细菌总RNA提取说明-生工

实验三Trizol法提取细菌总RNA一、实验原理Trizol主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使RNA释放出来的同时，保护RNA的完整性。

加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。

RNA存在于水样层中。

收集上面的的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。

无论是人、动物、植物还是细菌组织，Trizol法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≧1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。

Trizol试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。

所有的操作可以在一小时内完成。

Trizol抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。

二、主要试剂和器材Trizol 溶液氯仿异丙醇 75%乙醇 0.1% DEPC水超净工作台 2.0 mL离心管（无Rnase）移液枪紫外分光光度计石英比色皿泳槽和模具电泳仪凝胶成像系统大肠杆菌三、实验步骤（一）. 采用 Trizol 溶液提取细菌的总 RNA1. 挑取大肠杆菌菌单菌落，培养至稳定期，取菌液2.0 mL 于2.0 mL离心管离心得菌体；2、每管加入 1 mL Trizol 溶液，盖紧管盖，激烈振荡15 s，室温静置5 min 4℃，12000 g，离心 10 min；取上清转入(约 1 mL)新的 2.0 m L离心管中；3、每管加入 0.2 mL 的氯仿(0.2 体积 Trizol)，盖紧盖，剧烈振荡 15 s；室温静置 3 min；4℃, 12000 g, 离心 10 min；小心吸取上层水相，转入另一新的 2.0mL 离心管，测量其体积；（加氯仿时应充分震荡使其充分乳化。

）4、加入1倍体积的氯仿，盖紧盖，剧烈振荡 15 s；室温静置 3 min；4℃，12000 g，离心 10 min；小心吸取上层水相，转入另一已编号新的 2.0mL 离心管；5、加入 0.5 mL 的异丙醇(0.5 体积 Trizol)，轻轻颠倒混匀；室温，静置 10 min；4℃，12000 g，离心 10 min，RNA 沉于管底；小心吸去上清；6、加1 mL75%的乙醇(预冷)，并轻柔颠倒，洗涤沉淀；4℃，7500 g，离心 5 min；小心弃上清，微离，吸去剩余乙醇，室温干躁 10 min；7、各管用 30μL DEPC 处理过的双蒸去离子水溶解，55-60℃温育5 min，分装，-80℃贮存(可贮存5周)；（二）. RNA 浓度的测定取10 µL RNA 样品以双蒸水稀释至 2 mL，转入预先以无水乙醇隔夜浸泡后晾干的石英比色皿中，小心排除气泡，以等体积的双蒸水作为空白对照，在紫外分光光度计中分别测定 260 nm、280 nm的光吸收值，根据公式计算 RNA 的浓度。

5.1.1.5.1总RNA提取及其浓度、完整性测定用Real-time RT-PCR方法确定鸡各肠段NaPi-IIb mRNA表达量。

用购自天根生化科技（北京）有限公司（Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd.）的Trizol试剂提取十二指肠、空肠和回肠总RNA。

用核酸蛋白检测仪在260nm波长处测定总RNA浓度。

用琼脂糖凝胶电泳测定RNA完整性。

总RNA提取步骤为：（1）预处理将肠粘膜样品从超低温冰箱取出（戴医用手套），迅速打开离心管盖子（否则会在液氮中取出时突然受热膨胀而爆炸），将开盖离心管放入纱布袋，纱布袋置于液氮罐中。

（2）取样至超净工作台后，用液氮预冷研钵（研钵之前经酒精燃烧灭菌处理），并使研钵中留有液氮。

用镊子夹出纱布袋中离心管，迅速置于研钵中，用研杵砸破离心管壁，镊子夹取肠粘膜样品（约50-100mg），迅速放入组织研磨器中（研磨器置于冰上）。

（3）研磨先向玻璃研磨器中加入0.2mL Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mL离心管中；然后向玻璃研磨器内加入0.8mL Trizol溶液清洗，再全部倒入1.5mL离心管中。

