当前位置：文档之家 › 酪蛋白酶解产生阿片活性物质的条件确立

酪蛋白酶解产生阿片活性物质的条件确立

  • 格式：pdf
  • 大小：263.80 KB
  • 文档页数：4

下载文档原格式

  / 4

合集下载

酪蛋白水解酶酶切位点

酪蛋白水解酶酶切位点

酪蛋白水解酶酶切位点
摘要：
1.酪蛋白水解酶的概述
2.酪蛋白水解酶的酶切位点
3.酪蛋白水解酶的应用
正文：
酪蛋白水解酶是一种分解酪蛋白的酶，它主要作用于酪蛋白，将其分解为更小的分子，如肽和氨基酸。

酪蛋白是一种主要的乳蛋白，广泛存在于牛奶、乳制品和奶酪中。

酪蛋白水解酶在食品工业中被广泛应用，如在奶酪生产中，酪蛋白水解酶可以帮助奶酪形成更好的质地和口感。

酪蛋白水解酶的酶切位点是指酶在与酪蛋白结合后，催化酪蛋白分解的位置。

酪蛋白水解酶的酶切位点通常位于酪蛋白的特定氨基酸序列上，这些氨基酸序列可以被酪蛋白水解酶识别并结合。

酪蛋白水解酶在酶切位点上的结合和催化作用，使得酪蛋白被分解为更小的分子。

酪蛋白水解酶在食品工业、生物医药和科研等领域都有广泛的应用。

在食品工业中，酪蛋白水解酶可以用于生产奶酪、酸奶和其他乳制品。

在生物医药领域，酪蛋白水解酶可以用于生产药物载体和生物医用材料。

在科研领域，酪蛋白水解酶可以用于研究蛋白质结构和功能。

酪蛋白水解酶的酶切位点是其发挥作用的关键，对于酪蛋白水解酶的研究和应用具有重要的意义。

牛乳中β-酪蛋白基因分型及β-酪啡肽-7的研究进展

牛乳中β-酪蛋白基因分型及β-酪啡肽-7的研究进展

Recentadvancesofβ-caseingenotypinginbovinemilkandpotentialimpact ofβ-casomorphin-7onhumanhealth
， ， ， ， ， CHENLong1,3 FUWangyan2 FANGQiongyan1,3 TANGGuo1,3 LIULun1,3 XIANGSongtao1,3
： KeywordsA2Milk;β-casein;Geneticvariation;β-casomorphin-7(BCM-7);Humanhealth
0引 言
牛乳营养丰富，食用便利，富含优质的蛋白质、碳 水化合物、脂肪、维生素和微量元素，牛乳中的蛋白质 含有人体所需的全部必需氨基酸，消化率可达 ～ 98% 100%，因此被认为是自然界最接近完美的食品。乳蛋 白是牛乳中最主要和最有营养价值的成分，其含量约 占牛乳的 3.0%～3.6%，主要以酪蛋白和乳清蛋白为 主蛋，白还、有β-少酪量蛋的白酶、κ类-。酪酪蛋蛋白白、γ是-酪由蛋αs1 白-酪等蛋多白种、蛋αs 白2-酪质 组成的混合物，总含量约占乳蛋白的 80%。β-酪蛋白
： AbstractBovinemilkisrichinnutritionandmilkproteinisthemostnutritiousingredientinmilk.β-caseinaccountsforabout30%ofto
talmilkprotein,A1andA2arethetwomostcommontypesofβ-casein,ofwhichtypeA1ismutant.β-caseingenepolymorphism iscon trolledbycodominantautosomalgene,whichcouldbedetectedbyproteinlevelormolecularlevel.TypeA1β-caseinonenzymaticdiges tionproducesvariousspecificaminoacidresiduefragmentsinbody,ofwhichβ-casomorphin-7(BCM-7)isaheptapeptidewithopioidac tivityandspeculatedtobecloselyrelatedtotheoccurrenceofchronicnon-communicablediseases,suchastype1diabetesmellitus,cardio vasculardiseases,autism,schizophreniaanddigestivedisorders.Thisarticlereviewsthegeneticvariationandtypingmethodsofβ-casein,gen erationmechanism ofBCM-7anditspotentialimpactonhumanhealth,whichwillprovidesomedirectionsandrecommendationsforfu tureresearchofβ-caseinandA2milkindairyindustry.

