RNA提取器材及试剂预处理

RNA的提取准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)操作步骤:1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。

样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。

TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。

TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。

加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。

一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。

离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。

处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。

取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。

样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。

RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。

用异丙醇沉淀水相中的RNA。

每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。

RNA提取实验材料实验耗材：1.5ml灭菌EP管、去RNA酶枪头、、高速低温离心机试剂：Trizol、氯仿（三氯甲烷）、异丙醇、DEPC水、无水乙醇实验步骤：1.对于培养细胞样品：贴壁细胞：1)去除培养液，加PBS清洗，按照6孔板每孔加入500μl Trizol细胞裂解液，移液枪反复吹打至细胞完全脱落后，将细胞裂解液转移至1.5ml 去RNA EP管中（可置-80℃保存）；2)每管加入100μl氯仿（三氯甲烷），轻柔的上下颠倒混匀，冰上静置10分钟，置12000转4℃离心15分钟；小心取出EP管，可清楚看到管内3分层，从上到下依次为：上层无色透明液体（RNA层）、中层白色沉淀（脂质层）、下层粉红色油状液体（苯酚-氯仿层）；3)尽可能多的取出上层无色透明液体（200~300μl）至一新的1.5ml EP管中，若取出沉淀，需重新离心再取；4)每管加入等体积异丙醇，振荡、混匀，4℃静置10分钟。

12000转4℃离心10分钟，取出EP管可见下层白色沉淀，弃上清液；5)加入500μl 75%无水乙醇（无水乙醇与DEPC水，现配现用），上下颠倒、摇晃EP管至白色沉淀漂浮，7500转4℃离心5分钟，弃上清，75%无水乙醇重复清洗一次。

弃上清，瞬时离心数秒，移液枪小心去除多余上清液，打开EP管盖置超净台风干；6)至管内白色沉淀消失完全，加20-50μl DEPC水，轻轻振荡溶解RNA。

置-80℃保存一段时间后，用NanoDrop2000测样品RNA浓度，加适量DEPC水稀释RNA至200或500ng/μl。

2.悬浮细胞：2000rpm离心3min收集细胞，去上清，加入PBS洗1次，离心去除PBS(尽量去除干净)，加入相应量的Trizol试剂吹打混匀。

其他步骤同贴壁细胞RNA 提取操作。

3.组织样本：取50~100mg的组织加入1 ml Trizol试剂，用匀浆器打匀（Trizol 先放于冰上）。

其余步骤同贴壁细胞RNA提取操作。

一、实验准备1、实验器具与材料：（1）移液枪：1ml、200ul、10ul（2）吸头：1ml、200ul、20ul（3）吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个（4）EP管1.5ml、100ul（5）玻璃研磨器（6）容量瓶：1000ml（7）盐水瓶：100ml（8）15ml塑料管一个（配75%乙醇用）2、实验器具的处理与准备（1）塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。

（2）玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）先泡酸过夜，冲洗干净后，在1‰DEPC水中泡8小时左右，37℃烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次。

（3）金属制品：（镊子等）先洗干净，再送干烤3次。

（不需要泡DEPC水）3、试剂配制和准备：（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml 容量瓶中静置4小时后备用。

配75%乙醇的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压。

（2）75%乙醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水：无水乙醇=1：3），然后放于-20℃备用。

（3）异丙醇：放入棕色瓶（4）氯仿：放入棕色瓶（5）Trizol：100ml/瓶存放于4℃图：TRIzol抽提总RNA步骤二、抽提时注意事项全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。

三、抽提步骤1、匀浆化作用取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP 管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。