颠倒混匀10下，冰上静置5min。

（4）分相向离心管中加0.2mL氯仿。

盖紧样品管盖，用力摇晃试管15s，使其充分混匀，冰上静置5min。

4℃条件下，12000g/min离心15min。

（5）沉淀将上层水相转入新1.5mL EP管中（约400-500uL），加入0.5mL 异丙醇，混匀后冰上放置15min，4℃12000g/min离心10min。

此时离心管底部出现白色胶状沉淀，即RNA。

（6）洗涤小心倒掉上清液，留取沉淀。

加1mL 75%预冷乙醇，用枪头把溶液沿离心管底部对胶状沉淀上下吹打几次。

4℃条件下，7500g/min离心5min。

（7）再溶解小心倒掉上清液，离心5s。

用枪头将离心管内残留乙醇吸出。

放置超净工作台，风机吹干约1-2min。

总RNA提取实验原理总RNA提取实验是一种用于从细胞或组织样品中提取总RNA（total RNA）的实验方法。

总RNA包含细胞内的所有RNA，包括mRNA（messenger RNA）、rRNA（ribosomal RNA）和tRNA（transfer RNA）等。

总RNA提取是进行分子生物学研究的重要步骤之一，它使得研究者可以获取样品中的全部RNA，并进一步应用于RNA测序、RT-PCR等实验。

1. 细胞或组织的破碎：首先将待提取的细胞或组织样品加入破碎缓冲液中，通常包含Tris-HCl缓冲液、EDTA、SDS等。

这些缓冲液中的成分有助于维持适宜的pH值和细胞膜的稳定性。

然后利用机械或化学方法，破坏细胞或组织的结构，以释放RNA。

例如，可通过高速离心破碎细胞，或使用离解酶（如蛋白酶K）降解维持细胞结构的蛋白质。

2.RNA的溶解：破碎后的样品中含有RNA、DNA、蛋白质和其他杂质。

为了分离RNA，需要加入盐溶液（如醋酸钠、乙酸铵等）来改变样品的离子强度，从而促进RNA的溶解。

同时，可以加入乙醇沉淀，将RNA从溶液中沉淀下来。

3.RNA的洗涤：通过多次洗涤，可以去除样品中的DNA、蛋白质和其他杂质。

洗涤时可使用乙醇、乙酸盐等具有去除杂质作用的溶液。

洗涤过程可以使用离心等方法将杂质沉淀下来，然后将上清液收集。

4.RNA的纯化：纯化步骤旨在去除残留的DNA、蛋白质和其他污染物，以获得纯净的RNA。

纯化的方法包括酚/氯仿提取法、硅胶柱提取法等。

其中，酚/氯仿法利用酚醇将DNA溶解于有机相中，而RNA则溶解于水相中。

硅胶柱提取法则依靠RNA与硅胶的亲和力差异，通过将样品通过硅胶柱，使得RNA与硅胶结合，而DNA和蛋白质则被去除。

总RNA提取实验需要注意以下几点：首先，实验室操作环境要经过彻底清洁消毒，以防止RNA的降解或污染；其次，实验中使用的试剂和仪器要保持优良的质量，以确保提取的RNA质量；另外，实验过程中要避免样品受到RNase的污染，RNase是一种常见的蛋白质酶，能够降解RNA，因此需要在RNase-free条件下进行实验。

UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒产品编号：SK1321/SK1322包装规格：20次/100次试剂盒组成组分 SK1321，20次 SK1322，100次纯化套件（吸附柱+收集管） 20套 100套Trizol Reagent 12 ml 60 mlRPE Solution 5 ml 25 mlDEPC-treated ddH2O 1 ml 5 ml操作手册1份1份保存方法及注意事项试剂盒于常温运输，试剂请按照要求分别保存。

有效期见包装。

Trizol是强腐蚀性物质，操作过程中应穿上实验服，戴好乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。

沾染皮肤或眼睛后，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。

产品介绍该试剂盒采用Trizol提取总RNA，得到的总RNA通常不含有siRNA、 snRNA、5.8S rRNA、5S rRNA和tRNAs等200 nt以下的RNA。