功能性食品生产主要技术方法

功能性食品生产主要技术方法

功能性食品生产的主要技术方法功能食品的发展为消费者提供一条选择健康食品的最佳途径。

功能食品当中发挥功能作用的物质称为生物活性物质, 具有延缓衰老、提高机体免疫力、抗肿瘤、抗辐射等功能, 大多生物活性物质具有热敏性, 在生物活性物质的提取分离中保留其生物活性和稳定性至关重要。

功能食品的生产技术主要包括，生物工程技术（包括发酵工程，酶工程，基因工程，细胞工程等），分离纯化技术，超微粉碎技术，冷冻干燥技术，微胶囊技术，冷杀菌技术。

目前对于功能食品的研究集中于：1.活性多糖及其加工技术，活性多糖包括膳食纤维，真菌活性多糖，植物活性多糖。

2.活性多肽及其加工技术，酪蛋白磷酸肽（酶解-沉淀法，酶解-离子交换法），谷胱甘肽（萃取法，发酵法），降血压肽功能性油脂及其加工技术3.多不饱和脂肪酸，磷脂活性微量元素及其加工技术。

4.自由基清除剂及其加工技术（超氧化物歧化酶，沉淀法制备，离子交换层析法）5.活性菌类及其加工技术6.功能性甜味料及其加工技术。

1.一般分离技术1.1初步分离纯化从固液分离出来后的提取液需初步分离纯化, 进一步除去杂质。

常用的初步分离纯化技术主要有萃取分离、沉淀分离、吸附澄清、分子蒸馏技术、膜过滤法、树脂分离方法等。

1.1.1 萃取分离萃取分离萃取分离法既是一个重要的提取方法, 又是一个从混合物中初步分离纯化的一个重要的常用分离方法。

这是因为溶剂萃取具有传质速度快、操作时间短、便于连续操作、容易实现自动化控制、分离纯化效率高等优点。

萃取分离法: 一是水一有机溶剂萃取, 即用一种有机溶剂将目标产物自水溶液中提取出来, 达到浓缩和纯化的目的; 二是两水相萃取, 这是近期出现的、引人注目的、极有前途的新型分离纯化技术。

当两种性质不同、互不相溶的水溶性高聚物混合, 并达到一定的浓度时, 就会产生两相, 两种高聚物分别溶于互不相溶的两相中。

常用的两水相萃取体系为聚乙二醇( P E G ) 一葡聚糖( eD x t ar n ) 系统1.1.2 沉淀分离纯化沉淀分离纯化利用加人试剂或改变条件使功能活性成分( 或杂质) 生成不溶性颗粒而沉降的沉淀法是最常用和最简单的分离纯化方法, 由于其浓缩作用常大于纯化作用, 因此通常作为初步分离的一种方法。

酶解活性蛋白

酶解活性蛋白

β-CN
Ser43-Phe-Gln-Pro-Gln-Pro-Leu-Ile-Tyr-Pro52
Val63-Arg-Pro65 CEI为ACE抑制物
k -CN
ACE抑制肽的抑制机理
（杨咏祥，1999）
降血压肽的降压原理
降血压肽可以与ACE活性区域发生亲和力较 强的竞争性结合，而且结合后不易释放，阻 碍了ACE的作用，从而起到防治高血压的目 的。 在发酵乳制作过程中，乳酸菌的胞外蛋白酶 可将乳蛋白分解成肽并释放到发酵乳中。在 乳酸菌中，植物乳杆菌具有较强的蛋白质分 解活性。
②阿片样肽（Opioid peptide） 具有类吗啡肽活性可与肠道上皮细胞或其 它细胞的阿片样受体结合，能够镇静止痛、 诱导睡眠、延长胃肠蠕动和刺激胃肠激素 的释放，是神经活性肽的一种。
②阿片样肽（Opioid peptide）
活性最强的是五肽（β- 酪啡肽-5），即 Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly（位于牛乳酪蛋白 残基 60-64 ）和β- 酪蛋白类吗啡 -4 ，它 们的C-末端氨基酸被酰化后活性较强，称 为 morphiceptin（β- 酪啡肽 -4- 酰氨）， 即Tyr-Pro-Phe-Pro。
（2）营养性肽
当常规的蛋白质水解物因为特殊氨基酸的不 耐症而不能添加到食品中时，其它短肽却可 以作为替代物添加。一个典型的例子是缺乏 苯丙氨酸的肽可以用于患有苯酮尿症的病人 的膳食中。对于那些对牛乳中αs1-CN和β乳球蛋白过敏的婴儿来说，低抗原性肽比相 应的天然蛋白质更能降低婴儿的过敏反应。 这种肽也是目前市场上研制开发最多的一种 。
（3）生理活性肽
酪蛋白磷酸肽(CPP) 阿片样肽(Opioid peptides) 阿片样拮抗肽(Opioid antagonist peptides) 降血压肽（Antihypertension peptides） 免疫调节肽（Immunoregulatory peptides） 抗血栓肽（Antithrombotic activity peptides）

