PCR技术与DNA复制的比较

第2节基因工程的基本操作程序课标内容要求核心素养对接阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。

1。

科学思维：结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。

2．科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。

一、目的基因的筛选与获取1．目的基因(1）概念:用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。

(2）实例:培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因.2．筛选合适的目的基因(1)较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。

（2)实例:在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物—-Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。

（3)认识基因结构和功能的技术方法：DNA测序技术、遗传序列数据库、序列比对工具。

3．利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术.(2）条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。

（3)过程：①变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA受热变性后解为单链.②复性：温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。

③延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子链.④重复循环多次。

（4）结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n)。

二、基因表达载体的构建1．构建基因表达载体的目的(1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。

(2）使目的基因能够表达和发挥作用。

2．基因表达载体的组成[填图］3．基因表达载体的构建首先用一定的限制酶切割载体,使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段,再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。

第二节DNA片段的扩增——PCR技术一、DNA在细胞内的复制1．所需的酶：解旋酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶等。

2．引物：一段RNA。

3．原料：四种脱氧核苷酸。

4．原则：碱基互补配对原则。

二、PCR技术的过程1．把PCR缓冲液、DNA模板、一对引物、四种脱氧核苷酸、DNA聚合酶、Mg2＋等成分加入到微量离心管中。

2．把离心管置于95℃的高温中，使DNA碱基对之间的氢键断裂，DNA双链拆开成为两条单链。

3．将离心管置于55℃的环境中，使一对引物分别结合到两条分开的模板链上。

4．再将离心管转置于72℃的环境中，在DNA聚合酶的催化下，游离的脱氧核苷酸从引物的一端进行顺次连接，从而形成两条新的子链。

这样高温变性、低温复性和中温延伸三个步骤便构成了PCR过程的一个循环。

三、实验操作1．准备(1)为了避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的离心管、吸头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。

(2)如果没有PCR仪，可以设置3个恒温水浴锅，温度分别为95℃、55℃和72℃，然后按要求在3个水浴锅中来回转移PCR的微量离心管即可。

2．扩增3．检测利用DNA在260nm的紫外线波段的吸收值曲线来测定相应含量。

即：DNA的浓度(μg/mL)＝错误!×稀释倍数。

预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中问题1问题2问题3问题4一、DNA复制(体内)与PCR技术(体外)体内复制PCR反应不同点解旋在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开加热至95 ℃左右，双链全部解开，不需解旋酶引物一小段RNA 单链DNA分子片段合成子链在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72 ℃特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增TaqDNA聚合酶不需要需要循环次数受生物体自身控制30多次温度体内温和条件高温(可变)相同点①需提供DNA复制的模板②四种脱氧核苷酸为原料③都需要一定的缓冲溶液④子链延伸的方向都是从5′端到3′端①解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键。

第一节基因工程及其技术第1课时基因工程的基本工具与聚合酶链式反应(PCR)技术课标内容要求核心素养对接1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。

2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。

生命观念：掌握基因工程的基本工具的种类及作用,并能说出它们在基因工程中的应用。

科学思维：掌握PCR技术的过程与原理,并能正确比较PCR技术与体内DNA复制的异同。

社会责任：通过了解基因工程的发展历程,认同新技术的发展是一代又一代科学家前赴后继努力的结果,并会给人类发展带来巨大的经济效益和社会效益。

一、基因工程是在多学科基础上发展而来的1957年：科恩伯格等首次发现DNA聚合酶。

↓1967年：罗思和海林斯基等发现运转工具质粒,同年,科学家发现DNA连接酶。

↓1970年：特明和巴尔的摩各自在RNA病毒中发现逆转录酶。

史密斯等人分离到限制性内切核酸酶。

↓1972年科学家伯格领导的研究小组完成了世界上首次DNA分子体外重组。

↓1973年科学家科恩领导的研究小组利用大肠杆菌质粒进行了另一个体外重组DNA分子实验。

↓接着,科恩和美国博耶证明真核生物的基因可以在原核生物中进行表达。

↓1976年,科学家用质粒为载体,将生长激素释放抑制因子基因转入大肠杆菌,1977年首次生产出治疗肢端肥大症、巨人症的生长激素释放抑制因子。

↓1977年桑格测定了一种噬菌体的基因组序列,这是人类首次对完整基因组的核苷酸顺序进行测定。

二、基因工程的基本工具1．基因工程(1)概念：又称为DNA重组技术,是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法,将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA,然后导入受体细胞,并使其在受体细胞中表达,产生人类需要的基因产物的技术。

