鸡胚的结构及尿囊腔接毒

病毒的鸡胚接种技术目的要求掌握鸡胚培养病毒的接毒和收毒方法，明确鸡胚培养病毒的应用。

仪器及材料受精卵、恒温箱、照蛋器、接种箱、蛋架、一次性注射器（1～5ml）、中号镊子、眼科剪和镊子、毛细吸管、橡皮乳头、灭菌平皿、试管、吸管、酒精灯、试管架、胶布、蜡、锥子、锉、煮沸消毒器、消毒剂（5%碘酊棉、75%酒精棉、5%石炭酸或3%来苏儿）、新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗。

方法与步骤（尿囊接种为例）1．选择9～12日龄的健康鸡胚，最好是SPF鸡胚。

为便于照蛋观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好。

选好后用孵化箱孵化，要注意温度、湿度和翻蛋。

孵化最低温度为36℃，一般为37.5℃，相对湿度为60%。

每日最少翻蛋3次。

健康鸡胚：照蛋时可见清晰的气室、血管及鸡胚的活动。

2．病毒材料的处理怀疑污染细菌的液体材料：加抗生素（青霉素1000IU和链霉素1000μg/ml）置室温1h或4℃冰箱12～24h→高速离心，取上清液→细菌滤器滤过除菌若用新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗，则无菌操作用生理盐水将其稀释100倍。

3．照蛋以铅笔划出气室、胚胎位置及接种的位置，标明胚龄及日期气室朝上立于蛋架上。

4．消毒先碘酊后酒精，由内向外呈同心圆状消毒5．打孔用灭菌小锥子在在气室中心或远离胚胎侧气室边缘，避开大血管进行打孔，孔径以1ml注射器针头容量刺入为宜。

6．注入病毒材料用一次性1ml注射器吸取新城疫病毒液垂直或稍斜插入气室，刺入尿囊，向尿囊腔内注入0.1～0.3ml。

7．封孔并继续孵化注射后，用熔化的石蜡封孔，置温箱中直立孵化3～7d。

孵化期间，每6h照蛋一次，观察胚胎存活情况。

弃去接种后24h内死亡的鸡胚，24h以后死亡的鸡胚应置0～4℃冰箱中冷藏4h或过夜（气室朝上直立），一定时间内不能致死的鸡胚也放冰箱冻死。

8．收毒收毒原则：（1）先冷藏再收毒。

（2）接种什么部位，收集什么部位。

（3）固液分开收集。

（4）无菌收集。

（5）冷冻保存。

收毒方法：无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳及壳膜，用灭菌镊子夹起并撕开或剪开气室中央的绒毛尿囊膜，然后用灭菌吸管从破口处吸取尿囊液，注入灭菌青霉素瓶或试管内。

流感病毒鸡胚接种材料：9-11龄鸡胚、孵蛋箱、照蛋器、开卵钻、石蜡、注射器、碘酒、70%酒精、镊子、二级生物安全柜等。

方法：1 照蛋：⑴避开鸡胚及主动脉，找寻两血管间隙划线（最佳点）⑵划线在血管之间⑶标记蛋时不要太靠近气室处，因后面去壳时可能敲掉，导致标记不见2 开孔：⑴开孔前先用75%酒精擦一下，由下而上或由上至下一遍即可，不可反复擦⑵开孔勿太大（太大不易封住，且易染菌）3 注射：⑴针头45度斜插入孔中，至针头尾部到达蛋壳⑵注射后不要用力过大，抽出时不要过快⑶一针插入鸡胚，不要在里面搅拌注：⑴握病毒管时不要握底部，易使病毒失活，融化时最好冰上融化，或流水冲洗⑵吸取液体时先混匀尿囊腔接种：照检后画出气室边界和胎位，在胚胎面与气室交界处边缘约1mm处并避开血管做一标记，此即为注射点。

