大豆花叶病毒诱导的应用于膜蛋白酵母双杂交的大豆cDNA文库构建

模块七蛋白质之间的相互作用1. 实验目的本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。

主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术; 让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用; 掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。

2. 实验原理1989年 Fields 和 Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识(即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与 ,提出并建立了酵母双杂交系统。

该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台,近几年得到了广泛的运用和发展。

相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(1检测在真核活细胞内进行,在一定程度上代表细胞内的真实情况。

(2作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。

(3检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。

(4酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。

(5 通过 mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。

同时,酵母表型、 X-Gal 及HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。

酵母双杂交系统也具有一定的局限性。

首先, 经典的双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内, 因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白的研究。

酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性” 。

在酵母双杂交系统建立的初期阶段,由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系,这种报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制,因此容易产生假阳性。

由于某些蛋白本身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使 DNA 结合结构域融合蛋白在无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。

另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域, 能与其他蛋白形成稳定的复合物,从而引起报告基因的表达,产生“假阳性”结果。

白背飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建薛进;李静;羊健;唐彦;梁瑶;陈剑平;张恒木【摘要】白背飞虱(Sogatella furcifera Horváth)作为一种迁飞性害虫,不仅自身危害水稻,而且以持久性方式传播南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV).为了研究白背飞虱与SRBSDV之间的相互作用,需要构建一个高质量的酵母筛选文库,试验利用Gateway技术构建了白背飞虱cDNA 酵母表达文库,检测分析显示,白背飞虱初级文库库容量约为1.72×107 CFU,cDNA 插入片段主要分布在500~2000 bp,重组率约为95.8%;次级文库库容量约为1.73×107 CFU,cDNA插入片段主要分布在400~2000 bp,重组率为100%;Y187酵母菌株的白背飞虱酵母双杂交cDNA文库库容量约5.09×107 CFU,插入片段大小在750~2000 bp,重组率100%,再随机挑选36个单克隆进行测序分析,所得结果与GenBank数据库比对显示36个克隆中含有22个不同的基因,长度在750~2000 bp,这些分析表明,该文库可以用于酵母双杂交的后续筛选,为研究白背飞虱与SRBSDV之间的互作奠定了基础.%White-backed planthopper( Sogatella furcifera Horváth) is a major migratory pest that feed on rice plants and transmit Southern rice black-streaked dwarf virus (SRBSDV) in a persistent manner.In order to screen interac-tions between the genes of WBPH and SRBSDV , a cDNA expression library of WBPH was firstly constructed into the yeast plasmids using Gateway technique in this study .The results showed that the primary library consisted of 1.72 × 107 CFU (colony-forming units), the sizes of most inserts were 500-1500 bp in length, and the recombinant fre-quency was about 95.8%;the titer of secondary cDNA library was 1.73 ×107 CFU, the sizes of most inserts were400-2000 bp in length , and the recombinant frequency was 100%; the titer assays showed that the cDNA library was approximately 5.09 ×107 CFU for yeast two-hybrid cDNA library of Y187;PCR assays showed that the average length of insertions were 750-2000 bp and the recombinant frequency of the cDNA library was high up to 100%,random sequence analysis of 36 clones showed that 22 of the clones were different in GenBank .These results consist-ently indicated that the cDNA library could be used for screening interactions in the yeast two hybrid experiments , which laid the foundation for studying on the interactions between white -backed planthopper and SRBSDV .【期刊名称】《浙江农业学报》【年(卷),期】2017(029)012【总页数】8页(P2060-2067)【关键词】白背飞虱;南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV);Gateway技术;酵母双杂交;cDNA文库【作者】薛进;李静;羊健;唐彦;梁瑶;陈剑平;张恒木【作者单位】植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室湖南农业大学植物保护学院病毒研究所,湖南长沙410128;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,浙江杭州310021;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,浙江杭州310021;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,浙江杭州310021;植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室湖南农业大学植物保护学院病毒研究所,湖南长沙410128;湖南农业大学东方科技学院,湖南长沙 410128;植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室湖南农业大学植物保护学院病毒研究所,湖南长沙410128;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,浙江杭州310021;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,浙江杭州310021【正文语种】中文【中图分类】S435.11广泛分布在东亚地区的为害水稻的白背飞虱(Sogatella furcifera Horvth)属于半翅目(Hemiptera)同翅亚目飞虱科(Delphacidae)的迁飞性昆虫[1-3]，是最常见的3种稻飞虱之一，每年春天随大气环流方向从中南半岛、东南亚和我国的海南岛等地不断地北上迁飞，直至我国东北，其初始迁入量与每年春夏暖湿气流北上程度相关[4-5]，在南岭以北地区不能越冬。

第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1 基因组文库的构建基因组文库（genomic library）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。

理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。

1. 1构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。

第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1.1.1对载体的要求：载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。

1.1.2目前常用的载体： 载体系列（容量为24 kp ）、cosmid载体（容量为50 kb ）、YAC（容量为1 Mb ）、BAC （容量为300 kb）1.2 基因文库构建的一般步骤1.2.1染色体DNA大片段的制备：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。

不能用一般的限制性内切酶消化法，使用物理切割法或不完全酶切法。

1.2.2载体与基因组DNA大片段的连接：直接连接、人工接头或同聚物加尾。

噬菌体载体构建基因组文库第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2 cDNA文库的构建cDNA克隆的基本过程是通过一系列，酶酶催作用，使poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主细胞，构建包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。

2.1高质量mRNA的制备应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System 分离Poly(A)RNA。

将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。

PolyAT tract mRNA 的分离纯化过程第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2.2反转录成cDNA可同时在反转录系统中加入Oligo(dT)12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA；应选用活性较高的反转录酶(Reverse transcriptas)；应选用甲基化dCTP；应保证所获得双链cDNA 的方向性。

第一链cDNA合成1.准备: 高质量的Poly A 或总RNA2. 在微量离心管中混匀以下试剂：1–2 μl RNA 样本(0.025–1.0 μg poly A+或0.10–2.0 μg 总RNA)1.0 μl CDS III 或CDSIII/6 引物1–2 μl 去离子水(补齐体系到4.0 μl)4.0 μl 总体积注意: 对照实验时，请使用1μl *1μg+ 的对照RNA。

CDSIII = Oligo-dT；引物CDSIII/6 =随机引物3. 72°C ，孵育2 min。

4. 冰上冷却2 min，然后14000rpm，10sec，瞬时离心。

5. 混合以下试剂，将混合液加入Step4中的经过变性且结合有引物的RNA样本中，轻拍混匀。

2.0 μl 5X First-Strand 缓冲液1.0 μl DTT (100 mM)1.0 μl dNTP 混合物(10 mM )1.0 μl SMART MMLV 反转录酶6. 只有使用随机引物(CDSIII/6)实验才进行此步骤[如果采用Oligo-dT(CDSIII)请忽略此步骤，直接进行Step7]，25°C，室温孵育10 min。

7. 42°，孵育10 min。

注意: 孵育在热盖的PCR仪中进行。

若用非热盖的PCR仪或水浴，请在反应管中加入一滴矿物油来避免水分蒸发。

8. 加入1 μl SMART III-modified oligo，混匀，42°C，孵育1 hr。

9. 75°C ，10 min终止第一链合成反应。

10. 室温冷却，加入1 μl RNA酶H (2U)。

11. 37°，孵育20 min。

12. 继续进行LD-PCR 扩增(Section VII.B)。

注意: –20°C下可保存3个月。

第一链反应最终体积为15μl• 10 μl SMART III Oligo(10 μM; 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG CCATTATGGCCGGG-3’)• 10 μl CDS III 引物(10 μM; 5’-AT TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA TG-d(T)30VN-3’)*23个碱基• 10 μl CDS III/6 引物(10 μM; 5’-AT TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA TG-NNNNNN-3’)注意: N = A, G, C, or T; V = A, G, or C• 50 μl 5’ PCR 引物(10 μM; 5’-TTCCACCC AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3’)25个碱基•50 μl 3’ PCR 引物(10 μM; 5’-GTATCGATGCCCACCC TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3’)第二链cDNA合成（LD-PCR）尽量使用最小的循环数来得到3-6ug的ds cDNA。

