝胶上的迁移和沉淀情况，可以初步评估目标蛋白的纯度，并通过图像分析软件进行定量评估。

这种方法可帮助研究人员确保aav样品中目标蛋白质的高纯度和可靠性，为后续实验和应用奠定基础。

小板8%聚丙烯酰胺胶电泳⑴封口 1%的Agarose或卡拉胶封口，每块板用5mL即可，凝固20min-30min⑵上板下部的3个旋钮用扳手拧紧一些，上面的2个手拧，这样不容易漏缓冲液制胶，每块胶灌20mL,灌完一槽插梳子，凝固40min-60min100mL 120mL（一般跑10个槽，制3瓶120mL即可）ddH2O 70mL 84mL10ⅹTBE 10mL 12mL40%聚丙烯酰胺 20mL 14mLTenmed 100uL 120uL10%APS 1000uL 1200uL天气热容易凝固，可以每次少配点，Tenmed，1%APS也可以少加些⑶向跑好PCR的96孔板中每管加入4ul的lodding buffer⑷倒入0.5ⅹTBE电极缓冲液，没过短玻璃，2边电极也要有一定量缓冲液，电泳过程中若有滴漏，及时补充接电泳仪，160V 跑2.5h 看指示剂大概都跑到胶底边即可⑸卸板，准备银染小板银染⑴固定2次6min 倒掉，第2次回收待用450mL ddH2O + 50mL 无水乙醇 + 2.5mL冰醋酸⑵银染 12min 倒掉500mL ddH2O + 1g AgNO3⑶清洗2次，倒掉500mL ddH2O 洗30s500mL ddH2O + 120uL Na2SO3 洗30s⑷显色到显色为止倒掉500mL ddH2O + 7.5g NaOH + 1500uL 甲醛⑸用固定液再洗一次，再用ddH2O洗一次⑹保鲜膜包盖，晾干，待观察，选择出多态性好的引物对大板6%聚丙烯酰胺胶电泳⑴洗短板和耳板，洗到水能自然留下，不挂水珠为洗干净⑵干净的一面朝上垫平，到上无水乙醇，用干净手纸，按从远到近一个方向擦拭到酒精蒸干⑶耳板上到亲和硅烷，短板上到剥离硅烷，用干净手纸，按从远到近一个方向擦拭到硅烷都蒸干⑷用擦过剥离硅烷的纸擦拭侧条，之后和耳板耳内缘对齐平放在耳板上，将短板盖在上面，对齐底边，2侧各夹2个夹子固定⑸配好的6%聚丙烯酰胺胶60mL10%APS 300uLTenmed 60uL混匀从耳板上部灌入，不时敲打让整个缝隙内都充满胶，上部不要近气泡，用梳子平头插入板间，梳子上的洞与短板平齐，凝固1-2小时待用⑹拔出梳子，将碎胶用纯水冲出，也可用梳子拨出，洗净板面，并擦干⑺上板，固定住，上下分别到入相应缓冲液，用洗耳球吹打，把气泡赶出，将梳子齿端插入胶一点，用洗耳球吹杂质，把气泡赶出，恒功率70w 20min 预电泳⑻向跑好PCR的96孔板中每管加入6ul的lodding buffer 变性剂 PCR仪 95℃ 5min 变性之后放入冰水混合物中降温，保持低温，准备点样⑼向梳子空隙单枪点样 8uL⑽恒功率 70w ，保证电压在 1300-1490V 电泳 1h⑾停止电泳仪，上下部缓冲也分别回收，卸板,准备银染大板银染每块板一个槽⑴固定 7min 取出1800mLddH2O + 200mL无水乙醇 + 10mL冰醋酸⑵银染 10min 取出2000mLddH2O + 3g AgNO3 + 3mL甲醛⑶清洗 10-15s 取出2000mL ddH2O⑷显色 5min 漂胶前停止取出2000mL ddH2O +30g NaOH + 4mL 甲醛⑸用⑴中固定液再洗一次 2min⑹清洗 5min 取出晾干2000mL ddH2O。

ptotocol是这样的，请看哪里不妥：蛋白银染步骤步骤溶液时间固定甲醇100ml冰醋酸25ml加双蒸水至250ml 30min冲洗双蒸水3次敏化甲醇75ml戊二醛（25%w/）1.25ml硫代硫酸钠(5%w/) 10ml醋酸钠（17g）加双蒸水至250ml 30min冲洗双蒸水3次银反应硝酸银溶液(2.5%w/) 25ml甲醛(37%w/) 0.1ml加双蒸水至250ml 20min冲洗双蒸水2次显色碳酸钠(6.25g)甲醛(37%w/) 0.05ml加双蒸水至250ml2-5min终止EDTA-Na22H2O(3.65g)加双蒸水至250ml 10min冲洗双蒸水3次建议使用silia的方法！！简单，快！本人的银染方法：1. 固定：100ml MeOH, 24ml H Ac, 56ml 0.04%HCHO, 20ml ddH2O,洗三次，每次>=20分钟；2. 50％EtOH洗PAGE胶三次，每次20分钟；3. 预处理：0.02％Na2S2O3 处理一分钟；4. 水洗：ddH2O漂洗三次，每次20秒；5. 染色：0.8ml 20％AgNO3+72ml 0.04%HCHO处理PAGE胶20分钟；6. 水洗：同上；7. 显色：25ml 12％Na2CO3, 24ml 0.04%HCHO, 1ml 0.02％Na2S2O3, 漂洗10－15分钟；8. 水洗：同上；9. 终止：50％MeOH, 12％H Ac,10分钟。

以上步骤从中科院生化所学来，过程和silia 的基本一致，不知道是否有出入，请大家指正。

谢谢！！！5.2.2.3 银染色1 银染液1（1000ml）：甲醇50％乙酸12％甲醇500ml 冰醋酸120ml2 银染液2（1000ml）：甲醇30％，乙酸钠0.4M，戊二醛0.5%，硫代硫酸钠0.1%，（含乙酸1－2ml）甲醇300ml 乙酸钠54.4g 戊二醛10ml 硫代硫酸钠1g 乙酸1－2ml3 显色液(1000ml) 无水碳酸钠2.5% 甲醛0.02%无水碳酸钠25g，甲醛1.5ml4 硝酸银（100ml）：20%硝酸银（过滤后待用）染色步骤：1 银染液1 洗2次，每次5分钟2 银染液2 洗1次，每次30分钟3 超纯水洗2次，每次1分钟4 0.5%硝酸银洗30分钟5 超纯水洗5次，每次1分钟（关键步骤，共计5分钟）显色液显色6 看到各条带，则倾去显色液, 1％乙酸中止我感觉浸银后、显色前的水洗非常关键，时间不能太长，次数不能太多，否则可能会染不上颜色。