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细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）细胞遗传学实验技术标准操作规程（SOP）外周⾎培养及染⾊体的识别 (2)⽩⾎病⾻髓及外周⾎染⾊体 (7)外周⾎细胞脆性位点检测技术 (9)⼈⽺⽔细胞培养收获操作程序 (11)绒⽑细胞培养和染⾊体分析 (13)⾼分辨染⾊体操作⽅法和识别 (15)GII式显带法 (21)N式显带法 (21)R(反式)显带法 (23)姐妹染⾊单体互换（SCE）技术 (23)荧光原位杂交操作程序 (25)附:细胞遗传学实验试剂配制标准操作规程（SOP） (27)天平称量操作规程 (27)药匙处理操作规程 (27)PBS配制规程 (28)胰酶配制规程 (28)培养基配制规程 (29)1N HCL配制规程 (29)1N N A OH配制规程 (29)外周⾎培养及染⾊体的识别1. 原理：外周⾎中的淋巴细胞⼏乎都是处在G0期或G1期，⼀般情况下是不分裂的。
当在培养基中加⼊植物⾎凝素（Phytohaemagglutinin PHA）时，这种⼩淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进⾏有丝分裂。
经过短期培养后，⽤秋⽔仙素处理就可获得⼤量中期分裂相的细胞，制⽚后可以清楚地对染⾊体进⾏观察与分析。
2. 外周⾎培养与收获操作步骤：2.1 采⾎：⽤20:1肝素（0.4%）温润⽆菌注射器抽取外周⾎5ml（注意：消毒时需脱碘）。
2.2. 种⾎：将注射器搓捏，使⾎样混匀，在⽆菌条件下，⽤7号针头垂直种⾎0.3ml±抗凝⾎（成年男⼦28滴，成年⼥⼦30滴左右，⼉童32滴）⾄外周⾎培养基内。
2.3. 培养：将培养瓶放⼊37℃恒温箱中培养68-72⼩时，注意第⼆观察培养液有⽆凝⾎、溶⾎或长菌的现象，可每天培养液摇⼀摇，以便细胞可获得充分的营养，但⼀般情况下可不摇。
2.4. 制⽚过程：2.4.1. 加秋⽔仙素：在培养完成前2-3⼩时，加⼊浓度为20ug/ml的秋⽔仙素2-3滴（7号针头竖滴）后，继续培养2-3⼩时。
血液及骨髓微生物学检验标准操作规程1 检验目的培养分离出临床患者的血液及骨髓中致病微生物并鉴定。
为临床诊断提供病原学依据。
2 检验原理根据微生物的生长的特点，在体外给微生物提供适宜的温度、湿度、营养等条件。
通过培养得到微生物，再通过仪器的生化试验或血清免疫等方法鉴定出致病菌。
3样品采集及运送3.1样品类型：血液及骨髓3.2标本采集3.2.1采集指征可以感染患者出现以下一种或几种特征时，可以考虑采集血培养：发热≥38℃，低温≤36℃。
寒战，白细胞增多（计数>10.0×109/L，特别是有核左移时）或减少（计数<3.0×109/L）皮肤黏膜出血，昏迷，多器官衰竭，血压降低，C反应蛋白、降钙素、1，3-β-D葡聚糖升高及突发急性呼吸、体温和生命体征改变。
3.2.2采血时间在患者接受抗生素治疗之前，患者寒战或者发热初期采血。
超过发热峰值后，病原菌会逐渐被机体免疫系统清除，从而降低检出率。
如果同其他项目一起，先采血培养。
特殊情况见“9常规情况处理”3.2.3采血部位采集外周静脉血，不建议采用动脉血或者通过血管内导管采血。
只有怀疑导管相关性血流感染时，可分别通过导管和外周静脉血采取相同量的血标本。
多次血培养阴性，仍发热不退或全身感染症状明显但不能明确感染来源时，可考虑采集骨髓标本。
3.2.4消毒首先采用75%酒精消毒穿刺部位皮肤，待干30秒以上，用安尔碘由内向外画圆消毒，直径3cm以上。
待干后，可进行静脉穿刺采血。
对碘过敏者可用75%酒精消毒60秒，待酒精挥发干燥后采血。