东北农业大学学报2020年第51卷总目次研究报告孕穗期冷水胁迫下施用γ-氨基丁酸对寒地粳稻氮光合效率的调控效应…………贾琰，任鹏飞，赵宏伟，邹德堂，王晋，杨亮1大豆GmPID基因生物信息学分析及克隆…………张超，张勇，满百膺，伍应保，张高阳，张惠宁，涂班策，吕晶晶，李思楠，程鹏，武小霞1外源激素处理对美洲南瓜植株生长的影响…………………………………………屈淑平，丁文琪，王云莉，徐文龙，任晓婧1乙烯处理对树莓果实呼吸速率及乙烯合成代谢的影响………杨国慧，辛月岩，麻世琳，韩德果，李铁梅，范珍珠，王佳明1抗O型口蹄疫病毒猪源单链抗体的筛选……………李德山，胡爽，赵文漾，李青青，郭笑辰，王丹，任桂萍，尹杰超1亮氨酸和异亮氨酸对脂肪沉积的影响及机制……………………………马清泉，王国红，周昕博，朱佳良，岳志元，单安山1通草提取物对奶牛乳腺上皮细胞乳糖合成及相关基因表达的影响……………………………………刘莉莉，王博，蒋倩倩1亮氨酸和异亮氨酸对脂肪沉积的影响及机制…………王宏燕，马晓伟，郑涵，赵承森，全鑫，刘锡博，张月沛，单建荣，范金霞，赵伟，朱用哲1基于改进遗传算法的河流水质模型多参数识别………………刘洁，陈昊辉，张丰帆，姜德迅，许崇品，南军，王鹏1考虑水文变异的水库生态流量研究………………………………………徐淑琴，王亚超，乐静，高凯茹，齐竟辰，徐恩典1过滤后养猪废水厌氧发酵与固氮技术研究……………………………………………………张洋洋，关正军，章恬恬，尹恒1大豆种子分泌物中蛋白质鉴定及其对大豆疫霉的趋化作用……………文景芝，赵钰琦，高新颖，张卓群，吴羚阁，贾梦瑱2大豆GmVIT1克隆及耐盐功能分析……………………………李永光，景雅，孙铭阳，张沿政，苌兴超，陈龙，李文滨2大豆GmFT5a基因启动子受日长调控模式分析………………………………………………赵琳，张妍，刘颖，许崇晶2不同密度和行距对玉米生长特性、产量和籽粒营养成分的影响…………………………………董伟欣，韩立杰，张月辰2西瓜果皮硬度相关性状分析…………………………王学征，杨天天，刘争，孙蕾，朱子成，高鹏，刘识，栾非时2多糖对大豆分离蛋白乳液及乳液凝胶性质的影响…………………………………朱秀清，王婵，孙禹凡，钟明明，齐宝坤2不同发酵条件对氨化玉米秸秆粗蛋白质含量的影响…………谢小来，魏川子，马逢春，陈明明，王雪，孙悠然，焦培鑫2四川丘陵旱地玉米穴灌覆膜施肥播种机设计与参数优化……胡云，王小春，陈诚，蔡金雄，蒲甜，张黎骅，杨文钰2夹护式西瓜钵苗移栽机构设计与试验………………………………………………许春林，解江涛，王宇杰，李恩全，辛亮2遥感蒸散发在无测站资料地区洪水模拟中的应用………………邢贞相，傅爽，孙明新，纪毅，付强，李衡2高效、快速提取高质量稻曲病菌基因组DNA方法……………………张俊华，马玥，杨明秀，宋爽，刘连夫，杨硕3黄瓜棒孢叶斑病菌实时荧光定量PCR方法的建立与应用…………张艳菊，刘齐月，张笛，陶磊，王春龙，刘行风，李雪莲，马天，刘东3间作黄瓜对辣椒疫病及生长发育的影响………………………蒋欣梅，张倩，陈映彤，白国梁，王杰，吴凤芝，于锡宏3低温胁迫对戊唑醇包衣高粱种子出苗和幼苗生理生化的影响…………樊娟，龙海江，向晓龙，任明见，吴传玺，胡安龙3 Lager酵母中CRISPR-Cas9基因敲除系统的构建……………李梦琦，张可心，郑飞云，钮成拓，刘春凤，李崎，王金晶3氢气对CO2气腹致大鼠肾脏损伤的保护作用及相关机制研究…………张建涛，蒋丽红，陈明子，王婷，董奕含，范宏刚3重组人碱性磷酸酶表达及其调节人白细胞释放TNF-α活性研究…………惠觅宙，秦璐楠，高辰哲，薄乐，刘天奇，吴书音，韩建春，翁晓刚，双宝3封闭条件下粉质黏土冻融交界面抗剪强度研究………………………………………………汪恩良，肖尧，许春光，田雨3基于NSGA-Ⅱ灌区两级渠道输配水优化调度……………………………徐淑琴，高凯茹，乐静，王亚超，乔厚清，王雅君3大豆种子包衣机种药混合装置匀种性能数值模拟与试验……韩豹，刘俏，高英玲，杨书婕，郭畅，董小伟，李悦梅3多环境下水稻株型相关性状QTL解析……………………………………………刘化龙，杨洛淼，徐善斌，刘华东，邹德堂4基于元分析的大豆胞囊线虫病3号生理小种抗性基因挖掘…………韩英鹏，田利峥，姜海鹏，包冬芳，王俊，赵雪4 RNAi技术介导大豆蚜hsp70基因对其内源物质及激素表达的影响……………韩岚岚，陈娟，赵奎军，邴玉成，朱琳，张雯林，高丽瞳，肖建飞，金明国4西瓜种子脂肪酸组分分析及种子油体显微观察………………栾非时，裴爽，刘争，高鹏，刘识，朱子成，王学征4施用有机肥对土壤重金属累积的影响及风险评价……………姜佰文，陆磊，王春宏，高强，张迪，陈曦，王艳玲4在线自由基清除法引导具有抗氧化活力蛋白组分分离纯化…………………………………张宏伟，郭阳，孙义玄，包怡红4鸡HMG box蛋白1（HBP1）基因启动子区多态性与腹脂率关联分析…………王守志，张长超，李紫薇，王伟佳，李玉东，王宁，李辉4茶多酚对过氧化氢诱导鹅小肠上皮细胞氧化损伤的保护作用……………………付晶，林桐，陈艾玲，邓珊，刘春朋4褐鳟LEAP-2成熟肽在大肠杆菌中的融合表达……刘晨斌，徐革锋，黄天晴，谷伟，陈春生，程琳，史秀兰，王炳谦4农用履带机器人轨迹跟踪控制系统设计与试验………………………匡文龙，沈文龙，姬长英，田光兆，顾宝兴，刘朋4猪场废水培养小球藻工艺优化…………………………………………王忠江，李泽，王贵祥，王子越，孙玮，姚纪宇4不同轮作模式对黄瓜幼苗生长及土壤化学性质的影响……………………………………………………………吴凤芝，朱维伟5 Cf-19介导的抗番茄叶霉病（Cladosporium fulvum）免疫应答酵母双杂交cDNA文库构建和鉴定…………许向阳，裴童，吴泰茹，王子玉，赵婷婷，李景富，杨欢欢，姜景彬，张贺5不同种植模式下大豆蚜种群体内生理活性物质含量及生命参数研究…………赵奎军，高丽瞳，韩岚岚，陈娟，赵雅妮，肖建飞，郝子茹，师正浩，朱琳5谷氨酸棒杆菌PhoPR双组分系统应答低氧胁迫功能研究………………………陈静，彭枫，刘秀霞，杨艳坤，白仲虎5缺氧诱导因子2α在大鼠早期妊娠中的表达与调节…………………………………………马兴红，陈川，姜南，李世杰5有机物料还田对黑土有机碳及其组分的影响…………………闫雷，周丽婷，孟庆峰，李思莹，戴建军，张宇飞，喇乐鹏5母猪防御攻击性对仔猪争斗行为及生长性能的影响………王希彪，吴锡，李柯，闫浩宇，黄宣凯，崔世泉，狄生伟5猪全基因组范围ETS基因家族成员的鉴定、进化与表达分析…………王志鹏，周萌，郭媛媛，张超鑫，王涛，刘胜伟，闫晓红，丁坤，朱秋思，杨里昂5基于遥感的辽河口岸线动态变化及成因分析…………………………邢贞相，刁晴茹，纪毅，李衡，付强，刘东5 1JM-200灭茬旋耕一体机关键部件设计与试验………………………秦宽，周强，曹成茂，李威亚，张远，刘权5外源海藻糖对碱胁迫下不同品种水稻幼苗生长及生理特性的影响…………邹德堂，王烁，孙健，李嘉明，尹天娇，王敬国，刘化龙，郑洪亮，杨洛淼6生物药肥对水稻秧苗免疫抗病机理的研究…………………………………………………丁伟，高文逸，程茁，戴航宇6大豆玉米间作体系溶磷菌筛选及影响因素研究………………………………………………………王浩，朱思沅，刘晓峰6辽藁本内生细菌ZHAB63鉴定与拮抗菌筛选………………………………………张芳芳，田义新，卢宝慧，王志清，刘桂英6一株产肠毒素大肠杆菌短尾噬菌体分离与鉴定………………………魏炳栋，丛聪，于维，徐永平，李纪彬，李淑英6层粘连蛋白调控奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成途径研究…………………………………王春梅，王保胜，门晶晶，赵锋6日粮蛋白质水平对生长肥育猪消化代谢的影响………………………尚秀国，邓波，朱晓萍，陶新，袁启志，冯尚连6咖啡酸对LPS诱导小鼠乳腺炎的保护作用……………………………………