酪蛋白酶解产物的结构特征研究

酪蛋白酶解产物的结构特征研究

酪蛋白酶解产物的结构特征研究柳甜甜;王金水;高芸芳;李晓伟;周晓配;贾峰【摘要】用超声波对酪蛋白进行预处理之后,利用胰蛋白酶对其进行酶解,检测酶解后产物的表面特征、粒度分布及二级结构等指标,探讨酪蛋白酶解产物的结构特征变化特征.结果表明:用超声波辅助处理后,酪蛋白酶解液的酶解产物与未采用超声波辅助处理的结果相比,产物的粒度更小且分布均匀,酪蛋白表面的孔洞化和层片化更快,随着酶解时间的延长,酪蛋白酶解产物颗粒的粒度变小,分子量分布更加均匀;酪蛋白酶解产物中β-转角和无规则卷曲减少,而β-转角的含量增加.结果表明超声波辅助处理对酶解酪蛋白有很好的促进的作用.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2016(037)008【总页数】6页(P14-19)【关键词】酪蛋白;酶解产物;二级结构;超声波;傅里叶红外光谱(FTIR)【作者】柳甜甜;王金水;高芸芳;李晓伟;周晓配;贾峰【作者单位】河南工业大学生物工程学院,河南郑州 450001;河南工业大学生物工程学院,河南郑州 450001;河南工业大学生物工程学院,河南郑州 450001;河南工业大学粮油食品学院,河南郑州 450001;河南工业大学生物工程学院,河南郑州450001;河南工业大学生物工程学院,河南郑州 450001【正文语种】中文酪蛋白（casein，CN）是牛乳中的主要蛋白质，分子质量大约为20 kDa～25 kDa，呈酸性，由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白等四类组分组成[1]，是一类含磷的蛋白质[2]，能够协助参与核酸、三磷酸腺苷（ATP）等重要的代谢活动。

但是由于这4种单体通过α-螺旋、β-折叠和β-转角等蛋白质二级结构形成了紧密的酪蛋白空间结构，使其在人体内消化困难，且易过敏，这些因素限制了酪蛋白在食品领域的应用。

然而，近年来在酪蛋白水解物中发现很多具有重要生理功能的多肽，如：阿片肽[3]、降血压肽[4]、抗血栓肽、免疫促进肽[5]、促进矿物离子吸收肽等，而这些多肽大约在1 000 Da左右，容易被肠道吸收[3]。

酪蛋白酶解制活性肽的工艺条件

酪蛋白酶解制活性肽的工艺条件
Ｔ ｃ ｎ ｌｇ ｆ ｂ ｉ ｉｅｓｔ ｆ ｅ ｈ ｏｏ ｙ Ｗｕ ａ ３ ０ ８ Ｈｕ ｅ， ｈｎ ） ｅ ｈ ｏｏ ｙｏ ｅ ｖ ｒｉ ｏ ｃ ｎ ｌｇ ， ｈ ｎ４ ０ ６ ， ｂ ｉＣ ｉａ Ｈｕ Ｕｎ ｙ Ｔ
Ａｂ ｔ ａ ｔ ｈ ｓｅ ｐ ｒｍｅ ｔ ｈ ｉｅ ｐ ｎ ｒ ａ ｎ ｙ ｏ ｐ ｅ ａ ａｉｎ ｂｏ ｃｉｅ ｐ ｐ ｉ ｅ ．Ｕｓ ｄ ｏｙ ｉ ｇ ｅ ， ｓ ｒ ｃ ：Ｔ ｉ ｘ ｅ ｉ ｎ ｏｃ ａ ｃ ｅ ｓｅ ｚ ｍｅｔ ｒｐ ｒ ｔ ｉａ ｔｖ ｅ ｔｄ ｓ ｃ ｏ ｅ Ｈｙ ｒ ｌｓｓＤｅ ｒ ｅ Ｈｙ ｒｌｓｓ ａ ｅ ｔ Ｕ ｉｔ ｂ ｔ ｎ ｏ ｒ ｏｎ ｔ ｅ ｐ ｒｍｅ ｔ ｈ ｉ ｅ ｅ ｔ ａ ｔｒ ｂ ｕ ｓ ｂ ｔａｅ ｕ ｓｒ ｔ ｄ ｏｙ ｉ ｒ ｔ， ， ｄｓｒ ｕｉ ｆｕ ｐ ｉ ｔ ｏ ｘ ｅ ｉ ｏ ｉ ｎ ，ｃ ｏｃ ｂ ｓ ｆｃｏ ａ ｏ ｔ ｕ ｓｒｔ ，ｓ ｂ ｔａｅ ｃ ｎ ｅ ｔａｉｎ ｔｍ ｐ ｒ ｔｒ ， ｉ ｆｈ ｄ ｏｙ ｉ． ｉ ｄ ｂ ｓ ｅ ｉｎ ｔ ｍｐ ｒ ｔｒ ： ， ｕ ｓｒ ｔ ｏ ｃ ｎｒ ｔ ｎ ６ ％ ， ｏ ｓ ｎ ｒｔ ， ｅ ｅａｕ ｅ ｔｍｅｏ ｙ ｒｌｓｓ Ｆ ｎ ｅ ｔｄ ｓｇ ： ｅ ｅ ａｕ ｅ ４０ Ｓ ｂ ｔａ ｅｃ ｎ ｅ ｔａｉ ： ｏ ｏ ｅ ｚ ｍｅｃ ｎ ｅ ｔａ ｉｎ ２ ％ ， Ｈ： ， ｙ ｒｌ ｓｓｔｍｅ １ ０ ｍｉ ． ｎ ｙ ｏ ｓ ｎｒ ｔ ： ｏ ｐ ７ ｈ ｄ ｏｙ ｉ ｉ ：２ ｎ Ｋｅ ｒ ｓ： ａ ｅｎ；ｐＨ ；ｅ ｚ ｍ ｅ ｕ ｓｒ ｔ ｏ ｃ ｎ ｒ ｔ ｎ；ｔｍｐ ｒ ｔｒ ｙｗｏ ｄ ｃ ｓ ｉ ｎ ｙ ；ｓ ｂ ｔａｅｃ ｎ ｅ ｔａ ｉ ｏ ｅ ｅ ａｕ ｅ；ｔｍｅ ｉ