血培养瓶口用75%乙醇消毒干燥60秒。
3.2.5采血量、采血瓶、采集套数注：对感染性心内膜炎和真菌败血症应多次采集。
3.2.6用无菌注射器穿刺取血后勿换针头，直接注入血培养瓶并颠倒混匀防凝固，不可使用抗凝血。
3.2.7收集了血液标本的血培养瓶应立即送实验室，室温放置不要超过2小时。
不可放冰箱储存。
4 试剂及仪器4.1革兰染液、氧化酶试剂、触酶试剂、血琼脂平板、巧克力平板、麦康凯平板等。
1960年Nowell 和Hungerford发现了慢性粒细胞白血病特异性染色体异常，即Ph染色体，从此推动了细胞遗传学在肿瘤细胞学上的广泛应用，促进了血液肿瘤分子生物学的发展。
血细胞染色体检验主要包括染色体非显带技术、染色体显带技术、染色体高分辨技术、姐妹染色单体互换技术、染色体脆性部位显示技术、早熟凝集染色体技术、染色体原位杂交技术(FISH)。
【临床意义】细胞染色体检验是恶性血液病研究不可缺少的方法。
染色体异常，特别是染色体易位，常涉及癌基因易位，新产生的融合基因及其产物在肿瘤的发生、发展中起着重要的生物学作用。
特异染色体异常同肿瘤细胞的形态学、肿瘤的预后及疗效判断等有密切的联系，临床上已用于疾病的诊断、分型、治疗方案的选择，在预后判断和微小残留病灶的检测等方面，发挥着重要作用。
１、在白血病诊断和分型中的应用常规显带技术可在50%～80%急性髓细胞白血病(AML)中发现克隆性染色体异常。
如t(8;21)(q22;q22) 异常绝大多数见于AML-M2型。
t(15;17)(q22;q12) 目前仅见于AML-M3型，可作为M3诊断的标准。
2、在白血病预后判断、指导治疗中的作用 AML中具有t(15;17)，inv(16)，t(8;21)异常的患者对治疗反应良好，缓解期较长，而具有-5、-7、+8及t(9;22)的AML患者则预后较差。
3、鉴别白血病微小残留病灶在微小残留病灶的检测中，FISH技术的灵敏性要远远超过常规技术，通过设计多种探针直接对中期和间期染色体进行检测，可发现各种染色体数目异常或结构异常，达到在103个细胞中检出一个异常细胞的水平。
当临床及形态学还没有复发的证据时，检测到原已消失的克隆性染色体异常和/或新的克隆性染色体异常时，往往预4、在骨髓增生异常综合征(MDS)中的应用染色体异常见于40%～80%的MDS，常表现为染色体的丢失、部分缺失，亦可见染色体增加和结构异常如-7、-17、-Y、5q-、7q-以及+8、+11和t(3;3)(q21;q26)、t(5;17)(q32;q12)等。
2021版CSCO恶性血液病诊疗指南更新要点（全文）一、原发性系统性淀粉样变性01治疗前评估实验室检查：增加：垂体功能；肾上腺功能（2类）骨髓检查：增加：DWI-MRI（3类）影像学检查：增加：心肌活检+刚果红染色；肾穿刺活检+刚果红染色（2类）；穿刺活检组织质谱分析（3类）02器官缓解和进展标准增加器官功能进展标准：心脏、肾脏、肝脏、外周神经。
03新诊断的治疗对于适合移植的患者：增加：达雷妥尤单抗+硼替佐米+环磷酰胺+地塞米松（1A类）；删除：硼替佐米+马法兰+地塞米松，来那度胺+环磷酰胺+地塞米松，来那度胺+地塞米松，马法兰+地塞米松。
对于不适合移植的患者：增加：达雷妥尤单抗+硼替佐米+地塞米松（1A类）；伊沙佐米+来那度胺+地塞米松（3类）；删除：来那度胺+环磷酰胶+地塞米松，来那度胺+地塞米松。
04移植和巩固治疗增加“心脏移植（3类），肾脏移植（3类）”；删除“异基因移植”。
05复发治疗增加“达雷妥尤单抗+硼替佐米+地塞米松（1A类）、卡非佐米+地塞米松（2类）、伊沙佐米+来那度胺+地塞米松（2A类）、Bcl-2抑制剂维奈克拉（2A类）、泊马度胺+地塞米松（2类）”。