颠倒混匀10下，室温静置5分钟。

2、分离阶段每1mlTrizol中加0。

RNA提取准备工作及注意事项RNA提取是分子生物学实验中常用的操作步骤之一，它是从细胞或组织中提取RNA分子的过程。

在进行RNA提取前，需要进行一系列的准备工作以及注意事项，以确保提取出的RNA质量好、纯度高。

下面是RNA提取的准备工作及注意事项的详细介绍。

一、实验前准备1.实验器材准备：常用的器材有离心管、离心机、恒温水浴器、pH计、显微镜等，根据实验的需要选择相应的器材，并确保所有器材都经过充分的洗涤和消毒。

2.试剂准备：RNA提取试剂盒通常包括缓冲液、酚-氯仿、异丙醇等，根据试剂盒的说明书准备相应的试剂溶液，并保证试剂的纯度和保存状态。

3.工作区准备：RNA提取实验应在清洁、干净的台面上进行。

实验室湿度应保持在50-60%之间，温度保持在20-25°C之间，以防止RNA降解和污染。

二、实验注意事项1. 避免污染：RNA易受到RNase的污染，因此，实验操作时应避免污染源。

严格控制实验室环境的清洁程度，使用无RNase酶的试剂和离心管，避免直接接触RNase。

2. 快速操作：RNA易被RNase降解，因此在提取过程中应尽量减少操作时间。

在每一个步骤中，应迅速进行，尽量避免长时间的搅拌和振荡。

4.酚-氯仿提取法：酚-氯仿法是一种经典的RNA提取方法，但需要注意的是，该方法中酚对人体有毒，因此在操作时应注意避免接触皮肤和吸入。

5.商业试剂的选择：市场上有许多RNA提取试剂盒可供选择，根据实验需求和预算，选择可靠的商业试剂。

确保试剂的批次一致，并严格按照说明书操作。

6.RNA样品的保存：提取得到的RNA样本应立即保存在低温条件下，如-80°C冰箱中，以避免RNA的降解和污染。

7.评估RNA质量：提取得到的RNA样品可以通过吸光光度计检测A260/A280比值来评估其纯度。

通常来说，纯度好的RNA样品A260/A280比值应在1.8-2.0之间。

总结：RNA提取是一项关键的实验步骤，准备工作和注意事项的严格执行对RNA提取的结果和后续实验的顺利进行非常重要。

RNA的提取及定量操作步骤主要仪器及试剂1.原则避免RNA酶污染。

2.主要仪器及试剂①紫外分光光度计（以下以Bio-Rad公司的SmartSpecTM3000分光光度计为例）。

②无菌乳胶手套（无滑石粉）、口罩、离心管（EP管）、移液器及枪头、匀浆器等。

③Trizol、氯仿（三氯甲烷）、异丙醇、乙醇、DEPC处理水等3.操作步骤（全程戴手套和口罩）①Trizol处理。

将细胞培养液细胞吸出后，用PBS洗两次，加入I ml Trizol，室温裂解1~2min，用移液器均匀吹下细胞并置于EP管中，上下轻柔颠倒10次，室温静置5min。

组织样品可以加入Trizol后匀浆，后续的步骤和细胞样品相同。

Trizol的用量一般1ml至少可以处理一个长满的25cm2细胞培养皿的细胞或200mg的组织。

②加1/5体积的氯仿（如1 ml Trizol加0.2ml氯仿），颠倒混匀10次，室温静置5min，4℃，12000/min，离心20min③转上层水相于新EP管中，加等体积异丙醇，颠倒混匀10次，室温静置10min，4℃，12000r/min，离心15min④用真空泵或移液器小心吸取上清液，加预冷的75%乙醇（乙=0.75）（用DEPC处理水配制），4℃，12000r/min，离心10min⑤弃上清液，EP管倒扣，空气干燥5-10min。

⑥溶于10-100μDEPC处理水中。

⑦定量时将溶于DEPC处理水的RNA进行适量稀释，如50倍或100倍稀释（98μ1去离子水加2μRNA或99山去离子水加1 uI RNA，总体积100u1），用紫外分光光度计的微量石英杯定量，开机后选择RNA 定量，先用100ul去离子水做空白读数去除背景，再检测样品。

读取OD260值及OD260/OD280比值。

提取RNA前的准备工作1、提取RNA操作全程及配制RNA提取试剂必须穿实验服，戴口罩和一次性手套，触摸皮肤（例如面部）、门把手及实验室其他未处理过RNase的普通物体表面后立即更换手套。

2、器具干烤：需要干烤的器具包括金属和玻璃制品，如研钵、钥匙、镊子、剪刀、试剂瓶（200mL、500mL、1L）、量筒（50mL、100mL）、烧杯，即所有在配制RNA提取试剂过程中需要用到的玻璃器皿均需要干烤处理。

所有干烤的器具均用锡箔纸包住，如研钵、钥匙、镊子、剪刀和匀浆器，容器用锡箔纸封口，如试剂瓶、量筒和烧杯。

180℃干烤6h后放入RNA专用柜中备用。

3、DEPC水的处理：用于处理枪头、试剂瓶盖和离心管等塑料制品的0.1%的DEPC水可以在烧杯中配制，磁力搅拌器上搅拌过夜，搅拌过程中用锡箔纸封口。

用于配制RNA提取试剂的DEPC水需要在干烤过的试剂瓶中配制，盖上瓶盖搅拌过夜后121℃灭菌20min。

4、枪头、离心管和试剂瓶盖用0.1%DEPC水过夜处理后用报纸包好高温灭菌，移液器必须是专用的，用之前用DEPC处理的水配制的75%酒精擦拭整个移液器，特别是枪杆。