酪蛋白水解酶酶切位点

酪蛋白水解酶酶切位点1. 引言酪蛋白水解酶是一种在生物体内起着重要作用的酶，它能够将酪蛋白分解为更小的肽段或氨基酸。

酪蛋白水解酶的活性主要通过酶切位点来实现，这些位点是酪蛋白水解酶识别和切割酪蛋白的特定序列。

本文将详细介绍酪蛋白水解酶酶切位点的相关知识。

2. 酪蛋白水解酶的功能酪蛋白水解酶是一类具有水解酶活性的酶，它主要存在于胃液、肠液和乳液中。

酪蛋白水解酶能够将酪蛋白分解为更小的肽段或氨基酸，从而促进蛋白质的消化和吸收。

在人体内，酪蛋白水解酶的功能对于维持肠道健康和促进营养吸收非常重要。

3. 酪蛋白水解酶酶切位点的定义酪蛋白水解酶酶切位点是指酪蛋白水解酶识别和切割酪蛋白的特定序列。

酶切位点通常由一串氨基酸组成，其中包含一个特定的氨基酸序列，这个序列是酪蛋白水解酶识别的关键。

酪蛋白水解酶在识别酶切位点后，会通过水解作用将酪蛋白切割成较小的肽段或氨基酸。

4. 酪蛋白水解酶酶切位点的特点酪蛋白水解酶酶切位点具有以下几个特点：•特异性：酪蛋白水解酶对酶切位点的识别是高度特异的，只有特定的氨基酸序列才能被酪蛋白水解酶识别和切割。

•多样性：酪蛋白水解酶可以识别和切割多种不同的酶切位点，这些位点在不同的酪蛋白中具有差异。

•位点长度：酪蛋白水解酶酶切位点的长度通常在4-8个氨基酸之间，其中包含一个特定的氨基酸序列。

5. 酪蛋白水解酶酶切位点的识别酪蛋白水解酶通过特定的结构域识别和结合酶切位点。

这些结构域可以与酪蛋白的特定氨基酸序列发生相互作用，从而实现酶切作用。

酪蛋白水解酶的结构域通常包括活性位点和底物结合位点。

6. 酪蛋白水解酶酶切位点的应用酪蛋白水解酶酶切位点的应用非常广泛，主要包括以下几个方面：•食品工业：酪蛋白水解酶酶切位点可以用于制作乳清蛋白饮料、乳清蛋白粉等乳制品。

通过酶切作用，可以将乳清蛋白分解为更小的肽段，增加其溶解度和稳定性。

•医药领域：酪蛋白水解酶酶切位点可以用于制备生物活性肽。

通过酶切作用，可以将酪蛋白分解为具有生物活性的肽段，如抗菌肽、抗氧化肽等，用于药物研发和治疗。

酶解酪蛋白生产生物活性肽的研究现状及开发前景

$6!+%
&9&
抗高血压肽 DEB=;AF351=5B?;G5 353=;<5H 血管紧张素转化酶 &E)I ’ 是一种多功能 的 酶 !
$
&!’ 基 因 工 程 方 法 $ 采 用 基 因 工 程 技 术 7 让 某 些 功能明确的活性肽在工程细菌或工程动植物中得到 高效表达 7 从 而 达 到 商 业 化 生 产 的 目 的 $ 人 们 在 这 方 面的工作还是初步的! 在转基因鼠的乳汁中得到了 牛 乳 !! 酪 蛋 白 的 表 达 产 物 ! 并 且 进 行 了 纯 化 ! 牛 乳 的"! 乳白蛋白也在转基因鼠的乳汁中得到表达 $8%$ 通 过基因工程的方法生产分子量较大的肽和蛋白质已 被广泛应用! 而许多生物活性肽都是短肽! 所以也 限制了这种方法的使用 $ & "’ 化 学 合 成 方 法 $ 化 学 合 成 法 用 于 生 产 高 价 的药理级肽! 但是此法的成本相当高! 而且副产物 会对人体有害 ! 因此使用受到限制 $ 总之! 目前生物活性肽的研究开发主要采用微 生物蛋白酶的方法! 国内外在植物蛋白和动物蛋白 的开发研究中利用的微生物蛋白酶已建立的良好的 实验依据! 发现微生物蛋白酶大多具有溶解性好(
56.76,89:; )*+,- 水解酪蛋白得到的酪蛋白水解产物中
都分离到了 !#) 酪 蛋 白 & ./0(*12(312 ’ 和 ! ! 酪 蛋 白 &405(*12(*12 ’ 具有降血压作用的肽段 ! 但是此法存 在对菌种依赖性较大! 如果没有优良的发酵菌种! 那么降低生产成本而实现工业化生产必然存在许多 困难* 另外还存在菌种的安全评价和相关产物分析 等问题
$
& ’’ 微 生 物 发 酵 法 $ 此 法 生 产 多 肽 是 近 年 来 逐 步发展起来的很前景的技术! 直接利用微生物发酵 过 程 中 产 生 的 蛋 白 酶 &复 合 ’ 降 解 蛋 白 质 ! 可 达 到 较高的水解度! 从而相对地降低酶法生产活性肽的 成 本 ! 例 如 ! 在 接 种 了 23456.76,89:; 的 牛 乳 和 用 234