二、华氏巨球蛋白血症（WM）01治疗前评估血常规检查：添加“手工”；免疫学检测⑤：添加“HIV”；基因及遗传学检查：添加“6q-/MYB”。
02分期和预后添加“修订的国际WM预后积分系统（rIPSSWM）”，详见下图。
03治疗一线治疗选择：添加“伴有症状性高黏滞血症、冷球蛋白血症的患者，建议先行血浆置换2-3次，后续以化疗，并避免直接应用利妥昔单抗（R）化疗。
”首选方案：修改为“①BR；②伊布替尼±R或泽布替尼单药；③RCD；④VRd”；其他方案：增加“伊沙佐米+利妥昔单抗+地塞米松”。
三、骨髓增生异常综合征（MDS）01治疗前评估实验室检查Ⅰ级推荐增加“网织红细胞计数”“促甲状腺激素（TSH）乳酸脱氢酶（LDH）如临床有提示则进行人类免疫缺陷病毒（HIV）检测”由Ⅲ级推荐调整为Ⅱ级推荐增加“影像学检查”：“T2*磁共振显像（MR1），心、肝脏铁过载评估”骨髓形态学检查规范各染色中英文名称，更正CD41为CD42b细胞遗传学检查增加Ⅲ级推荐“染色体微阵列（CMA）”分子学检查：“对造血干细胞移植候选患者考虑人类白细胞表面抗原（HLA）配型”由Ⅲ级推荐调整为Ⅰ级推荐02治疗有症状血小板减少或粒细胞减少：Ⅰ级专家推荐增加“临床试验”；Ⅱ级专家推荐增加“艾曲泊帕、罗米司亭”；Ⅲ级专家推荐增加“临床试验；选择合适患者进行allo-HST"。
恶性血液病的细胞遗传学中国医学科学院中国协和医学大学血液学研究所血液病医院刘世和一、背景染色体开展历史染色体检查在恶性血液病中的应用价值国内外开展动态染色体分析开展历史1960-1971：非显带时期1971-1980：显带、高分辨1980-至今：与分子生物学相结合时期，分子细胞遗传学〔FISH〕意义诊断与分型疗效判断验证移植成功与否或确定白血病的复发及其来源。
预后分析与指导治疗查找新的致病基因，讨论发病机制国内外开展动态国外：广泛开展，白血病与淋巴瘤必查工程国内：相对薄弱原因技术劳动强度大价格患者经济开展染色体检查要素技术合理的价格规模化：降低本钱，进步效率，缩短报告时间二、人类细胞遗传学命名根据1995版人类细胞遗传学国际命名体制，正常核型男：46，XY；女：46，XX。
异常核型包括体质性和获得性：体质性异常；获得性异常表1 核型命名常用的缩写符号染色体倒位〔inv〕指同一染色体上的两个断点之间的片段发生180º旋转，如发生于单一臂内称为臂内倒位，发生于两臂称臂间倒位。
染色体重复〔dup)在一个染色体的某一位点上重复一段染色体片段。
插入〔ins〕* 包括2个染色体之间的插入和一个染色体内的插入。
2个染色体之间的插入为插入易位，承受插入片段的染色体总是列于前面，而提供易位片段的染色体列于次。
* 一个染色体内的染色体插入可分为正向插入与反向插入。
等臂染色体〔iso)指一条染色体含有完全一样的臂。
易位〔t〕：至少2个染色体之间发生的遗传物质的互换。
平衡易位和不平衡易位两条染色体之间的易位描绘方式为按染色体由小到大的排列顺序易位：3个染色体以上罗伯逊易位〔rob)发生于D组或/和G组端着丝粒染色体易位，为两个长臂对接。
Rob(14;21)缺失〔del〕在某一个染色体上丧失部分遗传物质；分为中间缺失和末端缺失，如5q-增加〔add)表示在某一染色体上获得来源不明的遗传物质，通常代表在染色体的末端增加。
一、遗传学的专科实验室检测分析？二、细胞遗传学（ 3 ）其他。
染色体分析可发现非常多的染色体异常结构。
异常结构的染色体个体常是不能生存，染色体异常是自发流产的重要的原因，因此需要用正确的态度对待妊娠当中发生的流产事件。
如果在孕早期、孕中期对胎儿进行检测会发现孕早期染色体的异常率非常高。
因此在生育过程中流产如果不是突然的外力作用，而是胎儿或者其他因素的作用，应考虑到染色体异常。
