文库构建及酵母双杂交技术

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酵母双杂技术的原理和应用

酵母双杂技术的原理和应用一、酵母双杂技术的原理酵母双杂技术是一种重要的基因工程技术，其原理主要包括以下几个方面：1.酵母双杂技术的基本原理：酵母双杂技术基于酵母细胞中的两种杂交酵母菌株，一种包含目标酵母蛋白的报告基因，另一种包含潜在的酵母互补DNA库。

通过把这两个酵母菌株共同培养在含有特定酵母蛋白诱导剂的培养基中，使得目标酵母蛋白和潜在互补DNA库中的DNA相互作用，从而筛选出与目标蛋白相互作用的DNA序列。

2.双杂交酵母菌株的构建：首先需要构建含有目标酵母蛋白的报告基因表达酵母菌株，该菌株会在酵母细胞中表达目标蛋白。

同时，还需要构建潜在酵母互补DNA库，该库中含有大量酵母基因组DNA片段的克隆。

3.酵母菌株的培养和筛选：将目标蛋白报告基因酵母菌株和酵母互补DNA库菌株共同培养在含有诱导剂的培养基中，诱导目标蛋白和潜在互补DNA库中的DNA发生相互作用。

然后利用适当的筛选方法，如抗生素抗性筛选或含有荧光素底物的筛选，筛选出与目标蛋白相互作用的克隆。

二、酵母双杂技术的应用酵母双杂技术广泛应用于生物医药、生物学研究等领域，具有多个重要的应用方面：1.蛋白相互作用的研究：通过酵母双杂技术，可以快速筛选出与目标蛋白相互作用的DNA序列，从而深入研究蛋白相互作用的机制和功能。

这对于揭示生物体内复杂蛋白相互作用网络、研究疾病相关蛋白相互作用具有重要意义。

2.新药靶点的发现：通过酵母双杂技术，可以筛选出与药物分子相互作用的蛋白，从而为新药靶点的发现提供候选蛋白。

这对于药物研发和临床治疗具有重要意义。

3.基因功能研究：通过酵母双杂技术，可以筛选出与目标基因相互作用的蛋白，从而推断目标基因的功能。

这有助于揭示基因的调控机制和功能。

4.疾病相关基因的筛选：通过酵母双杂技术，可以筛选出与疾病相关的基因，从而对疾病的发生机制和治疗提供有价值的信息。

5.基因治疗的研究：通过酵母双杂技术，可以筛选出与治疗目标相关的蛋白或基因，从而为基因治疗的研究提供候选靶点或治疗策略。

Mate_Plate酵母双杂交文库构建中文说明书(clontech)

系统说明书PT4085-1 (PR013451)Cat. No. 630490Published February 2010“Mate & Plate™”文库构建系统说明书目录I. 介绍&操作流程 (4)II. 组份列表 (5)III. 附加产品推荐 (7)IV. 缩写列表 (8)V. 宿主菌株信息 (9)VI. 对照实验 (10)A. 总论 (10)B. 操作:对照同源重组克隆的实验操作 (10)VII. cDNA文库构建 (11)A. 操作:第一链cDNA合成 (11)B. 操作:长距离PCR (LD-PCR)扩增cDNA (13)C. 操作: CHROMA SPIN™ TE-400 纯化ds cDNA (14)VIII. 双杂交文库构建 (16)A. 酵母双杂交文库构建&筛选总论 (16)B. 操作:制作Mate & Plate文库 (16)IX. 参考文献 (18)X. 疑难解答指南 (19)附录A: 文库滴度测定 (24)附录B: 质粒信息 (22)附录C: 酵母生长培养基&补充物 (23)附录D: SMART™ 技术概述 (25)Protocol No. A Clontech Laboratories, Inc. Version No. PR013451 Takara Bio Company2“Mate & Plate™”文库构建系统说明书目录，续图表Figure 1.利用酵母的生物学知识构建Mate & Plate文库 (4)Figure 2. Mate & Plate文库构建概述 (11)Figure 3. SMART cDNA合成高质量cDNA (14)Figure4. CHROMA SPIN纯化柱和收集管 (15)Figure 5. pGADT7-Rec 载体图谱和克隆位点 (22)Table I:酵母宿主菌株的基因型 (9)Table II:根据不同SD培养基的表型测试 (9)Table III: RNA起始量和PCR最优循环数的相关性分析 (13)Table IV:酵母培养基套装2&酵母培养基套装2Plus的各组份 (23)Table V: Matchmaker黄金酵母操作用独立包装的酵母培养基 (23)Table VI:酵母双杂交筛选用的附加培养基&培养基补充物 (24)＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿A Clontech Laboratories, Protocol No. PT4085-1 Takara Bio Company Version No.PR0134513“Mate & Plate™”文库构建系统说明书1.介绍&操作流程酵母双杂交系统主要是从prey文库中筛选与已知蛋白（bait）有相互作用的蛋白（prey）。

