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[收稿日期] 2010-05-05;2010-07-14修回[基金项目] 贵州大学研究生创新基金项目/利用猪粪养殖蚯蚓与蚯蚓小肽加工利用技术开发研究0(2009003);贵州省农业攻关计划项目/无公害饲料添加剂的研制与产业化示范0[黔科合NZ(2007)3006][作者简介] 覃 麟(1983-),女,在读硕士,研究方向:动物营养与饲料科学。
E -mail:qinlin10@ *通讯作者:施晓丽(1971-),女,副教授,从事猪动物营养与饲料科学的研究。
E -mail:shx l@[文章编号]1001-3601(2010)08-0531-0160-04Alcalase 碱性蛋白酶制备蚯蚓肽的酶解参数研究覃麟,施晓丽*,夏先林(贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025)[摘 要]为解决畜禽养殖污染问题及开发蛋白质饲料资源提供理论依据,以Alcalase 碱性蛋白酶为工具,采用单因素(温度、酶解时间、pH 值、酶用量及底物浓度比)试验考察了蚯蚓蛋白酶的酶解效果,再通过正交试验优化酶解参数。
结果表明:1)单因素试验:蚯蚓蛋白水解度随酶解时间的延长而呈上升趋势,5h 后上升趋于平缓;随着温度的升高和pH 值的增大均呈先上升后下降的趋势,60e 和pH 值达8.0时达最大值;随酶用量的增加和底物浓度的增大均呈先上升后下降的趋势,酶用量超过4%和底物浓度达6%后开始下降。
正交试验:酶解温度、时间、pH 和加酶量对蚯蚓蛋白的酶解度有显著或极显著的影响,4个因素作用的主次顺序为:酶用量>温度>pH >时间;最优组合为温度65e 、时间4h 、pH 值8.0、加酶量5%。
Alca -lase 碱性蛋白酶制备蚯蚓小肽的最佳工艺参数为底物浓度6%、温度65e 、时间4h 、pH 值8.0、加酶量5%。
[关键词]蚯蚓;蚯蚓肽;Alcalase;酶水解[中图分类号]S852.612[文献标识码]AStu dy on En zymatic Technology of Earthworm Peptides Produced by AlcalaseQIN Lin,SH I Xiao -li *,XIA Xian -lin(College of Animal Science,Guizhou U niversity ,Guiy ang,Guizhou 550025,China)Abstract:Enzym atic hy drolysis effect of earthw orm proteinase w as deter mined using Alcalase as the to ol based on different sing le factor tests,w hich included temperatur e,hy dro lysis time,pH ,enzy me dosage and substrate concentration,and the enzy matic param eters w ere optimized by the orthogo nal test to pro vide theo retical basis for so lving breeding pollution and developing protein feed resource.T he r esults show ed that the hydroly sis degr ee o f earthw orm protein r aised w ith prolong of hydroly sis time and the ascend trend w as slow 5h later,the hy dro lysis deg ree o f earthw orm pro tein fir st increased and then decreased w ith the increase o f temperature and pH and the m aximum value appeared at 60e and pH 8.0,the hydroly sis degr ee o f earthw orm protein first increased and then decr eased w ith