该试剂盒采用的Trizol具有超强的裂解能力和抽提灵敏度，结合试剂盒采用特殊的吸附膜，大大增强了RNA 的得率。

得到的RNA纯度好，完整性高。

该试剂盒适用于各种细胞或组织中的RNA的抽提，提取的总RNA没有DNA和蛋白污染，可用于Northern blot、Dot blot、poly A筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆。

本产品具有以下特点：1. 适用范围广。

2. 操作简单快速，整个过程20分钟左右完成。

3. 纯度高，污染少。

试剂准备1. 自备试剂：无水乙醇、氯仿等。

2. 按瓶身标签说明在RPE Solution中加入4倍体积的无水乙醇，混匀后在瓶身做好标记。

于室温密封保存。

每次使用后将瓶盖盖紧，以保持RPE Solution中的乙醇含量。

若RPE Solution由于运输或保管不当造成容量不准，请用量筒定容后再加入相应体积的无水乙醇。

3. 去酶处理：RNase是导致RNA降解最主要的物质，非常稳定。

Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒产品编号：SK8255/SK8256包装规格：50次/100次试剂盒组成组分 SK8255，50次 SK8256，100次纯化套件（吸附柱+收集管） 50套 100套Buffer Digestion 10 ml 20 mlBuffer BD 12 ml 24 mlPW Solution (concentrate) 18 ml 36 mlWash Solution (concentrate)7.5 ml 15 mlCE Buffer (pH 9.0) 15 ml 30 mlProteinase K 1.2 ml 2.4 mlEnzymatic lysis buffer 10 ml 20 ml操作手册1份1份保存方法及注意事项试剂盒于常温运输，室温（15~25°C）保存，有效期见包装，4°C保存时间更长。

该试剂盒中提供的Proteinase K溶液为特别优化的配方，方便使用，而且非常稳定，可以在室温保存半年以上而活性不受明显影响，如需进一步延长保存期限，请置4°C保存。

Buffer Digestion中含有刺激性的化合物，操作过程中应穿上实验服，戴好乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。

沾染皮肤或眼睛后，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。

产品介绍本试剂盒是生工生物工程（上海）有限公司最新研制成功的一种细菌基因组DNA抽提试剂盒。

本产品对经典的SDS裂解液进行了改良，并使用高浓度的蛋白变性剂，大大提高了裂解的效率，缩短了裂解的时间。

无需使用苯酚、氯仿等有毒试剂。

从1 ml过夜培养的细菌菌液可以获得10~20 µg DNA，OD260/OD280比值一般为1.7~1.9。

抽提出的DNA可用于酶切、PCR、文库构建、Southern blot等相关实验。

标准抽提步骤自备材料：水浴锅、小型高速离心机（最大离心力≥ 12,000 × g）、1.5 ml离心管、无水乙醇、异丙醇、RNase A溶液（20 mg/ml）等。

RNA提取实验步骤如下：
●匀浆处理：
●组织：将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆
仪进行匀浆处理。

●单层培养细胞：直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即
3.5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。

●细胞悬液：离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107
细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。

加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。

一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。

每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

2-8℃10000×g离心15分钟。

收集上清液。

使用酒精洗涤RNA，以去除离心管内残留的试剂和盐。

最后利用2-甲基硫氰酸盐（MECT）溶液进行脱水，使RNA干燥而不影响RNA的完整性。

此外，如果是从动物组织中提取RNA，还需要使用DNase I处理RNA，以去除残留的DNA。

如果是从细菌中提取RNA，需要先进行细菌的裂解和细胞壁的破碎。

同时需要注意，整个提取过程需要严格控制RNA酶的污染。

细菌总RNA提取方法的比较邹晓蕾，刘礼崔，罗立新（华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州 510006）摘要：采用改良前后的Trizol法，RNAiso plus法、Qiagen试剂盒法以及Triton X-100法，从大肠杆菌（Escherichiacoli），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）3株细菌中提取RNA。