差量法和酶解酪蛋白法测定鸭饲料氨基酸真消化率及内源排泄量的比较研究


开始试验 ， 随机分为 １ ， ６组 再随机分配到 ４种试 粮 ， 保
能将食 糜 中未被 吸 收 的酶 解 酪 蛋 白产 物 （ 氨基 酸 和
小 肽 ） 判 为 内源而高 估 内源氨 基酸 的损失 。因此 ， 误
本 试验 拟用差 量法 和食 糜不 经超 滤 的酶解 酪蛋 白法
证饮水 ， 舍温保持在 １ ￣２ ℃ ， ６ ０ 相对湿度 ６ ％￣６ ％。 ０ ５
１ ３ 试 验 日粮 ．
基 酸 真 消 化 率 的 差 异 ， 同 时 与无 氮 Ｈ粮 法 作 比较 。差 量 法 以豆 粕 为 唯 一 蛋 白源 ， 制 成 １ ％ 和 ２ ％ ２种 粗 蛋 白 并 配 ５ Ｏ
质 水 平 的试 粮 ； 解 酪 蛋 白法 以 酶解 酪蛋 白作 为 蛋 白质 来 源 ， 制成 １ ．％ 粗 蛋 白质 水 平 的试 粮 ； 氮 Ｈ粮 用 淀 粉 酶 配 ７５ 无
和无氮 Ｈ粮法测 定的 内源氨基酸排泄 量计算 的 １ ％和 ２ ％ ２个粗蛋 白质水 平 Ｈ粮 氨基 酸真消化 率 （ 分别为 ５ Ｏ ％）
９ ．５ ．３和 ９ ．７ ．６ ８ ．５ ．９和 ８ ．２ ． １ 以 上 结 果 表 明 ， １ ％ ～ ２ ％ 的 日粮 蛋 白质 水 平 范 １ １ ±４ ３ １ ９ ±４ １ 、８ ５ ±４ ２ ８ ８ ±４ ６ 。 在 ５ Ｏ
在采食 正 常含氮 日粮 条件 下 内源氨基 酸排 泄 的方 法 学 问题 一直 是 营养 学研 究 的一 大难 题 ， 管 目前 已 尽 提 出了多种 方法 ， 但都有 其 不理想 之处 ， 以至还 没有
一
ｌ 材 料 与方 法
１ １ 试 验 设 计 ．
种方 法能够 给 出令人 信服 的准 确测值 。李 斌 等 ］ 以及王 国兴 等 将 Ａｍｍｅ ｍａ ｒ ｎ等 测 定 反 刍 动 物