超净台的处理：用DEPC处理的水配制的75%酒精擦拭干净后，用氯仿快速擦拭，再用75%酒精擦拭，将提取所需的物品放入超净台，并用75%酒精擦拭，另放置一个废物缸，表面喷酒精，上述完成后，超净工作台紫外灯照射15-20min。

试剂配制过程中所用的枪头也必须是DEPC水处理过并高温灭菌的。

5、提取过程中用新开封的氯仿和异丙醇，用DEPC水处理过的15mL离心管分装，每管分装10mL并于4℃保存，最后溶解RNA沉淀的DEPC处理过的水用处理过的1.5mL离心管分装并于-20℃保存。

6、用专用的电泳槽电泳RNA，用DEPC处理的水配制50×TAE缓冲液，每次电泳前用DEPC处理的水配制1×TAE缓冲液进行电泳，电泳前用去污剂将电泳槽、制胶板和梳子清洗干净，DEPC水配制的75%乙醇擦拭，最后用DEPC处理的水冲洗干净。

RNA 提取方法（TRIzol法）一、试剂准备1、TROzlo试剂、氯仿、75%乙醇（0.1% DEPC配制）。

2、塑料器皿需用0.1% DEPC 水浸泡。

3、0.1%DEPC水：100ml dd水中加入DEPC0.1ml，充分振荡，37℃孵育12h以上，121℃高压灭菌20min，于4℃保存。

二、操作步骤1、样品处理（1）组织：50-100mg组织中加入1ml TROzlo试剂。

（2）单层细胞：加入TROzlo 试剂1ml/cm2平板。

（3）悬浮细胞：处理前洗涤细胞，以防止RNA降解。

每5-10×105动物、植物或酵母细胞，或1×107细菌加入1 ml TROzlo试剂。

2、将上述样品于15-30℃静置5min，使核蛋白充分解离。

3、加入0.2ml（1 ml TROzlo试剂）氯仿，盖紧盖子，充分剧烈振荡15s并于15-30℃静置2-3min。

4、于2-8℃12000g离心15min。

离心后样品分层，上层水相中含RNA，下层有机相中含蛋白和DNA。

5、取上清，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，于15-30℃静置10min后，在管底会出现胶状沉淀，即为RNA。

6、于2-8℃12000g离心10min后弃去上清。

7、向沉淀中加入1ml 75%乙醇，轻轻混匀。

8、于2-8℃7500g离心5min后弃上清9、将RNA样品凉干（不要彻底干燥），加入适量DEPC水溶解（可于55-60℃促溶10min）。

三、注意问题1、在加入氯仿之前（第1步），样品能于-60- -70℃保存至少一个月。

2、RNA沉淀（第6步）在75%乙醇中于2-8℃能保存至少一周，于-5- -20℃能保存至少一年。

四、RNA定量RNA（mg/mL）=40×OD260×稀释倍数（n）/1000 RNA纯品OD260/OD280=2.0 五、RNA电泳（1）用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。

RNA抽提全过程(TRIZOL)一，准备工作1，实验器具与材料：（1）移液枪：1ml、200ul、10ul（2）吸头：1ml、200ul、20ul（3）吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个（4）EP管1.5ml、100ul（5）玻璃研磨器（6）容量瓶：1000ml（7）盐水瓶：100ml（8）15ml塑料管一个（配75％乙醇用）2，实验器具的处理与准备（1）塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。

或直接购买经DEPC处理的枪头和EP管,每盒大约30元,基本上试剂公司都可以购买。

（2）玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）先泡酸过夜，冲洗干净后，在1‰DEPC水中泡8小时左右，37℃烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次（或180度干烤）。

（3）金属制品：（镊子等）先洗干净，再送干烤3次。

（不需要泡DEPC水）3，试剂配制和准备：（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml 容量瓶中静置4小时后备用。

配75％乙醇的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压。

（2）75％乙醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇＝1:3），然后放于-20℃备用。

（3）异丙醇：放入棕色瓶（4）氯仿：放入棕色瓶（5）Trizol：100ml/瓶存放于4℃二，抽提时注意事项：全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。