用琼脂糖凝胶电泳和核酸浓度测定仪检测总RNA 的提取质量，并用R T-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）对RNA的质量进行验证。

结果表明：RNAiso plus法对3株菌的总RNA提取均有很好的效果。

Trizol法和Qiagen试剂盒法对于E. coli总RNA的提取效果不错，但对其他2株菌的提取效果均不明显，并且都伴有DNA污染。

上述几种方法提取出的RNA样品中均含有23S和16S rRNA。

ctis更适合用Triton X-100法提取总RNA。

改良后的Trizol法和RNAiso plus法与Triton X-100法的原理基本相同，都是采用加热的方法，更彻底地裂解细菌细胞，而且得到的RNA中不含有rRNA和tRNA，只保留了mRNA，能更好地用于后续的实验研究。

关键词：细菌；总RNA提取；反转录聚合酶链式反应文章篇号：1673-9078(2013)8-1948-1954Comparison of Different Methods for T otal Bacteria RNA extractionZOU Xiao-lei, LIU Li-cui, LUO Li-xin(College of Bioscience &Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006) Abstract: In this research, RNA was isolated from three bacterial strains, (Escherichia coli, Bacillus subtilis and Lactococcuslactis) by using modified and un-modified Trizol and RNAiso plus methods, Triton X-100 method and Qiagen method. The quality and integrity of the extracted RNA samples were determined with agarose gel electrophoresis, nucleic acid detector and R T-PCR detection. The results demonstrate that un-modified RNAiso plus method can effectively collect high-quality RNA from the three bacterial strains. Qiagen method and un-modified Trizol method showed good efficiency when isolating total RNA from E.coli but other strains. In addition, the RNA samples also contain DNA contamination. L. lactis was more suitable for using Triton X-100 method. With the same principle, modified Trizol method, modified RNAiso plus method and Triton X-100 method reported here can be employed for extraction of RNA that are free from 16S and 23S rRNA and provide simple, rapid and effective tools for the isolation of high-quality RNA appropriate for downstream molecular experiments Key words : bacteria; tatal RNA extraction; RT-PCRRNA是生物体重要的遗传物质，RNA的提取是分子生物学的基础实验，对于cDNA文库构建、荧光定量PCR、R T-PCR、Northern杂交等下游分子生物学实验来说，都需要质量好的，完整性高的RNA[1]。

RNA 的提取( TRIzol 法)TRIzol 试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA 。

TRIzol 试剂有多组分分离作用，与其他方法如硫氰酸胍 / 酚法、酚 /SDS 法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点就是可同时分离一个样品的 RNA/DNA/ 蛋白质。

TRIzol 使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有 RNase 抑制剂可保持RNA 的完整性。

在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA 在水相中。

取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA ，用乙醇沉淀中间层可回收DNA ，用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。

TRIzol 试剂可用于小量样品（ 50-100mg 组织）也适用于大量样品（≥1g 组织）。

可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一个小时内即可完成。

分离的总RNA 无蛋白质和 DNA 污染，可用于 Northern Blot ， dot blot ，ployA 筛选，体外翻译， RNase保护分析和分子克隆。

在用于RT-PCR 时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase 的DNaseⅠ处理RNA 样品，避免出现假阳性。

共纯化的DNA 可用作标准，比较不同样品RNA 的得率，也可用于 PCR 和酶切。

蛋白质可用于 Western Blotting。

规格： 100mL 黄色透明液体，储存条件：2-8℃避光保存 12 个月，注意：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。

如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗，乙醇会加重灼伤程度。

1、预防 RNase 污染注意事项（1）经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌、霉菌可能成为RNase的来源。