灰飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建及分析

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ＰａｔｒｅｉｌｎＰｏｃｏｔｔｎ
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灰飞虱酵母双杂交ｃＮＤＡ的构建及分析肖冬来，邓慧颖，谢荔岩，吴祖建，谢联辉
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重组率约为９；增文库插入片段主要集中在１００１５０ｂ７扩００ｐ之间。随机挑取１Ｏ个克 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ，测序与ＧｅＢｎ经ｎａｋ数据库比对结果显示７个克隆具有同源序列，中Ｉ、９为已公布的灰飞虱序列。灰飞虱酵母双杂交ｃＮＡ文库其Ｌ２Ｄ
ｇｕｅｕｎｅｎｎｏｓｓｑｅｃｓｉＧｅＢａｋ．ＣｌｎｓＬ２ａｄＬ９ｗｅｅｔｅｓｉｅａｈｕｌｈｄｓｑｅｃｓＣｏｓｒｃｉｎｏｈｓｎｏｅｎｒｈａｎｓｔｅｐｂｉｅｅｕｎｅ．ｓｎｔｕｔｆｔｉｏｙａｔｔ — ｙｒｄｅｅｓｗｏｈｂｉＤＮＡｉｒｒｆＬｏｅｐａｔｉｌｕａｄｔｅｆｕｄｔｎｆｒｃｏｉｇｏｕｃｉｎｌｅｅｎＬ．ｌｂａｙｏａｄｌｈｘｓｒａｅｌｓｌｉｈｏｎａｉｏｌｎｎｆｆｎｔａｎｓｉｔｏｏｇｓｒａｅｌｓａｄｓｕｉｓｏｔｉｔｌｎｔｄｅｎＬ．ｓｒｔｌｓｖｒｓｉｔｒｃｉｎ．ｕｔｉｅｌ — ｉｕｎｅａｔｓａｕｏＫｅｒｓＬａｄｌｈｘｓｒａｅｌｓｙｗｏｄｏｅｐａｔｉｔｌ；ｕｙａｔｔ－ｙｒｄｅｓｗｏｈｂｉ；Ｇａｅｙｔｗａ；ｃＤＮ释e值褐飞虱肌球蛋广l2轻链琏闪灰毪虱细胞色素氧化酶哑摹基因褐飞虱肌球蛋门2轻链基因飞虱科wby一200016s核糖体rna基因褐飞虱卵黄原蛋白基因未发现同源基因柑橘木虱40s核糖体蛋白sa摹冈束发现同源堆阂灰飞虱al微管蛋白基因未发现同源基因3e一140004e一1623e

酵母双杂实验步骤

2.1.1 酵母双杂交2.1.1.1 Gateway入门克隆设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TTG-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TTG-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。

其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。

通过PCR扩增获得带有attB位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65℃。

获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA 的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下：将上述混合物加入离心管中，加入2μL BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。

进行BP反应时，需注意以下几项：(1) 对于BP反应来说，最高效的是采用线性的attB-PCR产物和超螺旋的attP入门载体；(2) 为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的；(3) 提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物最好不要超过250ng。

酵母双杂交.三杂交

由于三杂交筛选是在细胞核中进行，而细胞核并非许多反应发生的最佳场所，如有些蛋白质需要胞质酶的修饰，或在其定位到核时的错误折叠及不稳定性，常不能检测到相互作用。有些哺乳动物蛋白在酵母菌中不能正确折叠表达，以细菌、哺乳动物细胞为宿主的杂交系统现已建立，能更真实的模拟相互作用发生的自然细胞环境。对不能被转运到细胞核的蛋白质，如跨膜蛋白和分泌型蛋白，酵母三杂交系统则不能应用。目前，酵母三杂交系统仍是研究蛋白质与配体相互作用的有力手段，以后还可能发展出研究RNA-RNA，多蛋白相互作用及功能更加强大的杂交系统。
其中第一个融合蛋白由两部分组成，一部分为能结合lexA启动子的DNA结合结构域，另一部分为噬菌体衣壳蛋白MS2。第二个融合蛋白也由两部分组成，一部分为能激活lexA启动子的转录激活结构域，另一部分为有待研究的RNA结合蛋白“Y”。
这两个融合蛋白通过第三个融合的RNA分子相连，其一端为含有噬菌体衣壳蛋白MS2结合位点的MS2RNA，另一端为有待研究的RNA“X”。一旦“X”和“Y”能有相互作用就使得这个复合物形成一个功能性的转录激活因子，从而使得下游的LacZ基因和His3基因得以表达。 LacZ基因的表达水平能够通过在体外检测β半乳糖苷酶的活性来确定,His3基因的表达赋予了酵母细胞在缺乏组氨酸的培养基上生存的能力。通过缺陷培养基及β半乳糖苷酶的活性的测定就能判断在酵母菌内是否发生了RNA“X”和蛋白质“Y”的相互作用。
negative selection by adding FOA)
酵母双杂交操作主要流程
1. 分别构建BD和AD融合蛋白载体
BD
2. 分别将重组载体转化酵母菌细胞
BD
3. 对酵母转化子进行自激活检测
AD AD