(2)原理：基因重组。

(3)操作水平：基因(分子)水平。

2．“分子剪刀”——限制性内切核酸酶(限制酶)(1)作用：识别DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列,并使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

探究点三 PCR 扩增技术1．简述PCR 原理。

2．补充完整PCR 的反应过程(1)________：当温度上升到90℃以上时，双链DNA 解聚为单链，如下图：(2)________：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合，如下图：(3)________：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A ，T ，C ，G)在________________的作用下，根据________________原则合成新的DNA 链，如下图：思维拓展1．DNA 复制需要引物的原因：DNA 聚合酶不能从头开始合成DNA ，而只能从3′端延伸DNA 链。

2．PCR 结果：(1)PCR 一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸三步。

(2)两引物之间的固定长度的DNA 序列呈指数扩增。

3．细胞内DNA 复制与PCR 技术的比较细胞内DNA 复制 PCR不 同点 解旋 在解旋酶的作用下边解旋边复制 80℃～100℃高温解旋，双链完全分开 酶 DNA 解旋酶、DNA 聚合酶 Taq DNA 聚合酶引物 RNA DNA 或RNA温度 体内温和条件 高温相同 点 ①需提供DNA 复制的模板；②四种脱氧核苷酸作原料；③子链延伸的方向都是从5′端到3′端探究示例3 近十年来，PCR 技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA 半保留复制，在试管中进行DNA 的人工复制(如图)，在很短的时间内，将DNA 扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。

(1)加热使DNA 双链打开，这一步是打开________键，称为________，细胞中是在________的作用下使此键断裂的。

(2)当温度降低时，引物与模板______端结合，在DNA 聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最终合成2个DNA 分子，此过程中原料是________，遵循的原则是______________。

脱氧核苷酸连接到模板链上，并使脱氧核苷酸之间过磷酸二酯键连接；3、沿着模板链不断延伸，最终形成两个一模一样的DNA分子。

补配对原则，游离的核糖核苷酸与脱氧核苷酸配对，3、核糖核苷酸间通过磷酸二酯键连接成RNA（mRNA，tRNA，rRNA）体．另一端的反密码子与mRNA上的密码子配对，两氨基酸间形成肽键。

核糖体继续沿mRNA移动，每次移动一个密码子，至终止密码结束，肽链形成解开的两条链分别与引物结合；3、延伸：在Taq酶的作用下，按碱基互补配对原则，脱氧核苷酸之间过磷酸二酯键连接成新链。

重复上述三步，就能获得大量的目的基因。

模板去向复制后，模板链与新形成的子链形成双螺旋结构转录后，模板链与非模板链重新形成双螺旋结构分解成核糖核苷酸扩增后，模板链与新合成的子链形成具有双螺旋结构的目的基因特点1、边解旋边复制；2、半保留复制边解旋边转录一条mRNA可与多个核糖体结合翻译成多条相同的多肽链1、半保留复制；2、快速大量复制产物形成两个完整的DNA分子三种单链RNA 蛋白质(多肽链)短时间内形成大量的目的基因DNA复制、转录、翻译、；逆转录以及PCR技术比较二、在基因过程的各种检测和鉴定：1、标记基因：为了检测目的基因（目的基因表达载体）是否导入受体细胞； 2、用DNA分子杂交法：检测目的基因是否插到染色体DNA上（工具：基因探针）3、用DNA分子杂交法：检测目的基因是否转录出mRNA（工具：基因探针）；4、用抗原—抗体杂交法：检测mRNA是否翻译出蛋白质；5、鉴定：个体水平鉴定：比如抗虫实验。