K-酪蛋白的水解活性肽消除阿片肽副作用的研究

一 种 与 阿片 肽 同 时进 行 注射 ，这样 既 能 消 除手 术 中 的疼痛 ，又 能 消除或 减轻 阿 片肽使 用产 生 的副 作用 。 １材 料 与 方 法
体结合 。 （ ）吸去 Ｄ Ｅ一 ０ ３ Ｍ Ｍ １ 培养 液 ，用 ｌ ｌ 全Ｄ Ｅ —Ｆ … 次 。吸去 ｍ完 ＭＭＳ洗
制 剂 ，长 期 的 使用 势 必会 产 生 副作 用 。 如何 消 除或 减 轻 这些 副 作 良性状 。尽 管 纳洛 酮 具有 消 除 上述 不 良性 状 的 效用 ，但 作为 化 学 细 胞 ，在３ ℃５ Ｃ， ７ ％ ０培养 箱 中培养 过夜 ，直 至细 胞８％ 片 。 ０汇 （ ）在 聚苯 乙烯 管 中配 制Ｄ Ａ 脂质 体复 合物 如下 ：稀 释质 粒 ２ Ｎ／
２ １年 第 ０ 期 ０２ ｌ （ 第２ ３ ） 总 ６期
吉 林 农 业
Ｊ ＬＩ Ｉ Ｎ ＡＧＲＩ ＣＵＬＴＵＲＥ
ＮＯ ． １． ２ ２ ０ ０ｌ
（ ｕ ｌｔ ｅｙ Ｃ ｍｕａｉ ｔ ＮＯ．６ ） ｖ ２ ３
Ｋ 酪蛋 白的水解活性肽消除 阿片肽 副作用 的研 究 一
郧 亚 宁 ，顾 亚玲
为 了提 高 目的片段 与 载体 的连 接效 率 ，我 们 通 常在 目的 片段 上 连 接 一段 寡 居核 苷 酸 片段 （ 头 ） ，接 头 中含 有 与载 体 相 同 的 接
酶 切位 点 。然 后在 Ｔ Ｄ Ａ 接 酶 的作用 下 使 目的片 段 与载 体进 行连 ４Ｎ 连
— 曩 入 ■ 冀 ｔ ＇
ＤＥ －Ｆ Ｍ Ｍ Ｓ ，每 个 ３ ｍ ￣ 中 ， 直接 在 细 胞上 加 ｌ ｌＮ ／脂 质 体 复合 ５ｍＬ ｍ ＤＡ
物 。３ ￣Ｃ ， ７ ０培养 箱 中温育 ３５ 。 Ｃ —ｈ １ １ 一酪蛋 白的 制取 ． Ｋ （ ）往 每孔 细 胞 中加 ｌ ｌＭ Ｍ ２ 完 全 培养 液 。在３ ￣ Ｏ培 ４ ｍＤＥ一０ ７ ＣＣ ： 常用 等 电点法 ： 即将 牛乳 的Ｐ调 到４ ７ Ｈ ． 时酪蛋 白沉 到最 下面 ， 养箱 中温 育 １ — ４ ． ６ ２ ｈ 最 上 层是 脂 肪 ，可 以用 盐析 法 ，加 重 金 属 离子 、有 机 酸 、有 机 溶 （ ）吸去完 全Ｄ Ｅ Ｄ Ａ／ 质 体复合 物 ，每孔 加 入２ ｌ 的 ５ Ｍ Ｍ／ Ｎ 脂 ｍ新 剂 等 ，都 可 以 使 蛋 白质 沉 淀 下 来 。蛋 白质 沉 淀 后 ， 离心 １ 分 钟 Ｏ ＤＥ —０ ＭＭ １完全 培养 液 ，继续温 育 ２— ８ 。 ４４ ｈ （０ ０ ／ ｉ ）， 洗 两次 ，离心 １ 分钟 。加 入 乙醇 搅拌 ，悬 浊液 ３ ０ ｒｍ ｎ 水 ０ （ ）收集 细胞 ：用 细胞 刮子 刮下 细胞 ，或 胰 酶消化 或冻 融裂 ６ 移 至布 氏漏 斗抽滤 。乙醚一 乙醇混 合液 沉淀 两 次 。最后 用 乙醚 重复 解细 胞 。 前 一步 骤两 次 ，抽干 后 风干 ， 即得纯 的酪 蛋 白 。 然 后裂 解细 胞 ，分 离提纯 这 三种 活性肽 。 １２ 三种 活 性 肽 的制 备 ． 将Ｋ 酪 蛋 白在３ ℃下 加入 胰酶进 行 水解 ２ ３ 小 时 ，对水 解产 ３纳 洛 酮 的作 用 机 制 一 ７ —个 物 进 行 聚 丙烯 酰 胺凝 胶 电泳 ，三 中 活性 肽 由 于分 子 量 的不 同 而产
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