630490 酵母双杂交文库构建实验流程(clontech)

第一链cDNA合成1.准备: 高质量的Poly A 或总RNA2. 在微量离心管中混匀以下试剂：1–2 μl RNA 样本(0.025–1.0 μg poly A+或0.10–2.0 μg 总RNA)1.0 μl CDS III 或CDSIII/6 引物1–2 μl 去离子水(补齐体系到4.0 μl)4.0 μl 总体积注意: 对照实验时，请使用1μl *1μg+ 的对照RNA。

CDSIII = Oligo-dT；引物CDSIII/6 =随机引物3. 72°C ，孵育2 min。

4. 冰上冷却2 min，然后14000rpm，10sec，瞬时离心。

5. 混合以下试剂，将混合液加入Step4中的经过变性且结合有引物的RNA样本中，轻拍混匀。

2.0 μl 5X First-Strand 缓冲液1.0 μl DTT (100 mM)1.0 μl dNTP 混合物(10 mM )1.0 μl SMART MMLV 反转录酶6. 只有使用随机引物(CDSIII/6)实验才进行此步骤[如果采用Oligo-dT(CDSIII)请忽略此步骤，直接进行Step7]，25°C，室温孵育10 min。

7. 42°，孵育10 min。

注意: 孵育在热盖的PCR仪中进行。

若用非热盖的PCR仪或水浴，请在反应管中加入一滴矿物油来避免水分蒸发。

8. 加入1 μl SMART III-modified oligo，混匀，42°C，孵育1 hr。

9. 75°C ，10 min终止第一链合成反应。

10. 室温冷却，加入1 μl RNA酶H (2U)。

11. 37°，孵育20 min。

12. 继续进行LD-PCR 扩增(Section VII.B)。

注意: –20°C下可保存3个月。

第一链反应最终体积为15μl• 10 μl SMART III Oligo(10 μM; 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG CCATTATGGCCGGG-3’)• 10 μl CDS III 引物(10 μM; 5’-AT TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA TG-d(T)30VN-3’)*23个碱基• 10 μl CDS III/6 引物(10 μM; 5’-AT TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA TG-NNNNNN-3’)注意: N = A, G, C, or T; V = A, G, or C• 50 μl 5’ PCR 引物(10 μM; 5’-TTCCACCC AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3’)25个碱基•50 μl 3’ PCR 引物(10 μM; 5’-GTATCGATGCCCACCC TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3’)第二链cDNA合成（LD-PCR）尽量使用最小的循环数来得到3-6ug的ds cDNA。

浅析酵母双杂交文库构建的方法

浅析酵母双杂交文库构建的方法酵母双杂交技术是分子生物学研究领域的重要实验手段，是利用酵母遗传学方法来分析蛋白质之间的相互作用，现在已被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域。

酵母双杂交文库构建一般包括核体系和膜体系两种方法。

核体系包含通过同源重组的方式实现文库的构建、根据Gateway的技术实现建库采用BP重组和LR重组分别获得初级文库与次级文库这两种方法。

膜体系是由酶切连接的方法实现建库，主要是基于分离的泛素介导膜蛋白互作信号的识别。

美迪西生物医药专业从事酵母双杂交，出具权威检测数据报告，具有独立优质实验室，专业实验人员，提供详细的酵母双杂交实验步骤，原始数据和图片，结果分析。

1、膜体系和核体系酵母双杂筛库的不同点筛库所用菌株不同，在通过共转方式筛库时，核体系使用Y2HGold酵母菌，膜体系使用NMY51菌株。

核体系除了可以选择共转筛库，还可以通过mating的方法进行。

Mating自然要用到两种性别的菌株，含有AD文库质粒的Y187和含有BD质粒的Y2HGold。

2、核体系和膜体系在整个实验的流程上的差异。

值得注意的是核体系酵母双杂中如果BD基因本身为转录因子时，可能存在自激活现象，因此在诱饵载体构建完成后首先要做的则是诱饵基因的自激活检测。

而膜体系酵母双杂，理论上由于诱饵蛋白被“挂”在细胞质膜上，在没有互作蛋白相互靠近时，泛素的两部分彼此分离，转录因子不会被切割，便不会导致报告基因表达。

而对于膜体系酵母双杂，因为诱饵蛋白在细胞膜上的跨膜方式不同，构建BD载体时选用的质粒不同。

基于此，在BD载体构建完成后，首先要做的是功能验证，亦即所构建的BD质粒是否适用于该系统。

下面是两种体系的筛库主要实验流程。

（1）核体系筛库实验流程（2）膜体系筛库实验流程（3）另外，在阳性克隆的筛选方法上两者亦不同。

核体系，因为报告基因中有MEL1，在有蛋白互作时，α-半乳糖苷酶被表达，即在含X-α-Gal的选择培养基上阳性菌落呈蓝色。

酵母双杂交具体实验流程

酵母双杂交具体实验流程
酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它基于酵母细胞内存在的转录激活子结合域（Transcription Activation Domain，TAD）和DNA结合域（DNA Binding Domain，DBD），通过融合特定的蛋白质序列并在酵母细
胞中共同表达，以实现筛选并鉴定蛋白质相互作用的目的。