the increase o f enzy me dosage and substr ate concentration and the hydrolysis degree o f earthw orm protein began to decline w hen enzy me dosag e and substr ate co ncentratio n w as m ore than 4%and 6%respectively,the enzy matic temperature,hydroly sis tim e,pH and enzyme dosag e all had very significant or sig nificant effect on enzy matic deg ree of ear thw orm protein and the effect w as enzym e dosage>temperature>pH >hy dro lysis tim e.T he o ptimum com bination for hydr olysis of earthw orm included 65e ,4h,pH 8.0and 5%enzy me dosage and the optimum technolog ical parameters for production o f ear thw orm peptides are 6%substr ate concentration,65e ,4h,pH 8.0and 5%enzyme dosag e.Key words:ear thw orm ;earthwo rm peptides;Alcalase;enzym atic hydr olysis 近年来我国畜禽养殖业有了快速的发展,但由其排放的大量粪便引起的环境污染已成为急待解决的问题。
地龙的俗称就是蚯蚓，在我国用于治疗疾病已经有四千年历史。
地龙自古就有入药记载。
地龙蛋白就是从蚯蚓体内提取的蛋白。
《黄帝内经》记载地龙“咸寒降清，又善走窜”；《本草纲目》记载：地龙“通经络，活血化瘀，平肝泻火”；《神农本草经》记载：地龙具有清热定惊、通经活络、活血化瘀、平喘、利尿作用；中医典籍云，“地龙天地不透，最能活血”。
“死亡”后的蚯蚓，为什么会重生?一条小小的蚯蚓，被切成两段后，缺少头的一段，会长出一个新的头来；缺少尾巴那一段，会长出一条新的尾巴。
这样，就变成了两条蚯蚓。
生物界中，为何只有蚯蚓，具备这样的神奇功能？到底是什么，能让蚯蚓“断后重生”？1991年，瑞典科学家伯尔斯格解开了这个谜！原来，在蚯蚓的体内含有一种特殊的活性蛋白，在医学上被称为“活性地龙蛋白”。
这种蛋白与其他生物蛋白不同。
蚯蚓被斩断后，这种“活性地龙蛋白”马上发挥作用，刺激蚯蚓的各种细胞，快速有丝分裂，重新建立一套新的运动、触觉、嗅觉等生物系统，实现断后重生。
过不了多久，一条蚯蚓就变成两条。
科学家称：如果人类的身体里，先天就含有这种活性蛋白，那么人类也能像蚯蚓一样具有再生功能。
生物学家达尔文曾称其为“世界上最有价值的生物”。
（给大家附上古代使用地龙蛋白的真实案例，让大家对地龙蛋白有个更全面的认识哦！）2009年中华人民共和国卫生部第18号公告把地龙蛋白列为新资源食品。
地龙蛋白营养价值：地龙独特的生命现象主要与其含量丰富的营养物质有关系。
其体内含有：1）20多种氨基酸；2）多种可被人体直接吸收的有益蛋白；3）多种活性酶；4）20多种微量元素和矿物质。
氨基酸是构建人体细胞、修复人体组织的基础材料。
支配着人体生长、发育、代谢、合成等所有的生命活动。
地龙蛋白中含有多种氨基酸，其中5种是人体必需氨基酸。
酶是参与人体所有的新陈代谢活动的重要物质，催化细胞对营养物质的吸收与代谢废物的排出。
人体没有酶，生命就会停止，酶的含量决定生命的质量，酶的浓度决定生命的长度。
蚯蚓蛋白水解酶对大豆蛋白的分解作用摘要:通过琼脂糖蛋白平板及水解度测定两种方法从定性、定量两个方面研究了蚯蚓蛋白水解酶对大豆蛋白的分解作用，同时测定并比较了蚯蚓豆粕反应物的氨基酸含量。
结果表明，蚯蚓蛋白水解酶对大豆蛋白具有一定的酶解活性，其水解度达2.75%。
利用蚯蚓处理豆粕，反应物中多种氨基酸含量均有不同程度增加，氨基酸总量与豆粕相比上升了27.83%，而且各种必需氨基酸的比例也更趋合理。
因此，利用蚯蚓蛋白水解酶对大豆蛋白的分解作用可以有效地改善豆粕饲料的品质。