大鼠神经胶质细胞瘤) : 由中科院上海细胞所购入[125] I- cAM P 试剂盒: 由上海中医药大学购
入。
1. 2 方法
1. 2. 1 酪蛋白的酶解
称取 3. 0 克酪蛋白, 用 1m o l L N aO H 助溶, 待其充分溶解后用 1m o l L HC l 调整 pH = 1.
4, 定容到 200m l, 使终浓度为 15m g m l。 然后将其分装于 5 个编号的三角反应瓶中, 再分别加 入 猪胃蛋白酶干粉 (酶: 底物= 1: 30w w ) 混匀, 37℃水浴温育培养并立即记时, 分别消化 15m in、30m in、60m in、90m in 和 120m in (以下分别称消化液 I、消化液 、消化液 、消化液 和 ) , 用 10m l L N aO H 终止反应, 调 pH = 7. 5。分别将 5 瓶酪蛋白消化液集于离心管中, 16,
1640 培养液 10um 纳洛酮 消 化 液
10. 0 -
5. 0 -
5. 0 -
5. 0 -
5. 0 -
5. 0 -
-
10. 0 -
5. 0 -
5. 0 -
5. 0 -
5. 0 -
5. 0
-
-
5. 0 -
5. 0 -
5. 0 -
5. 0 -
5. 0 -
表 1 各处理样品与 N G108- 15 细胞共同培养 15m in, 加入 15% 三氯醋酸 2. 0m l 终止反 应。原瓶吹打细胞, 3000r m in 离心 10m in, 弃上清; 加入 50mm o l L 醋酸缓冲液 2. 0m l 悬浮沉 淀, 尽量全部地移入小瓶, - 30℃过夜, 反复冻融 5 次, 超声波破碎细胞 (300H z 总 3m in ) ; 17000g 离心 30m in, 取上清于小瓶中沉淀; 加入 2. 0m l 无水乙醇混匀, 同上离心。 合并上清液
000g, 4℃离心 15m in, 取上清消化液备用。 1. 2. 2 SD S—聚丙稀酰胺凝胶电泳
L aemm li[4] 法在还原条件下进行。 分离胶浓度为 15% , 浓缩胶浓度为 5% , 样品浓度为
1ug m l, 上样量 10u l 孔, 恒压条件下进行。电泳胶经考马斯亮兰染色, 对上述不同时间条件下 的酶解酪蛋白的水解程度进行初步分析。
张源淑: 酪蛋白酶解产生阿片活性物质的条件确立
31
对酪蛋白的酶解可能为进一步研究外源性阿片活性肽在胃肠道和体内的作用机制建立合适模 型提供依据。
参考文献
1 L oukas. S. et al O p iate activities and structu re of Α- cM derived exo rph in s. B iochem istry 1983. 22 (19) : 4567 2 南京农业大学. 家畜生物学. 北京: 农业出版社, (第二版) 3 Zioudrou, C. et al O p io id Pep tides derived from food p ro tein. J. B id. Chem 1979. 254: 2446～ 2449 4 L aemm li, V ·K. cleavage of stuuctu ral P ro tein s du ring assem b le of the head of bacteriophage 1970. 7. 277: 680 5 徐为燕. 兽医病毒学. 北京: 农业出版社, 1993 6 章翰等. 单个核细胞内 cAM P 提取方法的研究. 中国免疫学杂志. 1988, (41) : 342～ 43 7 吉材寿等. 医用生理学. 北京: 科学出版社, 1982
30
宁 夏 农 学 院 学 报
于小瓶中, 测定制备液中蛋白质浓度, 60℃烘干, 盖塞, 4℃保存, 待测。 1. 2. 3. 3 cAM P 的放免测定 取 50mm o l L pH 4. 75 醋酸缓冲液 0. 5m l 溶解上述烘干细胞 内 容物, 取 0. 1m l 用双抗体法测定细胞内 cAM P 含量 (pm o l) , 操作按药盒说明书。 计数用 FM J —9800 型放射免疫 Χ—计数器。 1. 2. 3. 4 结果处理: 以每毫克蛋白生成 cAM P pm o l m g 计。
3 讨论
3. 1 酪蛋白阿片肽是主要的乳源生物活性肽成分, 由酪蛋白经消化酶水解产生。 它在影响动 物采食、胃肠运动、机体代谢激素水平和免疫功能方面有显著效应。八十年代以来, 欧洲一些学 者相继从动物和植物性食物与饲料蛋白的酶解产物中发现了阿片活性物质, 研究工作十分活 跃。尽管许多机理方面的内容还未进一步证实, 但已证明酪蛋白多肽链中的生物活性物质是以 无活性的形式隐藏在其氨基酸序列中, 必须通过适当酶解, 在一定条件下才能释放出来。 本试 验正是基于这一理论依据, 采用N G108- 15 细胞作为研究阿片活性物质存在的模型, 证实酪 蛋白经酶解有阿片物质释放。
1 材料和方法
1. 1 材料 酪蛋白: 分析纯, 上海化学试剂采购供应站产品; 胃蛋白酶 (猪) : 中科院上海生化所产品,