酵母双杂交具体实验流程如下：
1.构建启动子驱动的酵母表达载体
该载体包含两部分：AD与DB，分别携带TAD和DBD结构域。

这些结构域可以具体化作为外源蛋白的两个互补部分，这样当它们相互结
合时，激活酵母内的报告基因（RLUC或LacZ）表达，并通过信号放
大器Cre的介入增强了信号。

2.构建融合基因的酵母表达载体
将想要研究的两种蛋白质的氨基酸序列分别连接到AD与DB的C端，形成融合蛋白质基因，然后将融合基因与启动子驱动的表达载体转化
入双杂交酵母细胞。

3.获得蛋白质相互作用的筛选和确认
通过对酵母双杂交转化后的细胞进行筛选，并通过对表达的信号进行观察和测量，得到蛋白质相互作用的筛选结果。

4.确定筛选结果的真实性
在确定特定蛋白质相互作用是否真实的过程中，通常会进行一些补充实验。

例如，可以通过分析生化反应，并利用免疫共沉淀等方法验证筛选结果的可靠性。

总的来说，酵母双杂交是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它可以快速、可靠地鉴定蛋白质相互作用，从而帮助研究者更深入地探究蛋白质的功能和作用机制。

酵母双杂交技术

酵母双杂交常规技术一．双杂交系统原理及应用范围蛋白质之间的互作是很多反应机制分子水平的核心动作，如DNA合成、转录激活、蛋白质翻译、蛋白质定位和信号转导等所有的的反应的完成都涉及到蛋白质复合体的作用。

而随着酵母双杂系统的成熟和完善，其在蛋白质互作研究中的应用越来越广泛。

酵母双杂交系统是基于转录因子的典型结构特征所建立的，它利用了酵母的转录因子GAL4基因产物，该蛋白拥有两个典型的转录因子结构域DNA结合结构域（BD）与转录激活结构域（AD）。

前者结合GAL1启动子区的DNA序列，后者则激活转录（Fields and Song，1989）。

Fields和Song分别构建了含有含有编码GAL4 DNA结合结构域（GAL4BD）和GAL4转录激活结构（GAL4AD）序列的载体。

将我们所要研究的目的基因分别装载到这两个质粒载体中，两个结构域序列则分别与基因的ORF进行融合。

当转入相应酵母菌株后，若在酵母内表达的不同蛋白发生互作，则将使GAL4-BD和GAL4-AD相互靠近结合，再进一步与上游激活序列结合，激活相应报告基因（report gene）的表达。

特点与优点酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。

酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点：（1）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。

（2）检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。

（3）检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。

（4）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。

局限性和存在的问题酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法，有多方面的应用，但仍存在一些局限性。

酵母文库筛选原理

酵母文库筛选原理
酵母文库筛选原理主要基于酵母双杂交技术和酵母单杂交技术。

在酵母双杂交中，使用两个部分的蛋白质构建一个可激活转录的转录因子。

这两个部分是：靶蛋白的DNA结合域与活化域；以及一个酵母融合库中的蛋白质（假设是潜在的互作伴侣）的靶蛋白结合域（例如目标蛋白的激活域）。

如果目标蛋白与酵母融合库中的蛋白质相互作用，则两个融合蛋白质结合并形成一个激活复合物，从而激活转录因子。

激活的转录因子会促使报告基因的表达，例如lacZ（编码β-半乳糖苷酶）或Ade2（参与腺嘌呤合成）等。

在酵母单杂交中，利用启动子中DNA序列能够特异性结合转录因子蛋白（TF）的这一特性。

以DNA序列为诱饵，从酵母文库中筛选猎物蛋白（TF），只有当TF与DNA序列特异性结合，启动下游报告基因。

另外，
还有Motif文库的工作原理，是诱饵与猎物角色互换，以转录因子蛋白（TF）为诱饵，只有当TF与Motif文库中特定DNA序列相结合时，启动下游报
告基因，从而得到与TF结合的Motif序列。

以上信息仅供参考，如需了解更多信息，建议查阅相关书籍或论文。

文库构建

·着丝粒（centromere ， CEN）：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在 YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。
·自主复制序列（autonomously replication sequences， ARS）一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号。
（1）对载体的要求
载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。
（2）目前常用的载体
载体系列：容量为 24 kp
cosmid载体：容量为 50 kb
YAC：
容量为 1 Mb
BAC:
容量为 300 kb3. 基因构建的一般步骤（1）染色体DNA大片段的制备
断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。
8. 哺乳动物人工染色体（MAC）
哺乳动物人工染色体（MAC）指从哺乳动物细胞中分离出复制起始区、端粒以及着丝粒构建而成的克隆载体。它可以克隆大于1000kb的外源DNA片段。
应用领域
（1）有丝分裂和减数分裂对DNA片段大小的定量分析。（2）研究哺乳动物细胞中染色体功能。（3）对复杂的基因做功能分析。（4）用于体细胞基因治疗
yac载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因色氨酸亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因trp1leu2和his3尿嘧啶合成缺陷型基因ura3等以及赭石突变抑制基因sup4带有赭石突变ade21的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落当带有赭石突变抑制基因sup4的载体存在于细胞中时可抑制ade21基因的突变效应形成正常的白色菌落
Active domain