………………张雯，王琳，孙雅丽，马建章6利用2型重组腺相关病毒抑制子宫腔上皮Plekhs1基因表达对小鼠生育能力的影响…………马兴红，张其法，姜南，李世杰，王一妹6基于SWAT模型与Copula修正的融雪径流模拟……………………………………邢贞相，金超群，纪毅，付强，刘东6水稻钵苗夹秧式分秧装置夹秧片变形试验…………………………………………………尹大庆，池相河，周脉乐，王佳照6外源激素对水稻籽粒碳氮代谢相关酶基因表达影响…………金正勋，王思宇，王珊，王剑，张忠臣，李钢夑，朴钟泽7马铃薯晚疫病菌卵孢子形成与萌发条件研究…………张铉哲，姜萌，陈梅，周子豪，李媛媛，赵雪，任雪琦，徐浩然，陈苏慧7干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库构建和鉴定…………许向阳，裴童，吴泰茹，王子玉，赵婷婷，李景富，杨欢欢，张贺，姜景彬7不同类型番茄品质性状遗传多样性及其相关性分析……………………………………………………………卢琦，梁燕7高效液相色谱法同时测定黑蒜中蒜氨酸、脱氧蒜氨酸及γ-谷氨酰半胱氨酸含量…………卢连登，周御，黄振荣，刘春凤，郑飞云，钮成拓，王金晶，马玉金，李崎，王栋7豆渣回添量对内酯豆腐品质特性的影响……………………………………………………兰秋雨，林兆晖，杨文钰，张清7乌苏里貉KIT基因及编码蛋白生物信息学分析…………白秀娟，姜恩泽，苏杭，朱宇航，许愿，徐逸男，李雪，韩志强，徐超7牦牛和犏牛MEISETZ基因克隆及生物信息学分析………………………………向娅，柴志欣，武志娟，王吉坤，钟金城7黑龙江水系6个地理群体银鲫染色体倍性和肌肉营养分析………………………韩英，李洪卿，薛淑群，吕晓楠，马凯7基于改进SVM算法的典型作物分类方法研究…………………………贾银江，姜涛，苏中滨，孔庆明，张萧誉，施玉博7大豆胞囊线虫病抗性相关AP2/EREBP转录因子生物信息学分析………………韩英鹏，卜凡珊，田利峥，姜海鹏，赵雪8水稻三种化控剂复配及壮秧机理研究…………………………………………………………………丁伟，李如意，孔祥男8几种绿色方法防治大豆蚜效果研究……………………………………樊东，鲁冰瑜，杨洪佳，陈雅茹，李泽，张良8黑龙江省黄瓜主栽品种及种质资源对霜霉菌不同致病型抗病性鉴定…………张艳菊，陶磊，刘东，周秀艳，李雪莲，马天，潘梦佳8外源ALA对盐胁迫下西伯利亚白刺光合作用的影响……………………闫永庆，季绍旭，王贺，赵野，范倩雯，王骁8肉鸡屠体脂肪含量间接选择方法及其效果评估…………李辉，陈冲，冷丽，王守志，宿志勇，肖凡，郭怀顺，李玉茂，栾鹏8过表达TLR4基因绵羊对口蹄疫疫苗（O型）免疫效应研究…………姚玉昌，翟羽飞，宋旭婷，赵多维，陆奇，徐利强，亓美玉，陆明海8植物乳杆菌Lp229v饲喂奶牛效果研究………………………………………………………张永根，崔梓琪，姜鑫，徐宏建8基于BP神经网络模型黑龙江漠河段气温变化对开江影响预测……………………………宋春山，林立邦，韩红卫，朱新宇8基于高光谱和MLSR-GA-BP神经网络模型油菜叶片SPAD值遥感估算……………崔小涛，常庆瑞，屈春燕，史博太，蒋丹垚，夏利恒，王玉娜8响应面优化复合酶制备干酪素工艺……………………………………………………………蔡丽莎，王东鹏，曾珍，李诚8有色稻米B族维生素含量与种皮颜色关系研究…………邹德堂，韩笑，孙健，王敬国，刘化龙，郑洪亮，杨洛淼，荆雨桐，黄菊9钾肥对水稻籽粒碳氮代谢相关酶基因表达的影响…………金正勋，王珊，王思宇，王剑，张忠臣，李钢夑，朴钟泽9马铃薯StERF10基因克隆及重金属胁迫下表达分析……………………蒙露露，何冠谛，田维军，李丹丹，黄云，何腾兵9黄瓜CsHSP20基因克隆和生物信息学分析…………………………………………秦智伟，张君鸣，辛明，单宝成，周秀艳9基于层次分析法的旱地不同番茄品种产量和品质比较…………苏秀敏，韩文清，王佼，李鹏，王秋兰，李万星，曹晋军，靳鲲鹏，李丹，李小霞，刘永忠9堆肥土著微生物演替响应抗酸化菌剂研究……………………………………………………宋彩红，齐辉，魏自民，席北斗9染色质重建因子BRG1介导Ile调节牛乳腺上皮细胞乳合成分子机理研究………高学军，王哲，祁昊，王璐璐，甄贞9江苏省荷斯坦牛日产奶量Wood模型DHI分析…………梁艳，王海洋，郭梦玲，张强，高启松，李明勋，张慧敏，杨章平，毛永江9哈尔滨市城市化进程对气温变化影响…………………………………崔嵩，贾朝阳，宋梓菡，付强，刘东，崔宁波9温室三七收获机挖掘铲铲型对比研究……………………………………………张兆国，余小兰，李汉青，程一启，解开婷9基于无线传感技术的秸秆焚烧火点在线监测系统设计与实现…………刘蓝，谢明江，高珊，张齐心，宋井富，周康康9不同发育时期大豆豆荚性状QTL动态分析…………滕卫丽，郭志文，郑立娜，付雪，王博，董莹莹，张丹洋，刘赫禹，冯文婧，赵雪，韩英鹏，李文滨10大豆胞囊线虫病抗性候选基因GmPEBP4-1克隆及表达分析……………………………郭杨，陈立新，姜海鹏，战宇航10青海高原藜麦资源农艺性状评价及产量相关分析……………………李想，朱丽丽，张业猛，权有娟，代千千，陈志国10不同盐分胁迫对皂荚种子萌发及幼苗生理特征的影响……………………………………于兆友，闫海冰，张慧芳，杨秀清10苹果属小金海棠WRKY48基因克隆与功能初步分析…………………韩德果，周正一，杜漫，李铁梅，王爽，杨国慧10转录因子KLF7对IL-6基因的转录调控分析………………王宁，尤欣，徐海冬，娄明，娄钰琦，闫晓红，李辉10干扰MAP3K1基因对山羊毛囊干细胞增殖和凋亡的影响……………马金亮，王健，冯云奎，王强，张柳明，李拥军10内蒙古部分地区绵羊胃肠道线虫感染率及驱虫效果比较研究…………何秀玲，贡庆扎布，其力木格，海鹰，额叶勒德格，哈斯苏荣10基于Copula函数黑土区水稻不同种植模式分析…………………………………魏永霞，张学文，刘慧，侯景翔，冀俊超10四川丘陵旱地春玉米穴灌播种机配套农艺措施研究………石恺，王小春，陈诚，蔡金雄，蒲甜，张黎骅，杨文钰10水稻叶片SPAD值高光谱成像估测……………………………………康丽，高睿，孔庆明，贾银江，施玉博，苏中滨10大豆产量相关性状QTL定位……………………………………………………韩英鹏，栗春霞，赵雪，于宽伟，罗政辉11碱胁迫下不同水稻品种微观结构响应解析………赵海新，黄晓群，陈书强，杨丽敏，杜晓东，张志强，蔡永盛，潘国君11向日葵油酸合成上游基因HaFAB2克隆与表达分析…………………………………………………………………………周菲11树莓种子休眠原因探究………………………………………杨国慧，范珍珠，李玲，李铁梅，郭潇雨，张蕴瑭，王一凡11层积前GA处理对老山芹种胚发育及物质代谢的影响………李富恒，吴晶晶，赵恒田，张晓雯，张宏发，尚爱娟，马汇聪11基于线粒体DNA黑龙江野猪进化分析……………………………………………王文涛，刘娣，张东杰，何鑫淼，田明11基于枯草芽孢杆菌多组学数据全基因组规模代谢模型与蛋白质降解模拟…………袁萍，江明锋，官久强，安添午，张翔飞，罗晓林11基于高通量测序和Q-PCR芯片技术分析养殖环境中苍蝇携带细菌菌群结构和耐药基因特点…………张红娜，周玉法，崔娜，翟真真11基于多目标遗传算法的灌排两用渠道输水优化调度…………………徐淑琴，王雅君，乔厚清，郭晓婷，李仲裕，徐恩典11黑龙江省农业水足迹时空分布及用水效率分析…………………………………姜秋香，李鑫莹，王子龙，吴云星，曹璐11研究进展果园风送式喷雾机智能化发展现状与前景分析……………………………………边永亮，李建平，薛春林，王鹏飞，李昕昊2镰孢菌与大豆根腐病研究进展……………………………………………………………………………………许艳丽，魏巍3东北典型黑土区农田景观多尺度土壤养分时空分异研究进展……………张少良，张海军，肖梓良，曲凤娟，王雪珊，霍纪平，张兴义，刘晓冰7卷终。