Ξ 收稿日期: 1997- 11- 20
张源淑: 酪蛋白酶解产生阿片活性物质的条件确立
29
批号 9406113; 纳洛酮 (N a loxone) : Sigm a 公司产品; N G108- 15 细胞株 (小鼠神经母细胞瘤×
摘要 酪蛋白经充分溶解, 用猪胃蛋白酶准确消化 15m in, 30m in, 60m in, 90m in 和 120m in, 离心上清消化液, 通过 SD S- PA GE 电泳和细胞生物学方法, 结果发现, 只有在 pH 1. 4 和 37℃时, 酪蛋白经胃蛋白酶消化 2h 其酶解液中有阿片样物质存在。
2 结果
2. 1 酪蛋白的酶解 不同时间的酶解消化液电泳胶, 经考马斯亮兰和银染对照标准酪蛋白显示, 在底物、酶量、
温度、pH 一定时, 胃蛋白酶对酪蛋白的消化是: 15m in 起大分子酪蛋白带开始迅速消失, 随着 时间延长, 大的肽段逐渐减少, 至 2h 消化基本完成。 2. 2 不同时间酶解消化液对N G108- 15 细胞腺苷酸环化酶的影响 见表 2
胞均匀分装于各培养瓶中 (100m l) , 加 PR IM —1640 完全培养液 10m l, 37℃, 5% CO 2 条件下预
培养约 12h, 待细胞贴壁后, 弃去培养液, 按表 1 处理。
表 1 培养液的组成
单位: m l
处理
对照液
消化液
消化液
消化液
消化液
消化液
2%L —谷胺酰) , 半悬浮传代培养。 1. 2. 3. 2 细胞匀浆腺苷酸环化酶试验
制 备 过 程 参 照 Zioud rou[3] 和 章 翰[6] 等 人 所 用 方 法 并 加 以 改 进。 具 体 操 作: 将 细 胞 在
PR IM —1640 完全培养液, 37℃, 5% CO 2 条件下培养, 待贴壁后, 弃去上清液, 用细胞培养液清 洗一次, 吹打细胞, 调整细胞浓度, 使每毫升培养液中含N G108- 15 细胞个数基本一致, 将细
3. 2 试验选用来源方便的酪蛋白, 对其酶解条件进行摸索, 确定 pH 1. 4、37℃, 酪蛋白经胃蛋 白酶 2h 处理, SD S- PA GE 电泳分析显示胃蛋白酶对酪蛋白的水解基本完成, 酪蛋白已降解 成较小的片段, 在 15% 的 PA GE 凝胶上不能显示小肽的电泳带。通过细胞生物学试验也发现, 2h 消化的水解产物对N G108- 15 细胞腺苷酸环化酶的刺激作用可被纳洛酮反转, 其它时间 条下的则不能。这进一步证明, 2h 酶解的水解产物中具有显示阿片样活性的肽段。这个结果同 Zioud rou 用胃蛋白酶消化 Α- 酪蛋白的结果类似。 3. 3 本试验用胃蛋白酶处理酪蛋白产生阿片活性物质, 确定的条件与哺乳动物胃的环境条件 类似。且 2h 的消化时间, 与通常食物在胃中的消化时间相一致。有资料表明[7]从采食开始胃液 即开始分泌 (除马、猪不采食时也分泌少量胃液外) , 人可持续 3～ 4h, 家畜可持续 2. 5～ 3h, 一 般的胃液分泌在进食 1～ 2h 后达到高峰。我们此次实验结果也可能提供了这样一个证据, 即所 有的哺乳动物食入酪蛋白或乳及产品后, 在胃中可能产生阿片活性物质, 这种类似体内条件下
关键词 酪蛋白; 胃蛋白酶; 阿片样物质 中图分类号 Q 555·03
酪蛋白是乳的主要成分。 牛乳总蛋白平均含量 3. 3% 中的 78. 8% 是酪蛋白。 传统营养学 认为蛋白质在胃肠道中被分解成氨基酸后被机体利用。自七十年代末,B rran t l[1]等从酪蛋白酶 解产物中分离出具有阿片样活性的七肽之后, 经近几十年的研究发现, 蛋白质多肽链中蕴藏着 许多肽序列, 它们在消化酶的作用下被释放并表现出阿片样 (阿片肽)、免疫调节 (免疫肽)、金 属离子载体 (酪磷肽)、抗凝血和舒血管 (抗高血压肽) , 肿瘤抑制等多种生物学活性。 这些存在 消化腔内的BA P 可与特殊受体结合参与采食、消化、代谢和内分泌调节等。动物体消化蛋白质 的酶主要有胃蛋白酶、胰蛋白酶[2]等。研究发现[3], 用胃蛋白酶处理 Α- 酪蛋白可以得到具有阿 片活性的阿片肽; 用胰蛋白酶处理 k- 酪蛋白可生成具阿片抑制作用的拮抗肽。B erthou 等用 胰酶——胰凝乳蛋白酶处理人的 Β—酪蛋白得到的是具有免疫活性的免疫肽。 上述试验结果 说明, 酶对酪蛋白具有选择性, 这种选择性提示: 要得到某种活性肽, 须有合适的酶, 并对其作 用条件作出评价。酶及其作用条件的探讨, 成为生物活性肽研究的第一步。这一研究领域的发 展对传统营养学和生理学概念的研究提出了新课题, 并迅速成为新的研究热点。 目前, 对生物 活性肽的来源、产生及生化特性、生物学效应以及作用机理等方面的研究报导还不多见。 就笔 者所见一些研究结果提示, 蛋白质保护的生物学效应与其水解过程中产生的阿片肽活性物质 有密切关系。饲料中生物活性肽的研究将为提高畜牧业生产提供新技术。为此, 本研究以牛乳 酪蛋白为底物, 选用胃蛋白酶, 在不同时间条件下进行水解, 将水解产物通过 SD S—PA GE 电 泳和细胞生物学方法确定产生阿片活性物质的合适条件。