图 1 染色体异常患儿图 2 为染色体异常患儿图 1 和图 2 为染色体异常患儿的特殊面容，即世界脸。
染色体异常患者罹患白血病的风险也会大大提高。
异常染色体核型中染色体是 47 条，27号染色体是三条而不是两条，此病也称为 21 三体综合征，但是唐氏综合征 21 号染色体不一定是三条，有时可以看到正常的 21 号染色体是两条，还有一部分发生易位，此为不平衡易位导致的 21 号染色体长臂在别处和别的染色体结合，称为易位型的 21 三体。
宿主父图 4 染色体不分离图 4 所示第二次减数分裂虽然发生了姐妹染色体单体分裂，但是因为前面的同样染色体。
没有分裂，结果造成配子多出一条 21 号染色体。
第一次减数分裂形成的配子如果再进行分裂，如果是精子它可能少 1 条，不是 23 条，而是 22 条。
它跟正常的配子结合，就会形成少 1 条 21 号染色体的个体，此类个体生存能力很差，胚胎时即可能流产。
另一部分是第一次减数分裂是正常的，第二次减数分裂时姐妹染色单体没有分开，结果造成 1 个配子多出 1 条 21 号染色体。
其他染色体异常、数目异常的机理也大概相同。
减数分裂过程中同样染色体之间或者是一部分要发生互换，因此它可以是 1 个精母细胞或者是卵母细胞，精母细胞会产生 4 个不同的染色体。
原来是 1 个父源、 2 个母源的，还有父源和母源混合起来形成的 1 个，所以形成了很多不同的染色体，加上常染色体各自不同的父源、母源的互相之间重新组合，形成不同的配子。
融合基因阴性, 2例次融合基因阳性而性染色体F I SH 阴性。
性染色体F I SH 检测只能间接推断BCR /ABL量的多少, 故仅用性染色体F I SH 进行MRD 检测有其局限性。
融合基因阳性提示患者体内存在BCR /ABL阳性细胞, 但不能确定其是否具有增殖能力。
本组患者在移植后2～6个月融合基因阳性率最高, 7例复发病例中6例发生在移植后的3～4个月。
Radich [5]认为BCR /ABL融合基因≥2次阳性者其复发的风险为78%, 1次阳性者为22%, 多次检测阴性者为3%。
所以移植后只有动态监测BCR /ABL融合基因才能预示疾病的变化。
综上所说, CC 异常表明疾病复发, 但其敏感性低。
性染色体F I SH 只能研究异性间移植, 且间接推测MRD 。
融合基因能准确反映体内MRD, 但阳性并不代表具有增殖力, 只有动态监测价值更大。
参考文献1李建勇, 过宇, 薛永权, 等1双色荧光原位杂交技术在异性间造血干细胞移植中的应用. 中华血液学杂志, 2000, 21:4292430. 2李建勇, 潘金兰, 吴亚芳, 等. 间期荧光原位杂交技术检测急性粒2单核细胞白血病inv (16 . 中华血液学杂志, 2002, 23:30232.3O lavarria E, O tt m ann OG, DeiningerM , et al . Res ponse t o i m atinib in patients who relap se after all ogeneic ste m cell trans p lantati on f or chr onic myel oid leukem ia . Leuke m ia, 2003, 17:170721712. 