《水稻膜系统酵母双杂交cDNA文库及OsVDAC5诱饵蛋白载体的构建与鉴定》一、引言随着生物技术的飞速发展，水稻作为重要的粮食作物，其研究日益受到广泛关注。

水稻膜系统是水稻细胞中一个重要的组成部分，对于维持细胞正常功能起着至关重要的作用。

酵母双杂交技术作为一种有效的工具，被广泛应用于蛋白质相互作用的研究中。

本文旨在构建水稻膜系统酵母双杂交cDNA文库及OsVDAC5诱饵蛋白载体，并对构建结果进行鉴定。

二、材料与方法1. 材料（1）水稻基因组DNA；（2）酵母菌株；（3）PCR引物；（4）cDNA文库构建试剂盒；（5）酵母双杂交试剂盒；（6）OsVDAC5基因序列。

2. 方法（1）cDNA文库的构建：利用PCR技术扩增水稻膜系统相关基因的cDNA序列，将扩增产物与载体连接，构建cDNA文库。

（2）诱饵蛋白载体的构建：将OsVDAC5基因序列克隆至酵母双杂交系统所用的载体中，构建OsVDAC5诱饵蛋白载体。

（3）载体鉴定：通过PCR、酶切及测序等方法对构建的cDNA文库及OsVDAC5诱饵蛋白载体进行鉴定。

三、结果与分析1. cDNA文库的构建与鉴定（1）通过PCR扩增得到水稻膜系统相关基因的cDNA序列，将扩增产物与载体连接，成功构建了cDNA文库。

（2）对构建的cDNA文库进行PCR鉴定，结果显示扩增出的cDNA片段大小与预期相符，说明cDNA文库构建成功。

2. OsVDAC5诱饵蛋白载体的构建与鉴定（1）将OsVDAC5基因序列克隆至酵母双杂交系统所用的载体中，成功构建了OsVDAC5诱饵蛋白载体。

（2）对构建的OsVDAC5诱饵蛋白载体进行PCR、酶切及测序鉴定，结果显示OsVDAC5基因已成功克隆至载体中，且序列正确无误。

四、讨论本研究成功构建了水稻膜系统酵母双杂交cDNA文库及OsVDAC5诱饵蛋白载体，为进一步研究水稻膜系统中蛋白质相互作用提供了有力工具。

在构建过程中，我们采用了PCR技术扩增相关基因的cDNA序列，并利用载体连接、克隆等技术完成了文库及载体的构建。

第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1 基因组文库的构建基因组文库（genomic library）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。

理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。

1. 1构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。

第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1.1.1对载体的要求：载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。

1.1.2目前常用的载体： 载体系列（容量为24 kp ）、cosmid载体（容量为50 kb ）、YAC（容量为1 Mb ）、BAC （容量为300 kb）1.2 基因文库构建的一般步骤1.2.1染色体DNA大片段的制备：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。

不能用一般的限制性内切酶消化法，使用物理切割法或不完全酶切法。

1.2.2载体与基因组DNA大片段的连接：直接连接、人工接头或同聚物加尾。

噬菌体载体构建基因组文库第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2 cDNA文库的构建cDNA克隆的基本过程是通过一系列，酶酶催作用，使poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主细胞，构建包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。

2.1高质量mRNA的制备应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System 分离Poly(A)RNA。

将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。

PolyAT tract mRNA 的分离纯化过程第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2.2反转录成cDNA可同时在反转录系统中加入Oligo(dT)12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA；应选用活性较高的反转录酶(Reverse transcriptas)；应选用甲基化dCTP；应保证所获得双链cDNA 的方向性。