酵母双杂

取SD/-Trp平板上挑取经PCR验证过后菌落直径大于2mm的pGBKT7和
pGBKT7-XX酵母转化菌分别接种于5mL SD/-Trp的液体培养基中， 30℃，
220rpm，培养2～3天，测其OD60定
利al
351ml
两种质粒。所以，这种情况下，最好先将诱饵质粒转入
注意：此处的加入顺序非常重要，PEG必须得首先加入，它可以将酵母细胞与高浓度的LiAc分开，使酵母免
酵母中（用本方法或快速转染的方法），然后再Leu、SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-
1、制备酵母感受态，实验步骤同上；
7、以6000～8000rpm离心30s，用微量移液枪尽量除去转
2、将1 mL单链载体DNA样品煮沸5 min，迅速化混合液；
置于冰水中冷却； 3、取制备好的酵母感受态，14000rpm，离心 30s，用微量取样器尽量除去残留的LiAc； 4、往盛有酵母感受态的离心管中按表7加入酵母转化所需物质：
6、1000g，离心10分钟，弃上清，用10 mL含有卡那霉素（终浓度为50μg/mL ）的0.5×YPDA重悬菌体；（酵母悬浮液的体积大约为11.5mL）
7、取100 μL酵母悬浮液进行稀释，步骤同2.4.1，然后吸取100 μL 10-1，10-2，10-3，10-4号管的稀释液分别涂布于SD/-Trp/-Leu平板上，30℃，培养3～5天，最后根据SD/-Trp/-Leu平板上的菌
1、取-80℃冻存的诱饵载体的酵母转化菌，在SD/Trp固体平板上划线培养，30℃，培养3～5天；
2、挑取SD/-Trp固体平板上菌落直径大于2mm的转化酵母单菌落，接种到已灭菌的50 mL SD/Trp液体培养基中（250ML瓶子装），30℃， 260rpm，培养至OD600=0.8（大约16～20小时）；

酵母双杂交原理与实验具体流程

galactosidase. MEL1 is endogenous to both Y187 and AH109. Because αgalactosidase is a secreted enzyme, its activity can be detected by adding X-α-Gal to the selection plate: If MEL1 is active and X-α-Gal is present, the colony will turn blue. lacZ in Y187 exhibits a high level of induced β-galactosidase activity in a poAD通过这个“桥梁”共同起作用，激活报告基因（ADE2、HIS3 、 lacZ和 MEL1）的转录。
推荐使用Clontech公司的第三代载体，pGADT7-Rec 和 pGBKT7进行双杂交筛选，因为它们产生更少的假阳性。对于cDNATA regions can be switched to create novel promoters
For GAL4-based systems, either a native GAL UAS or a synthetic UASG 17-mer consensus sequence (Heslot & Gaillardin, 1992) provides the binding site for the GAL4 DNA-BD. If you are putting together your own one- or two-hybrid system, you must make sure that the reporter gene's promoter will be recognized by the DNA-BD moiety encoded in your DNA-BD fusion vector.

非生物胁迫诱导的棉花酵母双杂交文库构建及GhJAZ1互作蛋白筛选

核农学报2023，37（11）：2158~2165Journal of Nuclear Agricultural Sciences非生物胁迫诱导的棉花酵母双杂交文库构建及GhJAZ1互作蛋白筛选蔡肖李兴河王海涛刘存敬唐丽媛张素君张建宏*（河北省农林科学院棉花研究所/农业农村部黄淮海半干旱区生物学与遗传育种重点实验室/国家棉花改良中心河北分中心，河北石家庄050051）摘要：非生物胁迫导致棉花生长发育受到抑制，严重影响棉花的产量和品质。

为了深入探究棉花非生物逆境响应的分子作用机制并鉴定GhJAZ1的互作蛋白，本研究以陆地棉标准系TM-1为材料，采用Gateway重组技术构建了非生物胁迫诱导的陆地棉酵母双杂交cDNA文库，获得的初级文库总克隆数为1.2×107 CFU，次级文库总克隆数为1.6×107 CFU，重组阳性率100%，酵母文库滴度为5.0×107 cells·mL-1，酵母克隆平均插入片段>1 000 bp，符合建库标准，可用于后续酵母双杂交筛选。

以GhJAZ1为诱饵，构建pGBKT7-GhJAZ1诱饵蛋白表达载体，经毒性检测及自激活活性检测，明确了诱饵质粒在酵母系统中无毒性和自激活活性，可直接用于酵母文库筛选。