4De wald G W , Schad CR, Christensen ER,et al . The app licati on of fluorescent in situ hybridizati on t o detect MBCR /ABLfusi on in variant Ph chr omos omes in C ML and ALL. Cancer Genet Cyt ogenet, 1993, 71:7214.5Radich JP . Molecular measurement of m ini m al residual disease in Philadel phia 2positive acute ly mphoblastic leukae m ia . Best Pract Res Clin Hae mat ol, 2002,15:912103.(收稿日期:2005206221(:李敬东作者单位:430030武汉, 华中科技大学同济医学院附属同济医院血液科通信作者:黄梅, E mail:huang mei@medmail. com. cn多重巢式黄梅李春蕊周剑峰张义成邓金牛刘文励细胞遗传学检测有助于恶性血液病的诊断、评估预后、指导最佳治疗方案的选择。
J Diagn Concepts Pract 2009,Vol.8,No.4
恶性血液病进行细胞遗传学检测的重要性包括常规核型分析和荧光原位杂交（FISH ）分析在内的细胞遗传学检测在恶性血液病的诊治中发挥着越来越重要的作用。
①其有助于恶性血液病的诊断、鉴别诊断和分型。
2001年世界卫生组织（WHO ）发表了关于淋巴和造血系统肿瘤的新分型，将t(8;21)、t(15;17)、inv(16)和del/t(11q23)作为4种急性髓系白血病（AML ）亚型的诊断标志，以上4种亚型均伴有不同再现性遗传学异常[1]。
②其有助于判断恶性血液病患者的预后。
如按照核型可将
AML 患者分为低危、中危和高危3个不同的预后
等级[2]。
③其有助于医师选择合适的治疗方案，特别
是在发展针对不同遗传学亚型的个体化靶向治疗中，如费城（Ph ）染色体（+）的慢性髓系白血病（CML ）可采用酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼治疗，伴t （15;17）的急性早幼粒细胞白血病（APL ）可采用全反式维甲酸和三氧化二砷治疗。
可见，目前细胞遗传学检测已成为恶性血液病诊治中必不可少的重要手段。
采用标准的细胞遗传学检测方法的必要性以往，国际上关于细胞遗传学检测的方法缺少一致认可的准则。
而最近，欧洲细胞遗传学协作组提出了恶性血液病细胞遗传学检测标准方法的建议[3]。
笔者结合多年的实践经验，对其作了必要的修订和补充。
只有采用标准的细胞遗传学检测方法，
才能既保证检测结果的准确可靠和检查的经济、省
时，又可避免不必要的检查和不恰当的治疗。
根据恶性血液病的类型采用不同的
细胞遗传学检测方法及流程
由于恶性血液病的类型不同，其细胞对于培养条件的要求也不相同，且其各自具有不同的特征性遗传学异常，如进行FISH 检测时要求采用不同的探针，故应根据恶性血液病的类型采用不同的细胞遗传学检测标准方案。
慢性淋巴细胞白血病（CLL ）、CML 、慢性骨髓增生性疾病（CMPD ）[骨髓增殖性肿瘤（MPN ）]、AML 、急性淋巴细胞白血病（ALL ）、骨髓增生异常综合征（MDS ）、淋巴瘤和多发性骨髓瘤（MM ）的细胞遗传学标准检测方法及流程分别见图1～8。
细胞遗传学检测方法中涉及的10个关键问题在细胞遗传学检测中需注意的10个问题。
①细胞遗传学检测的标本除CLL 患者可采用外周血细
胞外，大多数恶性血液病要求采用骨髓细胞进行检测。
只有当患者的外周血白细胞计数＞10000/mm 3，且含有10%以上的幼稚或原始细胞时，方可考虑采用外周血作为检测标本。
淋巴瘤患者则应取受累淋巴结作为检测标本，当疾病晚期侵犯骨髓时则可采用骨髓细胞检测。
②标本采集量视细胞密度而定，细胞密度越低，则需采集的标本量越多。
一般要求·专家来信·
恶性血液病细胞遗传学检测的标准方法及流程