西北植物学报,２０１８,３８(４):０５９８－０６０６A c t aB o t ．B o r e a l ．ＧO c c i d e n t ．S i n．㊀㊀文章编号:１０００Ｇ４０２５(２０１８)０４Ｇ０５９８Ｇ０９㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀d o i :１０．７６０６/j．i s s n ．１０００Ｇ４０２５．２０１８．０４．０５９８收稿日期:２０１７Ｇ１２Ｇ０３;修改稿收到日期:２０１８Ｇ０２Ｇ２５基金项目:国家自然科学基金(２１２０１０２４);山西省重点学科建设项目(F S K S C );山西省大学生创新创业训练计划(２０１７４２８)作者简介:雷海英(１９７８－),女,硕士,副教授,主要从事植物分子生物学研究.E Ｇm a i l :x i a o l e i k k x x ＠１６３．c o m∗通信作者:王志军,博士,教授,主要从事化学生物学研究.E Ｇm a i l :c z x y w z j＠１６３．c o m 玉米酵母双杂交c D N A 文库的构建及Z m C E N 互作蛋白的筛选雷海英１,白凤麟１,段永红２,王志军３∗(１长治学院生物科学与技术系,山西长治０４６０１１;２山西农业大学农学院,山西太谷０３０８０１;３长治学院化学系,山西长治０４６０１１)摘㊀要:为阐明玉米中心蛋白(Z m C E N )的生物学功能,采用酵母双杂交技术对其互作蛋白进行研究.提取玉米(Z e am a y s L ．)自交系 郑５８ 幼苗的总R N A ,利用S MA R T 技术反转录合成d s c D N A ,构建以p G B K T ７为载体的酵母双杂交c D N A 文库;依据Z m C E N 基因的C D S 序列设计引物,构建重组诱饵载体(p G B K T ７ＧZ m C E N )转化酵母菌株Y ２H G o l d ,检测诱饵载体的毒性与自激活能力后,筛选与玉米中心蛋白(Z m C E N )互作的猎物蛋白.将筛选的互作蛋白N A C ６７和T O N N E A U １b (T O N １b )再次验证相互作用,并选取互作蛋白T O N １b ,采用B i F C 实验分别构建Z m C E N Ｇp S P Y N E 和T O N １b Ｇp S P Y C EB i F C 半分子重组载体,转化拟南芥原生质体,进一步验证它们在细胞内的互作;并利用U n i p r o t 和K E G G 在线网站对互作蛋白进行g e n e o n t o l o g y(G O )注释分析.结果表明:玉米全株幼苗的c D N A 文库库容量达到２．５６ˑ１０７C F U ,文库滴度５．３６ˑ１０８C F U /m L ,符合建库要求.经检测诱饵载体无毒性也无自激活功能,所筛选的c D N A 文库经测序和B l a s t 比对分析以及共转验证,最终得到２８个与诱饵蛋白Z m C E N 互作的蛋白质.G O 注释显示互作蛋白参与的生物过程有２１种.B i F C 结果显示,蛋白T O N １b 与Z m ＧC E N 在拟南芥原生质体细胞内互作而形成互补,从而产生黄色荧光,进一步证实了两者存在互作关系.酵母双杂交系统c D N A 文库的成功构建与筛选,为进一步研究玉米Z m C E N 及其与互作蛋白的作用机制奠定了基础.关键词:Z m C E N ;S MA R T 技术;c D N A 文库;酵母双杂交;B i F C ;G O 分析中图分类号:Q ７８５;Q ７８６;Q ７８９文献标志码:AC o n s t r u c t i o no fY e a s t T w o ＧH y b r i d cD N AL i b r a r y an d S c r e e n i n g of I n t e r a c t i o nP r o t e i n s o fZ m C E Ni n M a i z e L E IH a i y i ng １,B A IF e n g l i n １,D U A N Y o n gh o n g ２,WA N GZ hi ju n ３∗(１D e p a r t m e n to fB i o l o g i c a lS c i e n c ea n d T e c h n o l o g y ,C h a n g z h iU n i v e r s i t y ,C h a n g z h i ,S h a n x i０４６０１１,C h i n a ;２C o l l e geo f A g r o n o m y ,S h a n x iA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,T a i g u ,S h a n x i ０３０８０１,C h i n a ;３D e p a r t m e n to fC h e m i s t r y ,C h a n g z h iU n i v e r s i t y,C h a n gz h i ,S h a n x i ０４６０１１,C h i n a )A b s t r a c t :T ou n d e r s t a n dh o w Z e am a ys L ．c e n t r i n (Z m C E N )f u n c t i o n ,w e e m p l o y e d t h e t e c h n i q u e o f y e a s t t w oh y b r i d s y s t e m (Y ２H S )t o i n v e s t i g a t e t h e i n t e r a c t i o nb e t w e e n i n t e r a c t i n g Ｇpr o t e i n s a n dZ m C E N．I n t h i s s t u d y ,u s i n g m a i z e i n b r e d l i n eZ h e n g ５８s e e d l i n g s a sm a t e r i a l s ,w e i s o l a t e d t h e t o t a l R N Aa n d s yn t h e s i z e d t h e d o u b l e Ｇs t r a n d c D N A s b y S MA R T t e c h n o l o g y ．A c c o r d i n g t o t h eC D S s e qu e n c e o f t h e Z m C E N g e n e ,w e d e s i g n e d t h e p r i m e r s t o c o n s t r u c t r e c o m b i n a n t b a i t v e c t o r (pG B K T ７ＧZ m C E N )a n d t r a n s f o r m y e a s t s t r a i nY２H G o l d f o r s c r e e n i n g t h e t o x i c i t y a n ds e l fＧa c t i v a t i o na b i l i t y o fb a i tv e c t o r s．W es c r e e n e dt h e p r e yp r oＧt e i n s i n t e r a c t i o nw i t hZ m C E N．I n t e r a c t i n gp r o t e i n sN A C６７a n dT O N１bw e r e v e r i f i e d t h e i n t e r a c t i o nb yβＧg a l a c t o s i d a s e a s s a y i nv i t r o．T h eB i F Cs e m iＧm o l e c u l ev e c t o r so f Z m C E NＧp S P Y N Ea n d T O N１bＧp S P Y C E w e r e c o n s t r u c t e d t o f u r t h e r c o n f i r mt h e i n t e r a c t i o n i n A r a b i d o p s i s c e l l s．G e n e a n dO n t o l o g y(G O)e n r i c hＧm e n t a n a l y s i sw e r e p e r f o r m e do n t h e s c r e e n e d p r o t e i n s u s i n g U n i p r o t a n dK E G Go n l i n e s i t e s．T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h eu n a m p l i f i e d c D N Al i b r a r y w a s c o n s i s t e do f２．５６ˑ１０７C F Ui n d e p e n d e n t c l o n e s,a n d t h e t i t e r o f l i b r a r y w a s５．３６ˑ１０８C F U/m L w h i c hm e t t h e r e q u i r e m e n t so f l i b r a r y c o n s t r u c t i o n．T h e c D N A l i b r a r y w a s s c r e e n e db y b a i t v e c t o r a f t e r t e s t i n g n o t o x i c i t y a n dn o s e l fＧa c t i v a t i o n,a n d２８p r o t e i n sw e r e i nＧt e r a c t e dw i t hZ m C E Nb y s e q u e n c i n g a n dB l a s t a l i g n m e n t a n a l y s i s．G Oe n r i c h m e n t a n a l y s i so f t h e s e p r oＧt e i n s s h o w e d t h a t t h e r ew e r e２１t e r m s i nt h eb i o l o g i c a l p r o c e s s．T h eZ m C E Na n dT O N１b p r o t e i n sw e r e f u r t h e r v e r i f i e d i n t e r a c t i o n i n A r a b i d o p s i s c e l l b y B i F C t e c h n o l o g y．Ah i g hＧq u a l i t y c D N Al i b r a r y w a s c o nＧs t r u c t e d a n d２８p r o t e i n sw e r e i n t e r a c t e dw i t hZ m C E N,w h i c h c o u l d b e u s e d t o f u r t h e r i n v e s t i g a t e t h e i n t e rＧa c t i o nm e c h a n i s m s b e t w e e n t h e m．K e y w o r d s:Z m C E N;S MA R Tt e c h n o l o g y;c D N Al i b r a r y;y e a s t t w oＧh y b r i d;B i F C;G Oa n a l y s i s㊀㊀细胞中存在着一个精密的骨架系统 细胞骨架,尤其是微管和微丝骨架,在细胞周期的进程中扮演着重要角色,直接参与有丝分裂中细胞器的组装及胞质分裂,维持细胞正常的形态结构与功能[１].微管组织中心(m i c r o t u b u l e o r g a n i z i n g c e n t e r, MT O C)决定着细胞微管的极性,为微管提供了生长的起点和延伸的方向.哺乳动物的MT O C,如中心体,是一个高度动态变化的结构,随细胞周期进行复制㊁分离,并且在分裂期形成纺锤体的两极,是细胞的动力中心.而６３％的高等植物没有中心体,其功能的执行依赖于细胞内的细胞结合蛋白以及上游信号分子的调控,如中心蛋白(c e n t r i n)就是微管组织中心(MT O C)的一种重要组成部分[２],最早从绿藻(T e t r a s e l m i s s t r i a t a)中分离得到,是负责细胞分裂㊁分化的重要的钙结合蛋白.现已知中心蛋白存在于藻类㊁酵母㊁低等生物及高等动植物中[３Ｇ４].中心蛋白的功能主要是通过与其互作蛋白,如中心体成分S f i１[５Ｇ８]㊁M p s[９Ｇ１０]和K a r l[１１Ｇ１２]等作用而执行功能.目前,中心蛋白的研究主要集中在低等生物㊁模式植物及人,对玉米中心蛋白(Z e am a y s L．c e nＧt r i n,Z m C E N)的作用机制及互作蛋白研究未见报道.本实验室在前期研究中已成功进行了Z m C E N 基因克隆和表达,并对Z m C E N的功能开展了初步研究[１３Ｇ１４].本研究通过构建玉米c D N A文库,采用酵母双杂交技术筛选出与Z m C E N互作的蛋白质,为从分子水平上揭示Z m C E N作用的分子机制及开展其生物学功能研究奠定基础.１㊀材料和方法１．１㊀供试材料参试材料为玉米(Z e a m a y s L．)自交系 郑５８ ,由山西省农业科学院孙毅研究员提供.总R N A提取㊁质粒提取及片段回收等试剂盒购自T a k a r a公司,c D N A文库构建㊁酵母转化试剂盒㊁S D/L e u培养基等购自C l o n t e c h公司.