关键词:蚯蚓;蛋白水解酶;大豆蛋白;豆粕;氨基酸大豆饼粕蛋白质含量高，粗蛋白含量一般为35%~43%，且蛋白质品质好，赖氨酸含量高，氨基酸比较平衡，已成为全世界最主要的植物蛋白质饲料原料。
大豆蛋白质多以贮藏体的形式存在，直径在2~20 μm之间，分子量较大，约为8 000~600 000，其中分子量在100 000以上的约占80%。
大豆蛋白水解后生成的肽和氨基酸易被动物体消化、吸收，其营养特性和生理活性显著提高，并且大豆肽还具有特殊的生物活性。
蚯蚓蛋白质含量很高，约占鲜重的8%~10%，干重的56%~66%，最高可达70%，且富含多种氨基酸。
蚯蚓体内含有多种活性成分，消化道有10多种蛋白水解酶，这些蛋白酶类对蛋白质有较强的水解活性，利用蚯蚓自身水解酶分解蚯蚓蛋白质，可以得到较高营养价值的蚯蚓水解液，提取率一般在75%以上，其营养成分主要由18种氨基酸和少量短肽组成，其中氨基酸占85%，短肽和小分子蛋白质为14%~15%[1，2]。
为了探索蚯蚓蛋白水解酶对大豆蛋白的分解作用，试验通过琼脂糖蛋白平板法及水解度测定法从定性、定量两个方面研究了蚯蚓蛋白水解酶对大豆蛋白的分解作用，并测定了蚯蚓与豆粕的反应产物中氨基酸的含量，为大豆蛋白与蚯蚓的开发利用提供了依据。
1 材料与方法1.1 材料蚯蚓:大平2号，由唐山师范学院蚯蚓养殖基地提供。
豆粕:产地东北。
第1篇一、实验目的本实验旨在研究地龙蛋白肽在模拟体内环境中的溶解特性，探讨其溶解速率、溶解度以及影响因素，为地龙蛋白肽的应用提供科学依据。
二、实验材料1. 地龙蛋白肽粉末：由地龙提取，经特殊工艺制备而成。
2. 模拟生理盐水：0.9%氯化钠溶液。
3. 精密电子天平：用于称量实验样品。
4. 温度计：用于监测实验温度。
5. 移液器：用于精确移取溶液。
6. 离心机：用于分离溶液中的沉淀物。
7. 酶标仪：用于检测溶液中地龙蛋白肽的含量。
三、实验方法1. 样品制备：准确称取地龙蛋白肽粉末，加入模拟生理盐水，充分溶解，配制成一定浓度的地龙蛋白肽溶液。
2. 溶解实验：- 将配制好的地龙蛋白肽溶液置于恒温水浴锅中，分别在不同温度（25℃、37℃、50℃、65℃）下，定时取样，测定溶液中地龙蛋白肽的含量。
- 同时，观察并记录溶液中地龙蛋白肽的溶解状态，如沉淀、悬浮等。
3. 影响因素实验：- 考察不同pH值（pH 4.0、pH 6.8、pH 8.0、pH 10.0）对地龙蛋白肽溶解度的影响。
- 考察不同搅拌速度对地龙蛋白肽溶解度的影响。
- 考察不同离子强度对地龙蛋白肽溶解度的影响。
4. 数据分析：- 采用酶标仪测定溶液中地龙蛋白肽的含量，绘制溶解度曲线。
- 对实验数据进行统计分析，探讨地龙蛋白肽溶解度的影响因素。
四、实验结果1. 溶解度曲线：在不同温度下，地龙蛋白肽的溶解度随时间推移逐渐增加，37℃时溶解度最大。
随着温度升高，溶解度曲线逐渐右移，表明地龙蛋白肽在较高温度下溶解度较好。
2. pH值影响：在不同pH值下，地龙蛋白肽的溶解度有所差异。
pH 6.8时溶解度最高，pH 4.0和pH 10.0时溶解度较低。
3. 搅拌速度影响：搅拌速度对地龙蛋白肽的溶解度有显著影响。
随着搅拌速度的增加，溶解度逐渐提高。
4. 离子强度影响：离子强度对地龙蛋白肽的溶解度有一定影响。
随着离子强度的增加，溶解度逐渐降低。
五、讨论1. 本实验结果表明，地龙蛋白肽在模拟体内环境中的溶解度受多种因素影响，如温度、pH值、搅拌速度和离子强度等。
蚯蚓纤溶酶的纯化与鉴定姓名：程辉088316150 张忠先088316118班级：科文08生物一、实验目的：1、掌握从生物体中分离纯化蛋白质的基本原理。
2、掌握蛋白质分离的基本操作技术。
3、掌握蛋白质的抽提与沉淀技术—盐析。
4、掌握蛋白质脱盐的方法和操作步骤。
5、掌握凝胶层析分离蛋白质的原理和技术步骤。
6、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理和操作技能。
7、掌握酶活性的检测方法。
二、实验原理：1）、蛋白质盐析：盐在水中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而争取蛋白质分子上的水化膜，还可以中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。
2）、脱盐：经中性盐析分离纯化的蛋白质溶液，尚需要通过脱盐及浓缩的方法才能得到所需要的蛋白质。
使用葡聚糖凝胶G-100装柱过滤，即凝胶层析法脱盐，效果比较好。