在点及周围用75%酒精消毒，并用钻蛋机钻开一个约2mm长小口，勿损伤壳膜。

用注射器注入流感病毒0.1-0.2ml，然后用石蜡溶化封口，置33-35度孵箱培养。

每日照检鸡胚一次，于接种后24h 内死亡者为非特异性死亡应弃去。

甲型流感一般培养44-48h收获，而乙型流感病毒培养72h后进行收获。

如病毒用冷冻干燥标本进行传代，无论甲型还是乙型均培养72h后才进行收获收获前鸡胚须置4度冰箱6h或过夜，但不能置时间过长，过长会引起散黄。

如急于收获亦可置-20度冰箱1h左右，但不能过长，过长会引起鸡胚结冰，再融化时卵黄膜就破碎，卵黄就流出。

预冷的目的是：将鸡胚冻死使血液凝固，避免收获时流出红细胞并同尿液或羊水里的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。

收获时，用75%酒精消毒气室部卵壳，用消毒镊子轻轻敲碎气室部卵壳并取走之，再用另一无菌镊子撕去气室部壳膜，然后用无菌吸管通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔，吸取尿囊液，置试管内4度或低温保存待用。

P3规范：⑴做有毒物需穿两件衣，⑵物从物流走，人从人流过，⑶所有沾毒东西都装2层塑料袋，密封，灭菌。

第一节鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。

目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。

可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。

虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。

鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。

当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非SPF鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。

因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。

原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用SPF鸡胚。

一般说来，孵育至8-14天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒，14天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。

在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。

孵育至21天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。

鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。

如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。

气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。

鸡胚的钝头（俗称“大头”），是气室，其功能是呼吸和调节胚内压力。

病毒接种1.选胚：首先，在照蛋间挑选出血管模糊，没有生命迹象的鸡胚。

2.标记注射点：接着用记号笔在气室上方约1mm处画线，在线的下方挑选注射点，在挑选注射点时应注意避开主血管，避开鸡头。

3.打孔：打孔前先用碘酊在气室部位消毒，用打孔器在气室线上方打孔。

注意：孔不宜过大，否则会导致封蜡不完全，甚至将蜡油流进鸡胚内部。

4.注射病毒：用注射枪向每个鸡蛋孔内注射0.2ml病毒稀释液，注射时针头朝向注射点方向，每次注射停留4~6s。

5.封蜡：注射完毕，用镊子夹取酒精棉沾上蜡油，进行鸡胚封蜡。

6.培养：将封蜡完成的鸡胚放入孵化箱中培养。

孵化箱温度设置33~35℃，湿度50%~70%，甲型流感病毒培养48~52小时，乙型流感病毒培养66~72小时。

需准备的仪器试剂：手电筒，记号笔，碘酊，棉签，量筒（稀释），酒精灯，废液瓶，打孔器，三脚架，蜡块，连续注射器，一次性注射器，移液枪，移液枪枪头，镊子，纱布，打火机，蓝盖瓶。

注意事项：（1）、前一天将病毒原液拿至4℃冷库；（2）、前一天准备好需要灭菌消毒的物品，高温高压灭菌，烘干；确定好参加实验人数，准备好无菌服；（3）、接种当天早上将接种所需生物安全柜开紫外杀菌；收获尿囊液1.鸡胚消毒:将培养好的鸡胚放入4℃冷库进行冷胚6h以上；首先，用0.1%的新洁而灭溶液将鸡胚进行消毒，每次消毒1~2分钟。

接着，在鸡胚的气室用碘酊消毒。

2.烙蛋：将经过消毒处理的鸡胚在烙蛋器上进行烙蛋。

3.收获：先用小镊子将壳膜撕破扒出气室，再用大镊子压住鸡头，同时用5ml移液枪吸取尿囊液。

收获的尿囊液应是澄清、微黄状。

4.保存：将收获的尿囊液放至6℃冷库保存。

需准备的仪器试剂：新洁而灭溶液，碘酊，棉签，烙蛋器，废液瓶，镊子，5ml移液枪，5ml移液枪枪头，蓝盖瓶（数量由病毒原液体积决定）。

注意事项：（1）、前一天准备好需要灭菌消毒的物品，高温高压灭菌，烘干；确定好参加实验人数，准备好无菌服；（2）、收获当天早上将收获所需生物安全柜开紫外杀菌；血凝滴度试验1.稀释病毒液：取一块洁净的“96”孔血凝板，横向摆放。