三，抽提步骤1．匀浆化作用取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。

RNA提取准备工作及注意事项一、准备工作：1.设计实验方案：根据研究对象的不同，设计合适的实验方案，例如提取样品的数量、提取方法的选择等。

2.购买试剂和设备：准备好所需的试剂和设备，如RNA提取试剂盒、离心机、冷冻离心管等。

3.设置实验环境：确保提取RNA的工作环境干净、无菌，避免外部污染对实验结果的影响。

4.消毒操作台、仪器和试剂：使用漂白水或酒精将操作台、仪器和试剂进行消毒，以保证实验的无菌性。

5. 准备辅助试剂：根据实验方案的需要，准备好辅助试剂，如裂解缓冲液、RNase抑制剂、维生素C等。

二、注意事项：1. 避免RNA的降解：RNA容易受到核酸酶的降解，因此在处理样品时需注意使用RNase抑制剂，并避免RNA接触空气、水等容易污染的环境。

2.样品的采集和储存：样品的采集和储存条件对RNA的质量有很大影响，应注意快速采集样品并冷冻保存，避免样品的长时间存放和频繁冻融。

3. 避免污染：在整个提取过程中，应注意避免污染，使用专门的无菌、无DNase的耗材，并严格遵守实验室操作规范。

4.快速操作：RNA提取过程中，所有步骤都要迅速进行，尽量减少RNA长时间暴露在空气中，避免RNA的降解和污染。

5.质控检测：在提取过程中，可通过紫外吸收检测RNA的浓度和完整性，也可用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的降解情况。

三、RNA提取的流程：1.样品裂解：将样品经过细胞裂解液处理，使DNA和RNA被释放出来。

2.分离RNA：经过离心将细胞碎片、核糖体、DNA等物质和RNA分离开来。

3.去除DNA：通过DNA酶的作用将DNA分解掉，使提取的物质中只含有RNA。

4. RNA稳定化：加入RNase抑制剂，防止RNA被降解。

5.沉淀RNA：将RNA进行萃取，并用酒精沉淀将RNA从提取溶液中分离出来。

6. 清洗和溶解：通过洗涤剂和酒精去除杂质，并用RNase-free水将RNA溶解。

7.浓缩RNA：将溶解的RNA进行浓缩，以便后续实验使用。

RNA提取实验方案1.所需试剂和设备-细胞样品（细菌、真核细胞等）- RNA提取试剂盒（例如TRIzol）- RNase去除剂（例如RNase A）-乙醇或异丙醇-游离亚硫酸-蒸馏水-离心机-定量和质量测量设备（例如紫外-可见光分光光度计）-冰桶和冷冻离心管2.操作步骤A.细胞样品处理和收集1.根据实验需求选择适当的生长培养基和条件培养细胞。

2.在适当的培养条件下培养细胞样品直到其数量达到目标水平。

3.将细胞样品收集到冷冻离心管中，通过离心将细胞沉淀于离心管底部。

B.细胞裂解和RNA分离4. 在冷冻离心管中加入适量的RNA提取试剂盒（例如TRIzol），按照试剂盒说明书中的比例加入。

5.快速颠倒离心管，混合细胞样品和试剂，使样品充分裂解。

6.在室温下静置5-10分钟，促使RNA与试剂发生充分结合。

7. 加入适量的RNase去除剂，按照试剂盒说明书中的比例加入。

8.快速颠倒离心管，继续混合样品。

9. 在室温下静置10分钟，使RNase去除剂与RNA结合。

C.RNA沉淀10.加入等体积的冷异丙醇或乙醇，混合样品。

11.在室温下静置10分钟，使RNA沉淀。

13.小心倒掉上清液，避免损失沉淀的RNA。

15.重复洗涤步骤一次。

D.RNA溶解和保存16.用适量的蒸馏水溶解RNA沉淀，使其完全溶解。

17.使用紫外-可见光分光光度计定量和质量测量RNA的浓度和纯度。

18.根据实验需求将RNA保存在合适的条件下（例如冷冻保存）。

3.注意事项- 在整个过程中要注意RNA的RNase污染，使用经RNase去除的试剂和消毒实验器具以避免污染。

-在RNA提取过程中要注意细胞样品的处理和保存，避免样品质量下降。

-每个步骤中的试剂和设备要根据实验室的具体情况进行选择和调整。

-在浓度和纯度测量RNA时要严格按照设备和试剂的操作要求进行操作。

这份RNA提取实验方案提供了一个通用的操作步骤，以便科研人员从细胞样品中提取RNA。

根据实验需求，可以对方案进行修改和调整，以获得更好的提取效果。