（2）使用灭过菌的 RNA 专用塑料制品避免交叉污染。

（3）RNA 在TRIzol 试剂中不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。

玻璃器皿可在 150℃烘烤 4 小时，塑料制品可在 0.5M NaOH 中浸泡 10min，然后用水彻底清洗，高温灭菌。

细菌总RNA的提取
一、 总RNA的提取(TRIzol)
1．细菌培养和收集：培养100ml菌至对数生长期，然后于4℃ 6000rpm离心收集细菌，弃去上清，尽量用tip头吸出剩余的培养液。

2．加入1ml TRIzol，tip吹打使充分混匀进行均质化。

3．均质化的样品在室温放置5分钟，然后加入0.2倍体积的氯仿，盖子盖紧后剧烈振摇15秒使混匀，在室温放置2~3分钟，4℃ 7,000rpm离心15分钟，离心后形成下层红色的酚氯仿相，中间相和上层无色水相。

4．将上层水相转移至一个新的离心管（水相的体积大约为均质化时所用TRIzol体积的60%），加入0.8倍体积的异丙醇，剧烈振摇使混匀，4℃7,000rpm离心15分钟，弃上清。

5．加入70%酒精，颠倒离心管数次以洗去沉淀所含盐分。

如沉淀较大可用Tip头先将沉淀打散。

然后4℃ 7,000rpm离心10分钟，弃上清。

6．重复以上步骤1次。

7．室温晾干，然后加入适量的无RNase的水溶解。

8．用分光光度计分析RNA浓度，在260nm 1OD约等于40μg/ml的RNA。

a)需要在260和280nm测定吸光度来确定样品的浓度和纯度
b)A260/A280应接近2.0为较纯的RNA(比值在1.9-2.1也可)
9．1%琼脂糖电泳或Agilent BioAnalyzer。

细菌总蛋白和膜蛋白提取方法一、从新鲜样品中提取总蛋白（简易法）1、自配裂解液（pH 8.5-9.0）：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA, 100 mM NaCl，0.5% Triton X-100，调pH值至8.5-9.0备用；用前加入100 μg/ml 溶菌酶，1μl/ml 的蛋白酶抑制剂PMSF。

该裂解液用量为10-50ml 裂解液/1g湿菌体。

2、将40ml 菌液在12000g，4℃下离心15分钟收集菌体，沉淀用PBS悬浮洗涤2遍，沉淀加入1ml裂解液悬浮菌体。

3、超声粉碎，采用300w，10s超声/10s间隔，超声20min，反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。

4、1000g离心去掉大碎片，上清可直接变性后PAGE电泳检测，或者用1% SDS溶液透析后冻存。

缺点：Western blotting结果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。

二、从Trizol裂解液中分离总蛋白1、Trizol溶解的样品研磨破碎后，加氯仿分层，2-8℃下10000g离心15min，上层水相用于RNA提取，体积约为总体积的60%。

2、用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。

每使用1ml Trizol加入0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3min，2-8℃不超过2000g离心5min。

3、将上清移至新的EP管中，用异丙醇沉淀蛋白质。

每使用1ml Trizol加入1.5ml异丙醇，室温放置10min，2-8℃下12000g离心10min，弃上清。

4、用含有0.3M 盐酸胍的95%乙醇洗涤。

每1ml Trizol加入2ml洗液，室温放置20min，2-8℃下7500g离心5min，弃上清，重复洗涤2次。

最后加入2ml无水乙醇，涡旋后室温放置20min，2-8℃下7500g离心5min，弃上清。

5、冷冻干燥5-10min，1%SDS溶液溶解，反复吹打，50℃温浴使其完全溶解，2-8℃下10000g 离心10min去除不溶物。

简便高质量的食用菌总RNA提取方法简便高质量的食用菌总ＲＮＡ提取方法STE法是针对食用菌多糖含量高而设计的一种提取食用菌总RNA 的有效方法。

本研究以灵芝、香菇和白腐真菌TR16菌株的菌丝体为材料，采用STE法提取其总RNA，同时以Trizol法作对照。

结果表明：采用STE法提取的三种菌丝的总RNA A260/A280比值在1.80～2.10范围内,A260/A230略大于 2.00；而Trizol 法提取的总RNA A260/A280比值小于1.80，A260/A230小于1.90，明显比STE 法效果差；总RNA电泳检测表明：STE法的3条带（28S rRNA、18S rRNA 和5S rRNA）清晰，无拖尾，无杂带，效果比Trizol法好；将STE法提取的总RNA 进行反转录后合成双链cDNA，进行预扩增，电泳显示呈弥散状；再进行选择性扩增，有相同或相异的条带。