利用酵母双杂交筛选构建的非生物胁迫诱导的酵母cDNA文库，得到72个初筛阳性克隆，经测序、序列比对和酵母回转验证，获得11个与GhJAZ1相互作用的候选蛋白。

选取其中4个候选蛋白，利用酵母双杂交进一步确认了GhJAZ1与候选蛋白的相互作用关系。

本研究结果为深入分析棉花非生物胁迫响应的调控网络奠定了良好的基础，为解析GhJAZ1低温应答分子机理提供了重要参考。

关键词：棉花；互作蛋白；酵母双杂交；非生物胁迫；GhJAZ1DOI：10.11869/j.issn.1000‑8551.2023.11.2158JAZ（Jasmonate ZIM-domain）蛋白作为E3泛素连接蛋白降解复合体SCF COI1的靶蛋白，是茉莉素（jasmonic acid，JA）信号转导途径中重要的转录抑制因子之一［1-2］。

酵母双杂实验原理及技术

蛋白的酵母双杂交实验——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用第一部分系统简介1. 实验原理蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控影响的实验。

很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。

这种DNA 结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。

目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和Gal4系统两种。

在LexA 系统中，DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在Gal4系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。

在利用GAL4系统筛选cDNA 文库或研究蛋白间的相互作用时，DNA 结合结构域与靶蛋白即“诱饵”相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。

一般情况下，单独的BD 可以与GAL4上游活化序列（GAL UAS ）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD 分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。

在BD 与AD 要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。

GAL4系统的原理如图所示：图一：酵母双杂交系统工作原理Kan r Amp r pGBKT7-bait pACT2-cDNA2．系统特点同以往研究蛋白质—蛋白质之间相互作用的实验手段相比，双杂交系统具有其独特优势。

酵母双杂交步骤

酵母双杂交步骤酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质相互作用和信号转导通路。

下面将介绍酵母双杂交的步骤。

第一步：构建酵母双杂交载体酵母双杂交载体是用于表达融合蛋白的质粒。

一般来说，酵母双杂交载体包括两个部分：DNA结合域（DBD）和激活域（AD）。

DBD 和AD分别与目标蛋白的DNA结合域和激活域融合，从而形成融合蛋白。

常用的酵母双杂交载体有pGBKT7和pGADT7。

第二步：构建酵母双杂交菌株酵母双杂交菌株是用于表达融合蛋白的酵母菌株。

一般来说，酵母双杂交菌株包括两个部分：DBD和AD。

DBD和AD分别与目标蛋白的DNA结合域和激活域融合，从而形成融合蛋白。

常用的酵母双杂交菌株有AH109和Y187。

第三步：酵母双杂交筛选酵母双杂交筛选是用于筛选蛋白相互作用的方法。

一般来说，酵母双杂交筛选包括两个步骤：初筛和确认。

初筛是通过生长选择培养基（SD/-Leu/-Trp）筛选出具有融合蛋白的酵母菌株。

确认是通过生长选择培养基（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade）筛选出具有蛋白相互作用的酵母菌株。

第四步：酵母双杂交验证酵母双杂交验证是用于验证蛋白相互作用的方法。

一般来说，酵母双杂交验证包括两个步骤：β-galactosidase检测和Western blot检测。

β-galactosidase检测是通过检测酵母菌株中β-galactosidase的活性来验证蛋白相互作用。

Western blot检测是通过检测融合蛋白的表达来验证蛋白相互作用。

酵母双杂交是一种重要的分子生物学技术，可以用于研究蛋白质相互作用和信号转导通路。

通过构建酵母双杂交载体和酵母双杂交菌株，进行酵母双杂交筛选和酵母双杂交验证，可以得到蛋白相互作用的信息。

请详述酵母双杂交的基本原理和具体操作步骤。

酵母双杂交是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质相互作用和基因功能。

酵母双杂交的基本原理是利用酵母细胞中的转录激活因子来检测两个蛋白质相互作用。

该技术基于转录激活因子在酵母细胞中诱导报告基因表达的原理。

核心思想是将需要检测
相互作用的两个蛋白质分别与两个互补的转录激活因子结合，从而使这两个转录激活因子
相互结合并激活报告基因的表达。

具体操作步骤如下：
1. 构建酵母双杂交载体：
- 选择一个载体，将一种转录激活因子的DNA序列插入该载体中的启动子和报告基因
之间，构建转录激活因子的融合蛋白。