经过葡聚糖凝胶G-100柱，经生理盐水洗脱，一开始洗脱出来的为各种蛋白质，隔一段时间洗脱出来的为盐，从而达到使蛋白质脱盐的目的。
3）、离子交换层析：其是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。
利用离子交换剂上的可解离基团(活性基团)对溶液中各种离子的结和力不同而达到分离的目的。
4）、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：在此系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)和少量巯基乙醇，单体蛋白质或亚基的多肽链处于伸展状态，此时SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合体。
结果：1、所有的SDS-蛋白质复合体都具有相同的荷质比。
2、具有相同的构象。
因此蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与原来所带的电荷和分子形状无关。
三、材料与试剂：1）、材料：处理过的蚯蚓、葡聚糖凝胶Sephadex G-1002）、试剂：葡聚糖凝胶Sephadex G-100、DEAE-Sepharose CL-6B 阴离子交换剂、0.2M磷酸盐缓冲液、60%饱和度的硫酸铵、PH=8.0的磷酸盐缓冲液、1MNacl、检测板、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、电极缓冲液、样品缓冲液、30%Arc-bis贮液、10%过硫酸胺、TEMED原液、染色液CBB—R250、脱色液。
专利名称：一种蚯蚓活性蛋白及其提取方法与应用专利类型：发明专利
发明人：吉爱国,梁浩,宋淑亮
申请号：CN200910016682.4
申请日：20090703
公开号：CN101607990A
公开日：
20091223
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种蚯蚓活性蛋白，是通过以下方法提取的：1)取鲜活蚯蚓，清洗，自然条件下过夜吐泥；2)蒸馏水清洗，去除水分，称重；3)加入双蒸水，冰浴条件下高速匀浆；4)将匀浆液静置4小时，离心收集上清；5)冰浴条件下，采用盐析法或其它方法沉淀蛋白；6)离心收集蛋白，用0.1M磷酸盐缓冲液重溶；7)将重溶后的溶液用微孔滤膜过滤后，采用凝胶过滤层析法进行蛋白分离；
8)收集洗脱峰，脱盐；9)将脱盐后的洗脱液干燥，即得蚯蚓活性蛋白。
本发明应用现代生化分离技术从鲜活蚯蚓中提取出具有药理活性的蛋白，一方面提高了其药理活性，另一方面可以有效的去除蚯蚓体内的其它各种杂质，避免了这些杂质引起的不良反应。
申请人：山东大学威海分校
地址：264209 山东省威海市文化西路180号
国籍：CN
代理机构：济南圣达专利商标事务所有限公司
代理人：杨琪
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专利名称：一种利用蚯蚓肠道活性酶酶解鱼蛋白生产活性肽的方法
专利类型：发明专利
发明人：万端极,徐国念,何昌义,李猷,袁润蕾
申请号：CN200810047988.1
申请日：20080612
公开号：CN101297672A
公开日：
20081105
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种用鲜活蚯蚓肠道活性酶酶解鱼蛋白生产活性肽的方法，将蚯蚓洗净、捣碎、匀浆、加水稀释、调pH值、超声波提取和冷冻离心10分钟得活性酶；将提取活性酶液与鱼蛋白混匀酶解、灭酶、脱色、膜精制、浓缩、喷雾干燥，得到小分子活性肽，提酶条件为：pH值为5.0～8.5，蚯蚓量与加入的水量(w/w)比为1∶5～40，超声波功率为300W，超声时间为100～400s，在3500r/min下冷冻离心，滤去残渣，上清液为活性酶，按常规方法酶解鱼蛋白，活性酶添加量为蚯蚓重量与鱼重量比为4‰～12‰∶1。
本发明利用蚯蚓肠道活性酶酶解鱼可大幅度降低生产成本，酶解度达64％以上，适合于工业化生产。
申请人：武汉赛普膜技术有限公司
地址：430068 湖北省武汉市武昌南湖李家墩1号
国籍：CN
代理机构：武汉开元专利代理有限责任公司
代理人：唐正玉
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