进一步表明STE法提取的总RNA质量较高，可以满足后续分子生物学研究的要求。

食用菌；总RNA；STE法S646.01A食用菌总RNA的提取方法较多，有异硫氰酸胍法、盐酸胍法和Trizol法等。

周凯松等采用CHOMCZYNSKI等提出的异硫氰酸胍法提取了金针菇的总RNA，此法操作时间长，需过夜沉淀[1,2]。

胡文军[3]用盐酸胍法提取了灵芝的总RNA，此法也需过夜沉淀，存在耗时较长的问题。

郭丽琼等[4]使用Trizol 提取出了草菇菌丝体的总RNA，此法操作简单，但是试剂盒价格昂贵，有较强毒性。

本研究针对食用菌多糖含量高的特点，设计食用菌总RNA的提取方法。

该方法操作简便、经济，为食用菌和其他多糖含量高的材料总RNA提取提供了借鉴和参考。

1 材料与方法1.1菌种香菇（Lentinula edodes）、灵芝（Ganoderma lucidum）和白腐真菌TR16菌株（Polyporus spp.）由本实验室提供。

1.2培养基1.2.1PDSA培养基新鲜马铃薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 1 g，VB1 10 mg，琼脂20 g，蒸馏水定容到1 L。

5.1.1.5.1总RNA提取及其浓度、完整性测定用Real-time RT-PCR方法确定鸡各肠段NaPi-IIb mRNA表达量。

用购自天根生化科技（北京）有限公司（Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd.）的Trizol试剂提取十二指肠、空肠和回肠总RNA。

用核酸蛋白检测仪在260nm波长处测定总RNA浓度。

用琼脂糖凝胶电泳测定RNA完整性。

总RNA提取步骤为：（1）预处理将肠粘膜样品从超低温冰箱取出（戴医用手套），迅速打开离心管盖子（否则会在液氮中取出时突然受热膨胀而爆炸），将开盖离心管放入纱布袋，纱布袋置于液氮罐中。

（2）取样至超净工作台后，用液氮预冷研钵（研钵之前经酒精燃烧灭菌处理），并使研钵中留有液氮。

用镊子夹出纱布袋中离心管，迅速置于研钵中，用研杵砸破离心管壁，镊子夹取肠粘膜样品（约50-100mg），迅速放入组织研磨器中（研磨器置于冰上）。

（3）研磨先向玻璃研磨器中加入0.2mL Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mL离心管中；然后向玻璃研磨器内加入0.8mL Trizol溶液清洗，再全部倒入1.5mL离心管中。

颠倒混匀10下，冰上静置5min。

（4）分相向离心管中加0.2mL氯仿。

盖紧样品管盖，用力摇晃试管15s，使其充分混匀，冰上静置5min。

4℃条件下，12000g/min离心15min。

（5）沉淀将上层水相转入新1.5mL EP管中（约400-500uL），加入0.5mL 异丙醇，混匀后冰上放置15min，4℃12000g/min离心10min。