酵母菌Y２H G o l d㊁Y１８７㊁大肠杆菌E s c h e r i c h i a c o l i T O P１０均由本实验室保存;酵母双杂交载体质粒为p GＧB K T７㊁p G A D T７,购自C l o n t e c h公司.１．２㊀实验方法１．２．１㊀玉米幼苗全株c D N A文库的构建㊀(１)总R N A的提取:选取玉米在光照培养箱中培养１周的生长健康的４~５叶期植株,连同根部一起取出,冲洗干净,于干热灭菌后的研钵中加入液氮,研磨后利用T r i z o l(T a K a R a)试剂提取总R N A(具体方法参照说明书),采用N a n o D r o p２０００分光光度计检测R N A浓度和质量.(２)Z m C E Nc D N A单链㊁双链合成及双链c DＧN A的纯化:采用S MA R T技术和C l o n t e c h酵母双杂交文库构建试剂盒( M a t e&P l a t e L i b r a r y S y sＧt e m)合成c D N A,P C R反应条件为:９５ħ３０s;９５ħ１０s,６５ħ６m i n(每个循环＋５s),２５个循环;６８ħ５m i n.取７μL反应产物做１％琼脂糖凝胶电泳检测,剩余的约９３μL加入到C H R OMA S P I N T EＧ４００纯化柱中纯化,最后溶解到２０μL去离子水中重悬c D N A,采用１％琼脂糖凝胶电泳检测质量.(３)收集转化子:将d sc D N A与p G A D T７ＧR e c线性质粒共转至Y１８７感受态细胞中,按酵母转化试剂盒(Y e a s tm a k e r T M Y e a s tT r a n s f o r m a t i o n S y s t e m２,C l o n t e c h)指南操作,将转化子涂布于１５０m mS D/ＧL e u平板上,待菌落长到２~３m m时即收获转化子.９９５４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀雷海英,等:玉米酵母双杂交c D N A文库的构建及Z m C E N互作蛋白的筛选(４)文库滴度检测:取１０μLc D N A 文库菌液,分别稀释为１０㊁１００㊁１００００倍后涂布于１００m mS D /ＧL e u 平板上,３０ħ倒置培养３~５d ,分别统计平板上的菌落数以计算文库滴度.１．２．２㊀诱饵载体的构建㊀引物序列依据Z m C E N基因C D S 序列设计.Z m C E N ＧF /Z m C E N ＧR 引物序列见表１,限制性内切酶N c o I /X h o I 将扩增产物进行双酶切后,４ħ连接过夜,采用载体通用引物测序验证序列的正确性.１．２．３㊀酵母转化㊁pG B K T ７ＧZ m C E N 毒性及自激活检测㊀将p G B K T ７质粒和构建好的p G B K T ７ＧZ m ＧC E N 重组载体１００n g 分别转化入酵母Y２H G o l d 的感受态细胞[２６]中,稀释将转化液稀释１０㊁１００倍后分别取１００μL 涂布S D /ＧT r p ㊁S D /ＧT r p /X ＧαＧG a l ㊁S D /ＧT r p/X ＧαＧG a l /A b a 固体平板上检测其毒性;同时将１００n gp G B K T ７ＧZ m C E N 及１００n gpG A D T ７质粒共转至Y ２H G o l d 感受态细胞,将转化液稀释１０㊁１００倍后分别取１００μL 涂布S D /ＧT r p /ＧL e u /X ＧαＧG a l ㊁S D /ＧT r p /ＧL e u /ＧH i s /ＧA d e /X ＧαＧG a l /A b A 平板;同时将１００n gp G B K T ７Ｇ５３与１００n gp G A D T ７ＧT 共转至Y ２H G o l d 感受态细胞,为阳性对照;将１００n gp G B K T ７Ｇl a m 与１００n gp G A D T ７ＧT 共转至Y ２H G o l d 感受态细胞,设为阴性对照.将转化液稀释１０㊁１００倍后分别取１００μL 涂布于S D /ＧT r p/ＧL e u /X ＧαＧG a l ㊁S D /ＧT r p/ＧL e u /ＧH i s /ＧA d e /X ＧαＧG a l /A b A 平板上,将上述平板在３０ħ下倒置培养３~５d,检测自激活.感受态细胞的制备和转化过程按照试剂盒(Y e a s t m a k e r T MY e a s t T r a n s f o r m a t i o nS ys t e m２,C l o n t e c h )操作指南进行.１．２．４㊀玉米中心蛋白(Z m C E N )互作蛋白的筛选㊀从上述S D /ＧT r p 平板上挑取含有pG B K T ７ＧZ m ＧC E N 的Y ２H G o l d 菌落(２~３m m )至５０m LS D /ＧT r p 液体培养基中,３０ħ下２５０~２７０r /m i n 振荡培养,直至O D ６００ʈ０．８;１０００g 离心５m i n ,去上清,用４~５m LS D /ＧT r p 液体培养基重悬,在含有４５m L ２ˑY P D A 液体培养基的２L 的锥形瓶中接入１m L c D N A 文库菌液和４~５m L 诱饵菌液,设阳性对照为Y ２H G o l d [pG B K T ７Ｇ５３＋p G A D T ７ＧT ],阴性对照为Y ２H G o l d [pG B K T ７Ｇl a m ＋p G A D T ７ＧT ].３０ħ下３０~５０r /m i n 培养,２０h 后１０００g 离心收集１０m i n ,弃上清,再用５０m L０．５ˑY P D A 清洗２次,离心,去上清,收集细胞;用１０m L０．５ˑY P D A 重悬细胞,将杂交液涂布于S D /ＧT r p/ＧL e u /ＧH i s /ＧA d e 的营养缺陷型固体培养基上,３０ħ倒置培养７d,筛选互作蛋白.将划线３次均能生长的克隆定为阳性克隆.将抽提所得质粒转化至大肠杆菌T O P １０宿主,涂布于加有A m p 的平板上,挑斑送上海生工进行测序.测序后的c D N A 序列进行B l a s t 比对分析.选取互作蛋白N A C ６７和T O N １b 的菌落分别在S D /ＧT r p/L e u 和S D /ＧT r p /ＧL e u /ＧH i s /ＧA d a 营养缺陷型培养基上划线生长,βＧ半乳糖苷酶进一步验证其互作.１．２．５㊀双分子荧光互补[１５]体内验证Z m C E N 与T O N １b 蛋白的互作㊀通过设计P C R 引物,扩增出不含终止密码子的Z m C E N 和T O N １b 的c D N A 序列,并将此无终止密码子的Z m C E N c D N A 序列插表１㊀实验中用到的P C R 引物T a b l e １㊀P r i m e r su s e d i n t h i s s t u d y引物名称P r i m e r n a m e引物序列(５ᶄң３ᶄ)P r i m e r s e qu e n c e 限制性内切酶R e s t r i c t i o ne n z ym e Z m C E N ＧF T G G C C A T G G A G G C C G A A T T C A T G A G T T T C A A C C A G T C T A C T G T C A A G G N c o ⅠZ m C E N ＧRC C G C T G C A G G T C G A C G G A T C C G T A G C C A A A G C T G G T C C T C CT C A T C X h o ⅠB i F C ＧZ m C E N ＧFT G G C G C G C C A C T A G T G G A T C C A T G A G T T T C A A C C A G T C T A C A s c ⅠB i F C ＧZ m C E N ＧRG A G C G G T A C C C T C G A G G T C G A C G T A G C C A A A G C T G G T C C T K p n ⅠN A C ６７ＧFT G G C G C G C C A C T A G T G G A T C C A T G G A G G T G A A G A A G G A G G GA s c ⅠN A C ６７ＧR G A G C G G T A C C C T C G A G G T C G A C G A C A C C C G C C A T C T T C C G K p n ⅠT O N １b ＧF T G G C G C G C C A C T A G T G G A T C C A T G G A C G A C T A C G C C C G G G A G A A s c ⅠT O N １b ＧRG A G C G G T A C C C T C G A G G T C G A C C T C G G C G C C A T C C C C T G A K pn ⅠpS P Y N E ＧF C T C T A G A G T T A A C C G G G C T C A G G pS P Y N E ＧR C A T C C C G G G A G C G G T A C C pS P Y C E ＧF C T C T A G A G T T A A C C G G G C T C A G GpS P Y C E ＧR C A T C C C G G G A G C G G T A C C００６西㊀北㊀植㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３８卷入到n Y F P 的N Ｇ端半分子载体p S P Y N E 的多克隆位点中,使之与n Y F P 相连形成Z m C E N Ｇp S P Y N E 融合蛋白;同时也将无终止密码子的T O N １b 的c D ＧN A 序列插入到n Y F P 的C Ｇ端半分子载体p S P Y C E的多克隆位点中,形成T O N １b Ｇp S P Y C E 的融合蛋白.分别取两质粒５μL (约１．２m g )通过P E G 诱导分别转化及共转化玉米原生质体,２３ħ弱光孵育１２~１８h 进行瞬时表达,激光共聚焦显微镜(卡尔蔡司L S M ８８０)观察并照相.２㊀结果与分析２．１㊀玉米酵母双杂交c D N A 文库的构建玉米幼苗总R N A 提取及m R N A 纯化.提取的总R N A ,O D ２６０/O D ２８０为１．９８６.由图１,A 看出,提取的总R N A 完整性较好,测定浓度为０．０８μg /μL ,取３μL 进行建库.L D ＧP C R 设置为２５个循环.玉米幼苗c D N A 的合成和纯化.如图１,B 所示,合成的双链c D N A 的电泳结果呈现弥散状分布,双链c D N A 大小介于３００~５０００b p 之间,表明c D N A 全长性较好.纯化后双链c D N A 浓度结果为１６７．４n g /μL ,O D ２６０/O D ２８０为１．７３,大小介于３００~４０００b p 之间,表明全长性较好,符合建库要求.c D N A 文库质量与滴度检测,库容２．５６ˑ１０７C F U＞１ˑ１０６C F U ,文库滴度:５．３６ˑ１０８C F U/m L ,符合建库标准(＞２ˑ１０７C F U /m L ).２．２㊀诱饵载体p G B K T ７ＧZ m C E N 的毒性及自激活检测㊀㊀通过设计一步克隆引物,将Z m C E N 基因插入到p G B K T ７载体上,获得了p G B K T ７ＧZ m C E N 真核融合表达载体,通用引物测序证明载体构建成功.对融合表达载体转化酵母菌Y ２H G o l d 进行毒性检测,结果对照与插入菌株均在S D /ＧT r p 缺陷型培养基上生长出单克隆菌落,表明p G B K T ７和p G ＧB K T ７ＧZ mC E N 对酵母Y ２H G o l d 无毒性作用(图２).p G B K T ７ＧZ m C E N 诱饵质粒自激活作用检测结果如图２所示,只有阳性对照组中由于p G B K T ７Ｇ５３表达的p ５３蛋白与p G A D T ７ＧT 表达的T 蛋白发生相互作用,可在S D /ＧT r p /L e u 和S D /ＧT r p /ＧL e u /ＧH i s /ＧA d a 营养缺陷型培养基上复苏,而阴性对照p G B K T ７Ｇl a m ＋p G A D T ７ＧT 和实验组p G B K T ７ＧZ m C E N ＋p G A B T ７ＧT 只在S D /ＧT r p 缺陷型培养基上生长,均不在四缺平板上生长,表明该诱饵基因的融合蛋白没有自激活活性,可用于下一步实验.２．３㊀诱饵载体p G B K T ７ＧZ m C E N 筛选玉米幼苗c D N A 文库㊀㊀将诱饵载体p G B K T ７ＧZ m C E N 转入酵母Y ２H G o l d 后,提取单克隆质粒,送上海生物工程公司进行测序,并通过N C B IB l a s t 进行比对,得到了２８个可能与Z m C E N 互作的蛋白质(表２).从筛选的互作蛋白中分别选取N A C ６７和T O N １b 蛋白,采用表１中引物进行扩增并构建载体,再次进行共转验证和βＧ半乳糖苷酶检测(图３),进一步证明了N A C ６７和T O N １b 蛋白与Z m C E N 存在互作.利用U n i pr o t 在线网站,对候选２８个互作蛋白进行了g e n e o n t o l o g y(G O )注释(图４),结果表明Z m C E N 的候选互作蛋白参与的生物过程有２１种,包括翻译㊁代谢过程㊁化合物的生物合成过程㊁对外界刺激的响应及防御等;细胞组份包含叶绿体基质㊁核糖体及细胞内的非膜结合细胞器等;参与的分子功能有１４种,包括水解酶㊁翻译延伸因子㊁D N A 复制原点结A．玉米全株总R N A ;B ．c D N A 纯化;C ．Z m C E N 基因P C R 扩增;M １．１００００b p D N A 分子量标准;M ２．５０００b p DN A 分子量标准;１和２为提取的总R N A ;３和４为纯化的c D N A ;５和６为P C R 扩增Z m C E N 基因产物图１㊀玉米Z m C E N 基因P C R 扩增A．E l e c t r o p h o r e s i s r e s u l t s o f t o t a lR N A ;B ．