- 在另一个载体上将另一种转录激活因子的DNA序列插入该载体中的启动子和报告基
因之间。

2. 转化酵母细胞：
- 将上述构建好的双杂交载体分别转化进酵母细胞中。

这一步骤常用的方法有直接转化、化学转化或电击转化。

- 在转化后，将酵母细胞培养至适当的条件，以使其能够自我复制并表达融合蛋白。

3. 鉴定蛋白相互作用：
- 将转化后得到的酵母细胞分别进行孵育和培养。

- 如果两个融合蛋白能够相互结合，其结合后的转录激活因子能激活报告基因的表达，则酵母细胞会在选择性培养基上生长，形成菌落。

- 将生成的菌落进行筛选和鉴定，确定其是否存在转录激活作用。

常用的方法有β-
半乳糖苷酶报告基因检测、荧光素酶报告基因检测等。

通过上述酵母双杂交的基本原理和具体操作步骤，可以很方便地研究蛋白质相互作用
和基因功能。

酵母双杂交技术的原理及其应用

酵母双杂交技术的原理及其应用1. 引言酵母双杂交技术是一种经典而常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质间相互作用以及蛋白质与DNA或RNA的相互作用。

本文将介绍酵母双杂交技术的原理及其应用。

2. 原理酵母双杂交技术基于酵母细胞内的转录因子相互作用原理，利用酵母细胞内的转录活性来检测蛋白质间的相互作用。

其基本步骤如下：1.构建载体：将目标蛋白质的编码序列克隆到酵母双杂交载体中，该载体通常包含一个激活域和一个DNA结合域。

2.构建酵母菌株：将构建好的双杂交载体转化到酵母菌株中，产生转录因子的表达。

3.杂交实验：将两个不同的酵母菌株分别转化目标蛋白质的编码序列，使得两个蛋白质分别与激活域和DNA结合域相连。

4.检测蛋白质相互作用：利用报告基因检测酵母菌株中的转录活性，若目标蛋白质间存在相互作用，则报告基因被激活，并产生可观察的表型。

3. 应用3.1 蛋白质相互作用研究酵母双杂交技术广泛应用于研究蛋白质间的相互作用关系。

通过构建不同的载体和菌株，可以很方便地筛选和鉴定蛋白质相互作用的结构域和关键基序。

这有助于揭示蛋白质相互作用的机制和信号通路。

3.2 酶底物筛选酵母双杂交技术还可以用于酶底物的筛选。

通过将酶和可能的底物序列构建成双杂交载体，并转化到酵母菌株中，可以快速筛选出与酶底物结合的蛋白质。

这对于研究酶的底物特异性和酶促反应机理具有重要意义。

3.3 药物靶点筛选利用酵母双杂交技术，可以通过构建包含药物分子和可能的靶点蛋白质的双杂交载体，进行药物靶点的筛选。

这种方法可以高效地从大量的分子库中筛选出与药物相互作用的潜在靶点，对于药物开发具有重要意义。

3.4 蛋白质与DNA/RNA相互作用研究除了研究蛋白质间相互作用外，酵母双杂交技术还可以用于研究蛋白质与DNA/RNA的相互作用。

通过将DNA/RNA序列与目标蛋白质的编码序列构建成双杂交载体，并转化到酵母菌株中，可以检测蛋白质与DNA/RNA的相互作用，并进一步研究该相互作用的功能和调控机制。

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第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1 基因组文库的构建基因组文库（genomic library）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。

理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。

1. 1构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。

第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1.1.1对载体的要求：载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。

1.1.2目前常用的载体：载体系列（容量为24 kp ）、cosmid载体（容量为50 kb ）、YAC（容量为1 Mb ）、BAC （容量为300 kb）1.2 基因文库构建的一般步骤1.2.1染色体DNA大片段的制备：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。

不能用一般的限制性内切酶消化法，使用物理切割法或不完全酶切法。

1.2.2载体与基因组DNA大片段的连接：直接连接、人工接头或同聚物加尾。

噬菌体载体构建基因组文库第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2 cDNA文库的构建cDNA克隆的基本过程是通过一系列，酶酶催作用，使poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主细胞，构建包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。

2.1高质量mRNA的制备应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System 分离Poly(A)RNA。

将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。

PolyAT tract mRNA 的分离纯化过程第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2.2反转录成cDNA可同时在反转录系统中加入Oligo(dT)12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA；应选用活性较高的反转录酶(Reverse transcriptas)；应选用甲基化dCTP；应保证所获得双链cDNA 的方向性。