此时离心管底部出现白色胶状沉淀，即RNA。

（6）洗涤小心倒掉上清液，留取沉淀。

加1mL 75%预冷乙醇，用枪头把溶液沿离心管底部对胶状沉淀上下吹打几次。

4℃条件下，7500g/min离心5min。

（7）再溶解小心倒掉上清液，离心5s。

用枪头将离心管内残留乙醇吸出。

放置超净工作台，风机吹干约1-2min。

细菌mrna提取原理全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：细菌mRNA提取是一种用于获得细菌中mRNA的方法，它是研究基因表达和转录调控机制的重要工具。

mRNA提取可以帮助科研人员分析细菌中特定基因的表达水平，从而深入了解细菌的生物学特性和致病机制。

在这篇文章中，我们将介绍细菌mRNA提取的原理、步骤和应用。

一、细菌mRNA提取的原理在细菌细胞中，mRNA是由DNA转录而来的，它携带了细菌的遗传信息，并且在蛋白质合成中起着重要的作用。

为了提取细菌中的mRNA，首先需要将细菌细胞破裂，释放细胞内的RNA，并且通过一系列的实验步骤将mRNA从总RNA中分离出来。

通常，细菌mRNA提取包括以下几个重要步骤：1. 细菌细胞的收集和破裂：首先需要将细菌培养至对数生长期，然后收集细菌细胞。

细菌细胞可以通过离心等方式被收集，并且通过机械或化学的方法破裂，释放细胞内的RNA。

2. RNA的提取和纯化：破裂后的细菌细胞中包含了RNA、DNA和蛋白质等成分，需要进行RNA的提取和纯化。

通常采用酚-氯仿提取法或商业化的RNA提取试剂盒进行RNA的提取和纯化。

3. mRNA的富集和纯化：细菌细胞中mRNA的含量很少，需要对总RNA进行富集，以获取足够的mRNA用于后续的实验分析。

mRNA的富集可以通过多种方法实现，如poly(A) RNA富集、RiboMinus RNA富集等。

4. mRNA的质量检测：在mRNA提取过程中，需要对提取得到的mRNA进行质量检测。

通常采用琼脂糖凝胶电泳、分子生物学实时荧光定量PCR等方法检测mRNA的纯度、完整性和浓度。

5. mRNA的应用：获得纯化的mRNA后，可以进行一系列的实验分析，如RT-PCR、RNA测序等，以研究细菌的基因表达水平和转录调控机制。

细菌mRNA提取在生物医学研究和生物工程领域具有广泛的应用价值。

以下是一些常见的应用：1. 基因表达调控研究：通过细菌mRNA提取，可以研究细菌在不同生长条件下的基因表达水平的差异，进而揭示基因的转录调控机制。

细菌总RNA快速抽提试剂盒产品编号：SK8625/SK8626包装规格：50次/100次试剂盒组成组分 SK8625，50次 SK8626，100次Buffer Rlysis-B 50 ml 100 mlDEPC-treated ddH2O 30 ml 60 ml操作手册1份1份保存方法及注意事项试剂盒于常温运输，4°C保存。

有效期见包装。

产品介绍本试剂盒是生工生物工程（上海）有限公司最新研制成功的一种细菌总RNA快速抽提试剂盒。

因为细菌RNA半衰期很短，RNA很容易发生降解。

针对这一难题，本试剂盒采用溶菌酶与裂解液Buffer Rlysis-B共同作用，快速裂解样品，再通过氯仿抽提、无水乙醇沉淀等步骤，可获得浓度高、完整性好的RNA。