d s c D N A ;C ．T h eP C Rr e s u l t o f Z m C E N g e n e ;M １．１００００b p DN Al a d d e r ;M ２．５０００b p DN Al a d d e r ;１a n d２w e r e t h e t o t a lR N A ;３a n d ４w e r e t h e p u r i f i e d c D N A ;５a n d６w e r e t h eP C Rr e s u l t o f Z m C E N g e n e F i g．１㊀T h eP C Rr e s u l t o f Z m C E N g e n e o fm a i z e １０６４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀雷海英,等:玉米酵母双杂交c D N A 文库的构建及Z m C E N 互作蛋白的筛选图２㊀诱饵融合蛋白的毒性和自激活活性检测F i g ．２㊀T o x i c i t y an d s e l f Ｇa c t i v a t i o nd e t e c t i o no f t h eb a i t r e c o m b i n a n t p r o t e in A ㊁B ．１．p G B K T ７ＧZ m C E N ＋p G A D T ７;２．p G B K T ７ＧZ m C E N ＋p G A D T ７ＧN A C ６７;３．p G B K T ７Ｇ５３＋p G A D T ７ＧT ;４．p G B K T ７Ｇl a m ＋p G A D T ７ＧT ;C ㊁D ．１．p G B K T ７ＧZ m C E N ＋p G A D T ７;２．p G B K T ７ＧZ m C E N ＋p G A D T ７ＧT O N １b ;３．p G B K T ７Ｇ５３＋p G A D T ７ＧT ;４．pG B K T ７Ｇl a m ＋p G A D T ７ＧT 图３㊀诱饵载体与蛋白N A C ６７和T O N １b 的互作验证F i g ．３㊀F u n c t i o n a l a s s a y of b a i t p r o t e i nw i t hN A C ６７a n dT O N １b p r o t e i n s i n y e a s t ２０６西㊀北㊀植㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３８卷表２㊀Z m C E N 互作蛋白及功能分析T a b l e ２㊀T h e f u n c t i o n a l a n a l y s i s o f Z m C E Ni n t e r a c t i n gpr o t e i n s 序号N o ．基因座位G e n e l o c u s染色体号码C h r ．N o ．候选互作蛋白C a n d i d a t e i n t e r a c t i n gpr o t e i n １G RM Z M ２G ００８３４１４αＧ玉米醇溶蛋白a l p h a Ｇz e i n p r o t e i n ２G RM Z M ２G ００９７１７６F Ｇb o x 蛋白F Ｇb o x p r o t e i n３G RM Z M ２G ０１８０２７１０同O S J N B a ００８８A ０１．１３样蛋白O S J N B a ００８８A ０１．１３Ｇl i k e p r o t e i n ４G RM Z M ２G ０２２２６９１假定翻译延伸/起始因子家族P u t a t i v e t r a n s l a t i o ne l o n g a t i o n /i n i t i a t i o n f a c t o r f a m i l y５G RM Z M ２G ０３５８０７２未知蛋白质U n c h a r a c t e r i z e d p r o t e i n ６G RM Z M ２G ０４６５２０８假定蛋白H y p o t h e t i c a l p r o t e i n ７G RM Z M ２G ０４８８４６７中心蛋白C a l t r a c t i n８G RM Z M ２G ０５８５３１１０包含B T B /P O Z 结构域蛋白B T B /P O Zd o m a i n Ｇc o n t a i n i n gpr o t e i n ９G RM Z M ２G ０７４０８５９６０S 核糖体蛋白L ３１６０S r i b o s o m a l p r o t e i nL ３１１０G RM Z M ２G ０７４１５８１淀粉磷酸化酶１S t a r c h p h o s p h o r y l a s e １１１G RM Z M ２G ０８３３４７１０包含N A C 结构域蛋白８３N A Cd o m a i n Ｇc o n t a i n i n gp r o t e i n８３１２G RM Z M ２G ０８７８２４１０未知蛋白质U n c h a r a c t e r i z e d p r o t e i n１３G RM Z M ２G ０９４０７４６４０S 核糖体S １４样蛋白４０S r i b o s o m a l p r o t e i nS １４Ｇl i k e １４G RM Z M ２G １００２２９８钙调蛋白结合蛋白C a l m o d u l i nb i n d i n gp r o t e i n １５G RM Z M ２G １１７２３０７丙氨酸转氨酶２A l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e ２１６G RM Z M ２G １１７７０７７磷酸Ｇ２Ｇ脱氢Ｇ３Ｇ脱氧庚糖酸醛缩酶P h o s p h o Ｇ２Ｇd e h y d r o Ｇ３Ｇd e o x y h e pt o n a t e a l d o l a s e １１７G RM Z M ２G １２７５９１２G D P Ｇ甘露糖转运蛋白G D P Ｇm a n n o s e t r a n s p o r t e rG O N S T ５１８G RM Z M ２G １２９４５７１０假定蛋白H y p o t h e t i c a l p r o t e i n １９G RM Z M ２G １２９８０４２未知蛋白质U n c h a r a c t e r i z e d２０G RM Z M ２G １４５４９６８５０S 核糖体蛋白L ２７叶绿体５０S r i b o s o m a l p r o t e i nL ２７c h l o r o p l a s t i c ２１G RM Z M ２G １６６９４４５木葡聚糖内转糖基酶/水解酶蛋白２３X y l o g l u c a ne n d o t r a n s g l u c o s y l a s e /h y d r o l a s e p r o t e i n２３２２G RM Z M ２G ３８５７８７２未知蛋白质U n c h a r a c t e r i z e d２３G RM Z M ２G ４０４４５９４玉米醇溶蛋白L ２bZ e i n p o l y p e pt i d e sL ２b ２４G RM Z M ２G ４１５５２９７A B C 转运G 家族成员４３A B Ct r a n s p o r t e rGf a m i l y me m b e r ４３Ｇl i k e ２５G RM Z M ２G ４５００５５４D N A 复制许可因子M C M ５D N Ar e p l i c a t i o n l i c e n s i n gf a c t o rM C M ５２６G RM Z M ２G ４７３００１７磷酸烯醇丙酮酸羧基酶４P h o s p h o e n o l p y r u v a t e c a r b o x y l a s e ４２７G RM Z M ２G ５０４４０１３未知蛋白质U n c h a r a c t e r i z e d ２８G RM Z M ２G １５１２６８２蛋白T O N １bP r o t e i nT O N １b１．其他机体防御反应;２．翻译;３．肽的生物合成过程;４．肽的代谢过程;５．对其他生物体的反应;６．响应外部的生物刺激;７．酰胺的合成过程;８．细胞内酰胺的代谢过程;９．生物刺激反应;１０．对真菌的防御反应;１１．有机氮类化合物的生物合成过程;１２．对外刺激反应;１３．响应真菌;１４．防御反应;１５．翻译延伸;１６．多生物过程;１７．生物合成过程;１８．有机体合物的代谢过程;１９．细胞大分子生物合成过程;２０．大分子生物合成过程;２１．细胞生物合成过程;２２．核糖体;２３．核糖核蛋白复合体;２４．叶绿体基质;２５．质体间质;２６．细胞的一部分;２７．M C M 复合物;２８．细胞;２９．细胞内;３０．非膜结合细胞器;３１．细胞内的非膜结合细胞器;３２．脲基乙醇酸水解酶活性;３３．翻译延伸因子活性;３４．糖原磷酸化酶的活性;３５．D N A 复制原点的结合;３６．营养库活性;３７．核糖体的结构成分;３８．水解酶活性,作用于碳氮健;３９．磷酸化酶活性;４０．结构分子活性;４１．磷酸吡哆醛结合;４２．磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性;４３．核苷三磷酸酶活性;４４．焦磷酸酶活性;４５．水解酶活性,作用于酸酐图４㊀Z m C E N 候选互作蛋白G e n e o n t o l o g y 注释１．d e f e n s e r e s p o n s e t oo t h e r o r g a n i s m ;２．t r a n s l a t i o n ;３．p e p t i d e b i o s y n t h e t i c p r o c e s s ;４．p e p t i d em e t a b o l i c p r o c e s s ;５．r e s po n s e t oo t h e r o r g a n i s m ;６．r e s p o n s e t o e x t e r n a l b i o t i c s t i m u l u s ;７．a m i d e b i o s y n t h e t i c p r o c e s s ;８．c e l l u l a r a m i d em e t a b o l i c p r o c e s s ;９．r e s p o n s e t ob i o t i c s t i m u l u s ;１０．d e f e n s e r e s p o n s e t o f u n g u s ;１１．o r g a n o n i t r o g e n c o m p o u n db i o s y n t h e t i c p r o c e s s ;１２．r e s p o n s e t o e x t e r n a l s t i m u l u s ;１３．r e s p o n s e t o f u n g u s ;１４．d e f e n s e r e s p o n s e ;１５．t r a n s l a t i o n a l e l o n g a t i o n ;１６．m u l t i Ｇo r g a n i s m p r o c e s s ;１７．b i o s y n t h e t i c p r o c e s s ;１８．o r g a n o n i t r o ge n c o m p o u n dm e t a b o l i c p r o c e s s ;１９．c e l l u l a rm a c r o m o l e c u l e b i o s y n t h e t i c p r o c e s s ;２０．m a c r o m o l e c u l eb i o s y n t h e t i c pr o c e s s ;２１．c e l l u l a r b i o s y n t h e t i c p r o c e s s ;２２．r i b o s m e ;２３．r i b o n u c l e o p r o t e i n c o m p l e x ;２４．c h l o r o p l a s t s t r o m a ;２５．p l a s t i d s t r o m a ;２６．c e l l pa r t ;２７．M C M c o m p l e x ;２８．c e l l ;２９．i n t r a c e l l u l a r ;３０．n o n Ｇm e mb r a n e Ｇb o u n d e do r g a n e l l e ;３１．i n t r ac e l l u l a r n o n Ｇm e m b r a n e Ｇb o u nde do r g a n e ll e ;３２．u r e i d o g l y c o l a t eh y d r o l a s e a c t i v i t y ;３３．t r a n s l a t i o ne l o n g a t i o n f a c t o r a c t i v i t y ;３４．g l y c o g e n p h o s p h o r y l a s e a c t i v i t y ;３５．D N Ar e pl i c a t i o n o r i g i nb i n d i n g ;３６．n u t r i e n t r e s e r v o i r a c t i v i t y ;３７．s t r u c t u r a l c o n s t i t u e n t o f r i b o s o m e ;３８．h y d r o l a s e a c t i v i t y ,a c t i n g o nc a r b o n Ｇn i t r o ge n (b u t n o t p e p t i d e )b o n d s ;３９．