一、命题规律与趋势纵向分析近五年高考生物试题看，基因表达是考查的重点之一，多出现在选择题中。

从命题角度来看，高考重点考查基因表达涉及转录与翻译两个生理过程和这两个生理过程的比较以及与中心法则、其他生理过程的比较。

预计2013年高考，重点以考查转录和翻译两生理过程为主，会和DNA复制、遗传定律等知识多角度的交叉综合考查。

PCR上岗证考试题及答案(全)PCR上岗证考试题及答案（全）一、选择题（共20题，每题2分）1在核酸提取时,常需使用氯化钠、醋酸钠等盐溶液,其目的是:(A)A中和核酸的负离子,使其易于沉淀B调节PH值C保证核酸的完整性D无特定目的2临床上使用核酸扩增方法诊断沙眼衣原体感染,在标本收集上最为关键的是(B)A标本的采取方式B标本的保存方式C标本的运送方式D标本采取的时间3→之所以要将基因扩增检验实验室的产物分析区设置为负压状态,目的是:(B)A防止生物传染危险物的逸出B防止扩增产物从该区进入上游区域C防止该区灰尘的逸出D无特殊目的4核酸探针的标志性特征是:(DA一小段已知序列的单链核酸B一小段未知序列的单链核有同位素或非同位素标记物5核酸提取纯化中, XXX最首要的潜在污染源是:(D)A实验室环境B实验用品如吸头、离心管等C实验人员的手D以上A 和B6PCR方法检测病原微生物所扩增的区段,一般为:(B)A整个病原体基因组B病原体基因组内的保守区域C病原体基因组内的任一区域D以上都不是7无创产前基因诊断为胎儿做出基因检测,需从孕妇外周血中分离获得及大批的:(B)A孕妇有核红细胞B胎儿有核红细胞C白细胞D以上均可8.临床PCR测定的重复性不好的原因如下,但除外:(BA试剂盒核酸提取方法对扩增按捺物去除不干净B尺度品浓度不准C核酸扩增仪空间温度不均D加样重复性差9有关于动力学定量PCR方法中对扩增效率的测定,下述哪一条是错误的:(BA必须在扩增的指数期内测定B可在扩增的任何阶段进行C与扩增产物的测定有关D尽大概多选几个测定点10.临床基因扩增检修的室内质量控制与通常的临床定性免疫测定IQC的最大不同在于:(D)A弱阳性质控血清的设置B强阳性质控血清的设置C阳性质控血清的设置D以上均是11、PCR技术扩增DNA,需求的条件是( A )①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖体A、①②③④B、②③④⑤C、①③④⑤D、①②③⑥12、镁离子在DNA或RNA体外扩增反应的浓度一般为（D）A、0.3-1mmol/LB、0.5-1mmol/LC、0.3-2mmol/LD、0.5-2mmol/L13、多重PCR需要的引物对为（D）A、一对引物B、半对引物C、两对引物D、多对引物14、PCR是在引物、模板和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应，其特异性决定因素为（B）A、模板B、引物C、dNTPD、镁离子15、在PCR反应中，下列哪项可以引起非靶序列的扩增的扩增( C )A、TaqDNA聚合酶加量过多B、引物加量过多C、A、B都可D、缓冲液中镁离子含量过高16、PCR技术的发明人是（A）A、MullisB、XXX.XXX、XXX.才木17、PCR产物短期存放可在（A）保存。

高考总复习DNA复制及复制的证据【考纲要求】１．理解“证明DNA为半保留复制的实验”的实验设计思路及结论２．掌握DNA复制的过程及特点３．掌握关于DNA复制的一些计算４．掌握PCR技术的过程及特点【考点梳理】要点一、探究DNA复制方式的实验对DNA的复制方式人们一直有两种假设：全保留复制和半保留复制，后来经实验证明DNA为半保留复制。