适合于从各种来源的细菌（革兰氏阳性或阴性菌等）培养液中快速提取RNA。

使用本试剂盒，从1 ml对数生长期的细菌菌液中提取5~15 µg总RNA，可直接用于RT-PCR、Northern Blot、斑点杂交等实验。

本产品具有以下特点：1. 操作简单，全过程可在40分钟内完成。

2. 完整性好，纯化的RNA几乎不会发生降解。

3. 纯度高，OD260/280一般为2.0。

试剂准备自备试剂：无水乙醇、75%乙醇、溶菌酶、氯仿等。

标准抽提步骤4. 取1 ml对数生长期的细菌，8,000 rpm 4°C离心1 min，彻底弃掉培养基，加100 µl溶菌酶，振荡混匀。

（G-菌使用的溶菌酶浓度为400 µg/ml，室温酶解3~5分钟；G+菌使用的溶菌酶浓度为3 mg/ml，室温酶解5~10分钟。

）✓收集菌体后可用500 µl DEPC-treated ddH2O漂洗一次，10,000 rpm离心1分钟，弃上清，进一步去除残留的培养基。

5. 立即加入900 µl Buffer Rlysis-B震荡混匀，室温放置3 min。

总RNA提取
1. 取5ml菌体（OD700=0.5-1）9000转离心1分钟。

2. 沉淀重悬于300uml缓冲液中（0.3M蔗糖，10mMNaAc，pH4.5，高压灭菌），
漩涡震荡。

若不立即处理样品，可存放于-80°。

3. 加100微升0.25MNa2EDTA，再加420微升裂解液（2%SDS，10mM NaAc，
pH4.5，高压灭菌），漩涡震荡。

4. 加800微升热酚（水饱和酚，吸下层）（65°），漩涡震荡。

65°温育5min，4°14000转离心5min。

5. 取上清液（用剪掉枪尖的枪头吸，不要吸到中间层）到800微升热酚（65°），
漩涡震荡。

65°温育5min，4°14000转离心5min。

6. 取上清到800微升酚/氯仿（1：1）中，漩涡震荡。

4°14000转离心5min。

7. 取上清到700微升氯仿中，混匀。

4°14000转离心5min。

8. 上清转移到新EP管（4°）中，加1/5体积10MLiCL和2倍体积预冷的乙醇
（或只加1倍体积的异丙醇）在-20°放2小时沉淀RNA。

用70%乙醇洗沉淀两次。

9. 4°14000转离心15分钟，干燥沉淀。

然后重悬于25微升DEPC处理过的水
中，-80°保存。

注：所有溶液配制所用的水都是经过0.1DEPC处理过的。

细菌rna制备实验报告引言细菌RNA制备是研究细菌基因表达调控的重要手段。

RNA提取和逆转录为cDNA常用于分析细菌中的基因表达水平，从而揭示细菌在生理、病理和环境应答等方面的特性。

本实验旨在演示细菌RNA提取和cDNA合成的实验步骤，并探索一种快速且可靠的方法来制备细菌RNA。

实验材料和方法实验材料- 细菌培养物- Trizol试剂- 高纯度乙醇- RNase-free水- DNase I酶- Reverse Transcription Kit实验步骤1. 从细菌培养物中取出适量的细菌，使用离心机将细菌沉淀下来。

2. 倒掉上清液，并使用PBS缓冲液洗涤沉淀的细菌两次，以去除培养基中的杂质。

3. 使用Trizol试剂将细菌细胞破裂，释放出RNA。

4. 在加入Trizol试剂后，充分混合并放置5分钟以确保细菌细胞完全溶解。

5. 加入高纯度乙醇，然后将混合物转移到RNA提取柱上进行离心，以将RNA 从其他污染物中分离。

6. 使用RNase-free水溶解RNA样品，并使用紫外光光度计检测RNA的浓度和纯度。

7. 使用DNase I酶降解RNA中的DNA污染物。

8. 加入逆转录试剂，使用反转录酶合成cDNA。

9. 对合成的cDNA进行质控，例如PCR或实时荧光定量PCR。

结果和讨论本实验采用传统的Trizol方法提取细菌RNA，并使用逆转录酶合成cDNA。

为确保RNA提取的质量，实验使用高纯度乙醇和RNase-free水进行实验操作，并使用DNase I酶降解DNA污染。

最终合成的cDNA可用于后续的基因表达分析。

细菌RNA提取是一个关键的步骤，因为来自培养基和细胞壁的污染物可能会影响结果的准确性。

通过使用PBS缓冲液洗涤沉淀的细菌，并在RNA提取过程中加入高纯度乙醇和RNA柱进行脱盐和纯化，可以有效去除这些污染物。

合成的cDNA可以进一步用于基因表达分析，例如PCR或实时荧光定量PCR。

通过选择适当的引物和探针，我们可以定量分析感兴趣基因在细菌中的表达水平，从而了解细菌的生理状态和功能。