p h o s p h o r y l a s e a c t i v i t y ;４０．s t r u c t u r a lm o l e c u l e a c t i v i t y ;４１．p y r i d o x a l p h o s p h a t e b i n d i n g ;４２．p h o s p h o e n o l p yr u v a t e c a r b o x y l a s e a c t i v i t y ;４３．n u c l e o s i d e Ｇt r i p h o s p h a t a s e a c t i v i t y ;４４．p y r o p h o s p h a t a s e a c t i v i t y ;４５．h y d r o l a s e a c t i v i t y ,a c t i n g o na c i d a n h yd r i de s F i g ．４㊀G e n e o n t o l o g y a n n o t a t i o nof Z m C E Nc a n d i d a t e i n t e r a c t i n gpr o t e i n s ３０６４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀雷海英,等:玉米酵母双杂交c D N A 文库的构建及Z m C E N 互作蛋白的筛选Ⅰ．B i F C 载体图谱;Ⅱ．Z m C E N 与T O N １b 蛋白在拟南芥原生质体中的互作.其中,A~C 为明场下的拟南芥叶片原生质体细胞图;D ~F 为拟南芥叶片原生质体细胞的Y F P 荧光信号图;G~I 为荧光信号与明场的叠加图图５㊀B i F C 验证Z m C E N 与候选蛋白T O N １b 的相互作用(B a r ＝２μm )Ⅰ．B i F Cv e c t o rm a p ;Ⅱ．T h e i n t e r a c t i o no f Z m C E Na n dT O N １b p r o t e i n i n A r a b i d o ps i s p r o t o p l a s t c e l l ．A－C ．B r i g h t Ｇf i e l d i m a g e s o f A r a b i d o p s i s p r o t o p l a s t c e l l ;D －F ．E p i f l u o r e s c e n t i m a g e s o f y e l l o wf l u o r e s c e n t p r o t e i n (Y F P )i n A r a b i d o ps i s p r o t o p l a s t c e l l ;G－H．M e r g e d i m a g e s o f e p i f l u o r e s c e n t a n db r i g h t Ｇf i e l d i m a ge s F i g．５㊀B i F C i d e n t i f i e d i n t e r a c t i o nb e t w e e nZ m C E Na n dT O N １b p r o t e i n s (B a r ＝２μm )合活性及各种磷酸化酶活性等.２．４㊀B i F C 体内验证Z m C E N 与T O N １b 蛋白的互作㊀㊀利用B i F C 载体系统(图５,Ⅰ)验证Z m C E N 和T O N １b 蛋白在拟南芥原生质体的相互作用,如图５,Ⅱ(卡尔蔡司L S M ８８０共聚焦显微镜１００X 油镜下观察并拍照)所示,在构建的对照组N Ｇ端Y F P 半分子载体Z m C E N Ｇp S P Y N E (图５,Ⅱ,A ㊁D ㊁G )和C Ｇ端Y F P 半分子载体T O N １b Ｇp S P Y C E (图５,Ⅱ,B ㊁E ㊁H )分别转化拟南芥原生质体,结果均未观察到黄色荧光的表达,当将两半分子Y F P 载体共转拟南芥原生质体时,由于蛋白Z m C E N 和T O N １b 蛋白发生相互作用可产生完整的Y F P ,可观察到明显的黄色荧光的表达(图５,Ⅱ,C ㊁F ㊁I ),从而证明Z m ＧC E N 和T O N １b 蛋白在拟南芥细胞内存在互作.３㊀讨㊀论构建高质量c D N A 文库是利用酵母双杂交系统筛得大量互作蛋白的成功基础.本实验构建的c D N A 文库滴度为５．３６ˑ１０８C F U /m L ,达到了文库筛选的要求.通过构建的文库,筛选到了２８个与诱饵蛋白Z m C E N 互作的蛋白质,为进一步研究Z m C E N 的分子机制打下基础.在筛选的２８个与Z m C E N 发生互作的蛋白质中,其中２个是玉米醇溶蛋白的相关蛋白,已知玉米醇溶蛋白是玉米胚乳细胞中蛋白质的主要成分,但醇溶蛋白与Z m C E N 作用的机制还不了解.研究表明:玉米醇溶蛋白的积累过程与细胞骨架有紧密联系,α醇溶蛋白在细胞骨架指导下,调控其基因转录形成m R N A ,然后到达内质网中,醇溶蛋白组分到达蛋白体中心区域,促使其体积增大,最后蓄积成球状蛋白体[１６].而Z m C E N 属于细胞骨架维管组织中心的一个组分,它与玉米醇溶蛋白发生互作,可能与醇溶蛋白在细胞中的积累存在联系,确保胚乳细胞中的醇溶蛋白达到足够数量及一定体积.二者之间的互作的机制研究对于玉米胚乳细胞的蛋白含量㊁籽粒大小乃至玉米产量等研究都有一定的意义.有研究报道N A C 是植物特有的一类转录因子,在植物的发育调控㊁抗病㊁激素信号转导㊁响应生物和非生物胁迫等都有作用[１７].本试验还筛选到２４０６西㊀北㊀植㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３８卷种与Z m C E N互作的B T B/P O Z(B r i cＧaＧb r a c t r a m t r a c kb r o a dc o m p l e x/P o xv i r u sa n dz i n cf i nＧg e r)蛋白家族蛋白,该家族的蛋白质N端都含有一个保守的B T B/P O Z蛋白Ｇ蛋白结合结构域,以同源或异源二聚体的形式执行功能.此类蛋白质已经被证明执行许多分子功能,包括转录调控㊁细胞形态维持㊁细胞增殖和凋亡㊁离子通道组装㊁泛素途径降解蛋白等[１８].其中１种B T B/P O Z结构的互作蛋白是一个N A C转录因子(L O C１０３６４０８７９).N A C家族转录因子在植物的次生细胞壁生物合成过程中也起着重要的调控作用[１９].Z h o n g等[２０]研究发现拟南芥N A C结构域转录因子S N D１(f o rs e c o n d a r y w a l lＧa s s o c i a t e dN A Cd o m a i n p r o t e i n)是调控纤维中次生壁合成的关键转录开关和转录活化剂. Z h o n g等[２１]研究表明,与水稻和玉米次生壁相关的N A C s(n a m e l y O s S WN s a n dZ m S WN s)在次生壁增厚方面双突变体缺失的缺陷[２２].柳展基等[２３]从玉米中克隆了Z m N A C１(E U２２４２７８),发现其受低温㊁干旱㊁高盐和A B A诱导表达,如形成纺锤丝㊁细胞板㊁细胞壁,并将细胞能够均等地拉向两极,以保证子代细胞能与其亲代有同样的遗传信息.由于植物细胞没有中心体,通过一个维管组织中心(MT O C)执行相同的功能,高度动态的微管和微丝骨架是高等植物细胞分裂和细胞生长所必须的重要基本组成成分.Z m C E N属于骨架结构微管组织中心蛋白,Z m C E N在MT O C中通过与其他蛋白作用,共同完成细胞有丝分裂的一系列活动[２１].推测Z m C E N与N A C６７互作也可能参与细胞骨架的建成㊁维持细胞形态,细胞壁的形成㊁细胞的均等分裂等.本研究也证实了Z m C E N与T O N１b蛋白存在互作,研究表明,T O N１b招募基序蛋白(T R M s)与T O N１b㊁蛋白磷酸酶２A共同作用,参与早前期带(p r e p r o p h a s eb a n d,P P B)形成及细胞分裂的调控[２４].研究结果显示,拟南芥C E N１在体内与T O N１a相互作用,参与细胞骨架及有丝分裂前皮层微管和微丝P P B的形成,而P P B在有丝分裂中决定细胞的分裂面和新细胞壁的位置[２５].T O N１b蛋白与P P B发生共定位,若将拟南芥的t o n１基因突变,则不能形成P P B.T O N１b蛋白为植物在P P B 形成所必须[２６].许多微管结合蛋白已经被证明参与P P B的形成,为P P B决定细胞分裂面的位置[２４].由此推测,研究Z m C E N与T O N１b的互作对于玉米细胞分裂中细胞板分裂面和细胞壁的形成非常重要,为进一步研究Z m C E N在玉米中的作用机制奠定了基础.近年来采用酵母双杂交系统,筛选出了许多相互作用且有意义的蛋白[２７Ｇ３０],如本实验中与Z mＧC E N相互作用的蛋白N A C６７㊁T O N１b等,进一步说明该系统在研究蛋白互作筛选候选蛋白方面具有重要意义.虽然该系统存在假阳性问题,但可以通过其他实验手段对互作蛋白进行进一步验证.在后面的研究中我们将对筛选到的其余蛋白逐一验证,并通过相互作用的蛋白研究Z m C E N的调控机制及生物学通路.参考文献:[１]㊀V E C C H I O AJD,H A R P E RJDI,V A U G H N K C,e t a l．C e n t r i nh o m o l o g u e s i nh i g h e r p l a n t s a r e p r o m i n e n t l y a s s o c i a t e dw i t h t h ed e v e l o p i n g c e l l p l a t e s[J]．P r o t o p l a s m a,１９９７,１９６(４):２２４Ｇ２３４．[２]㊀W I C KS,C H OSO．H i g h e r p l a n t s p i n d l e p o l e s c o n t a i na p r oＧt e i n t h a t r e a c tw i t ha n t i b o d i e s t ot h ec a l c i u mＧb i n d i n gp r o t e i nc e n t r i n[J]．J o u r n a l o f C e l lB i o l o g y,１９８８,１０７:４５５．[３]㊀S C H I E B E LE,B O R N E N S M．I ns e a r c ho f f u n c t i o nf o rc e nＧt r i n s[J]．T r e nd s Ce l lB i o l．,１９９５,５(５):１９７Ｇ２０１．[４]㊀S A L I S B U R YJ L．C e n t r i n,c e n t r o s o m e s,a n dm i t o t i c s p i n d l e p o l e s [J]．C u r r e n t O p i n i o n i nC e l lB i o l o g y,１９９５,７(１):３９Ｇ４５．[５]㊀S A L I S B U R YJL．C e n 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sa n o v e l c o m p o n e n t o f t h e y e a s t s p i n d l e p o l eb o d y t h a t i n t e r a c t s w i t h t h e y e a s t c e n t r i nh o m o l o g u eC d c３１p[J]．J o u r n a l o f C e l lB i o l o g y,２００２,１５９(６):９４５Ｇ９５６．[１０]㊀S AWA N TDB,MA J UM D E RS,P E R K I N S JL,e t a l．C e nＧt r i n３i sa ni n h i b i t o ro fc e n t r o s o m a l M p s１a n da n t a g o n i z e sc e n t r i n２f u n c t i o n[J]．M o l e c u l a r B i o l o g y o f t h eC e l l,２０１５,２６(２１):３７４１Ｇ３７５３．５０６４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀雷海英,等:玉米酵母双杂交c D N A文库的构建及Z m C E N互作蛋白的筛选[１１]㊀J E A N M,C Y N T H I A R,O L I V U E R F,e ta l．C E N T R I N２m o d u l a t e s h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o na n dn u c l e o t i d ee x c i s i o nr eＧp a i r i n A r a b i d o p s i s[J]．P l a n t C e l l,２００４,１６(６):１６３３Ｇ１６４３．[１２]㊀HU H,H E E H A NJH,C H A Z I N W J．T h em o d eo f a c t i o n o f c e n t r i n:b i n d i n g o fC a２＋a n da p e p t i d e f r a g m e n t o fK a r１pt o t h e CＧt e r m i n a l d o m a i n[J]．J o u r n 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