１.1958年，Meselson和Stahl的密度梯度离心实验（１）实验材料：大肠杆菌（结构简单，只含１个DNA分子）（２）实验过程及结果（如下图）：①将大肠杆菌培养在含15NH4CL（有放射性）的培养液中培养多代，提取总DNA，并进行离心，发现DNA全出现在位置较靠下的重密度带。

可推测得大肠杆菌DNA的两条链均被较重的１５N标记（１５N/１５N），如下图：②将以上大肠杆菌培养移入含1４NH4CL（无放射性）的培养液中培养一代得F1，提取总DNA，并进行离心，发现DNA全出现在位置在中间的中密度带。

可推测得大肠杆菌DNA的一条链被较重的１５N标记，一条链含较轻的１４N（１４N/１５N），如下图：◎注意：此步实验及其结果是证实DNA分子的半保留复制的最关键步骤③将以上大肠杆菌培养在含1４NH4CL（无放射性）的培养液中再培养一代得F2，提取总DNA，并进行离心，发现DNA既出现在位置在中间的中密度带，又出现在位置靠上的轻密度带。

可推测得有的大肠杆菌DNA１５N标记，一条链含较轻的１４N（１４N/１５N），有的大肠杆菌DNA的两条链均含较轻的１４N（１４N/１４N），如下图：2. DNA半保留复制的另一实验证据——染色体色差法将细胞培养在含有BrdU的培养基中，当细胞增殖DNA复制时，BrdU可替代胸腺嘧啶脱氧核苷酸掺入到DNA的子链中。

在染色体中，若DNA只有一条单链掺有BrdU，则着色深；若两条链都掺有BrdU，会使DNA双链螺旋程度降低，从而着色变浅。

将处于不同细胞周期的中期细胞进行常规制片，经特殊染色后，在显微镜下观察每条染色体的着色情况验证DNA的复制方式，实验过程及观察结果如下图：由上述实验结果分析可知，DNA的复制方式为半保留复制。

理论考试卷一，填空（每题2分，共20分）1.DNA双螺旋中两条链走向是反向平行的，即一股链是5’→3’走向，另一股链为3’→5’走向；生物合成方向是5’→3’。

2.在极端的PH值或受热条件下，核酸分子中的氢键断裂，双螺旋结构解开，即为核酸变性。

3.核酸分子的杂交其实就是DNA 变性、复性原理的应用。

4.PCR扩增的三个基本阶段是变性、退火、延伸，引物与模板的结合发生在退火阶段5.反转录酶催化的DNA合成反应按5’→3’方向进行，在DNA合成时也需要引物，引物为病毒颗粒中的mRNA 。

6.PCR测定中的“假阳性”的最主要的来源是PCR产物的污染。

7.请填出以下各种微量移液器可取溶液的体积范围P10 P20 2-20ul P100 20-100ul P200 50-200ul如需吸取100ul液体，则最好使用P100 加样器。

8.在基因扩增检验中，使用的带滤塞吸头吸加液体，只要是为了防止标本间交叉污染。

9.TapMan荧光PCR测定原理中的关键点在于利用了Tap酶的5’→3’的外切酶活性，Ct值指的是每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。

10.个体化医学的全面定义：分为疾病风险预测（基因检测）和个体化治疗（基因检测）两个方面，基因预测疾病风险是指根据每个人的疾病基因组信息预测疾病的发生风险。

个体化治疗是指根据每个人的疾病基因组信息对已发生的疾病进行治疗。

二，是非题（正确的后面打√，错误的后面打×，并将错误处划线并改正，每题两分，未改正得1分，共20分）1.DNA双链中，碱基对总是A-T ,C-G配伍，其间以两个氢键相连。

（×）G-C间以三个氢键相连2.使用有防“污染”作用的UNG的PCR试剂盒，PCR实验室就不必严格分区。

（×）UNG酶只对低浓度的产物污染有效3.在全血、骨髓标本的采集时，可使用EDTA、枸缘酸钠或肝素抗凝。

（×）不能使用肝素抗凝4.血清HBeAg的存在是HBV感染及感染程度的确证标志。