cDNA克隆时，必须考虑到目的基因mRNA在特定的生物体组织中的含量问题。

根据mRNA分子含量的多寡（丰度），可将其划分为高丰度、中丰度和低丰度三种类型。

寡聚(dT)12-18随机6碱基引物R 6寡聚(dT)12-18随机6碱基引物R 6mRNA (A)n (T)12-18(A)n (A)n(T)12-18R 6R 6R 6R 6R 6R 6第二链合成(A)n(T)12-18(A)n R 6R 6R 6R 6R 6R 6(A)n (T)12-18Eco RI Eco RI 加上EcoRI 接头，磷酸化，cDNA 分级cDNA 合成完毕，准备连接第一链合成cDNA 合成过程示意图第四章基因文库构建及酵母双杂交技术接头及引物序列无RNaseH活性的反转录酶，5’甲基化的dNTPXhoIRNaseH，DNA聚合酶IXhoIEcoRI接头，T4连接酶EcoRI XhoIXhoI酶切XhoI完整有方向的cDNA cDNA合成的分子修饰cDNA文库的构建3 RACE技术cDNA 3′端的快速扩增法（3′RACE 法）(RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends)•3`-Full RACE法cDNA 5′端的快速扩增法（5′RACE 法）(RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends)5 ’ RACE原理●Self-Ligation 法5’ RACE 法种类1.使用RNA Ligase 的5’ RACE 法●Self-Ligation Method●Adaptor-Adding Method2. 使用TdT (Terminal DeoxynucleotidylTransferase) 的5’ RACE 法Adaptor-Adding Method 原理TdT 法原理几种5’ RACE 法的比较¿É·ñ½øÐNested PCR TdT·¨ÖÐº¬PolyG ²»¿ÉµÍSelf-Ligation·¨ÒýÎïÇé¿öÀ©ÔöÌØÒìÐÔ¸ßÖÐ¸ß¿ÉÌØÒìÐÔ¸ßµÍÌØÒìÐÔ¸ß¿ÉMethodAdaptor-Adding·¨Á¬½ÓÐ§ÂÊ4 酵母双杂交系统Yeast Two Hybrid System (Interaction trap) 4.1酵母双杂交系统的作用90年代，纽约大学的S. Field等建立。

有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质4.2酵母双杂交系统的原理4.2.1 结构域（Domain）合作许多真核生物的转录激活因子都是由两个在结构上可以分开的、功能上也相互独立的结构域组成。

例如：啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4:DNA binding domain Active domain N C1-147aa 768-881aa上游激活序列（UAS ）转录机GAL4效应基因结合结合激活转录只要DNA binding domain （DNA-BD ）与Active domain （AD ）靠近就能够表现转录激活活性。

实验发现：转录表达4.2.2 拆开Domain用重组DNA技术把GAL4的两个Domain分开，就丧失了激活效应基因的能力。

Active domainDNA binding domain结合上游激活序列（UAS）转录机GAL4效应基因不能转录4.2.3 重组Domain用重组DNA 技术把这两个Domain 分别与两个不同的多肽连接。

Active domain 蛋白A蛋白B DNA binding domain 在体内，蛋白A 与蛋白B 是否能结合。

通过效应基因是否被激活来检查：4.2.4 观察报告基因表达上游激活序列（UAS ）转录机GAL4效应基因蛋白ADNA binding domain 转录激活domain蛋白B GAL4的DB domain 与AD Domain 也不能靠近，所以仍然不能启动效应基因的转录。

不能转录（1）如果蛋白A 与蛋白B 不能相互结合上游激活序列（UAS ）转录机GAL4效应基因蛋白ADNA binding domain 转录激活domain蛋白B 激活转录GAL4的DB domain 与AD Domain 也能靠近，所以能启动效应基因的转录。

转录表达（2）如果蛋白A 与蛋白B 能相互结合双杂交原理X基因和Y基因产物的相互结合，导致reporter gene表达。

Reporter gene表达就可说明X基因产物于Y基因产物能结合。

4.3 构建双杂交体系的宿主菌删除基因组中的内源野生型GAL4基因使酵母菌只能利用载体表达的GAL4蛋白。

此外还有其他营养缺陷。

如：SFY526; HF7c 等菌株。

4.4 构建报告基因（reporter gene）GAL4的效应基因是his3/lacZ/URA3。

GAL4激活组氨酸合成酶的表达，使酵母菌能生长在组氨酸缺乏培养基上。

4.5 构建双杂交体系的穿梭质粒4.5.1 穿梭质粒（shuttle plasmid ）既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母菌中复制和表达的质粒。

4.5.2 双杂交体系需要两种穿梭质粒分别携带已知的靶蛋白基因和携带未知基因序列。

（1）BD-plasmid靶基因按正确的读码结构和取向克隆在GAL4的BD之后。

P: ADH1启动子。

T: ADH1终止子。

ADH：Alcoholdehydrogenase核定位信号是GAL4本身的一部分筛选标志：TRP（2）AD-plasmid外源基因按正确阅读框克隆到GAL4的AD片断之后。

P: ADHI启动子。

T: ADHI终止子。

核定位信号是SV40的T抗原的序列筛选标志：LEU24.6 酵母双杂交的实验过程报告基因：HIS（合成组氨酸）4.6.1 把蛋白A插入到BD质粒上（pGBT9）4.6.2把蛋白B插入到AD质粒上（pGAD424）4.6.3 两种重组质粒共同转化酵母菌（HF7c）4. 6.4筛选观察（1）存活选择在缺少亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）培养基上筛选双载体转化子。

双载体转化才能合成亮氨酸和色氨酸，菌体存活。

Trp-Leu-（2）蛋白结合选择在缺少组氨酸（HIS）、亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）的培养基上筛选蛋白A和蛋白B 能相互作用的双载体转化子。

His-Trp-Leu-。