薛永权
（苏州大学附属第一医院血液科
江苏省血液研究所，江苏苏州215006）
关键词：恶性血液病；细胞遗传学；
诊断
中图分类号：R446.11＋3
文献标识码：A
文章编号：1671-2870（2009）04-0390-03
编者按：近期有关专家来信提示本刊，有关论文中涉及恶性血液病细胞遗传学检测方法及结果的描述存在一些错误或不规范之处。
为使相关临床医师和科研人员进一步了解和掌握血液病细胞遗传学的检测方法及流程，提高科研及写作能力，我刊特邀请苏州大学附属第一医院血液科、江苏省血液研究所薛永权教授撰写“恶性血液病细胞遗传学检测的标准方法及流程”一文，并予刊出，旨在规范恶性血液病的细胞遗传学检测方法及流程。
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诊断学理论与实践2009年第8卷第4期图3
CMPD 或MPN 细胞遗传学检测的标准方法及流程
图4MDS 细胞遗传学检测的标准方法及流程
至少采集5～10mL 骨髓或外周血，应用肝素抗凝后，于24h 内送实验室检测。
③培养基中应含20%的小牛血清，还需加入抗生素，若能加入胸腺嘧啶则培养效果更佳。
④应同时行2份或更多的培养，以便进行不同时间的培养（24、48或72h ）和加入不同的刺激因子，但除CLL 患者的标本外，其余均不应加入植物血凝素（PHA ），以免干扰分析结果，除非在需证实或排除体质性异常的情况时。
⑤培养基接种细胞数应控制在1×106/mL ～3×106/mL 。
⑥秋水仙酰胺处理样本的终浓度为0.05～0.1μg/mL ，时间控制在0.5～2h ，通常为1h ，必要时可延长至24h 。
⑦核型分析通常采用G 或R 显带技术。
良好的带型对确保核型分析的准确、可靠至关重要。
⑧每例
分析的细胞数视有无核型异常而定，核型异常时需分析10～20个细胞，无核型异常时则至少需分析
20个细胞才能确定为正常核型。
⑨根据核型分析结果，加行必要的FISH 或反转录聚合酶链反应（RT -PCR ）。
如AML 需按不同的形态学亚型、ALL 需按不同的免疫学亚型选择相应的FISH 探针进行检测。
近来发现，2%的B 系急性淋巴细胞白血病（B -ALL ）
患儿有21号染色体内的AML1基因扩增，提示预后不良，可采用ETV6-AML1或AML1FISH 探针检测该基因。
20%的T 系急性淋巴细胞白血病（T -ALL ）患者有隐匿性t(5;14)(q35;q32)，可导致TLX3异常表达，9%～30%的T -ALL 患儿有因1p32隐匿性缺失导致的SIL -TAL1融合基因，6%的T -ALL 患者有
9q34染色体外基因扩增导致的NUP214-ABL1融
合基因。
此外，CDKN2A 的隐匿性缺失也较常见（21%的B -ALL 和50%的T -ALL 患者可见）[4，5]。
上述异常均可选用相应的FISH 探针进行检测。
当存在≥3种独立畸变的复杂核型异常时，可用多色
FISH （M -FISH ）或光谱核型分析（SKY ）进行检测。
⑩按照《ISCN(2005)》的规定报告核型分析结果。
图1CML 细胞遗传学检测的标准方法及流程图2
CLL 细胞遗传学检测的标准方法及流程
391··
J Diagn Concepts Pract 2009,Vol.8,No.4
图7淋巴瘤细胞遗传学检测的标准方法及流程
图8MM 细胞遗传学检测的标准方法及流程
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（收稿日期：2009-04-11）
（本文编辑：褚敬申）
图5AML 细胞遗传学检测的标准方法及流程图6ALL 细胞遗传学检测的标准方法及流程
392··。
