环介导等温扩增技术检测食源性致病菌的研究进展

环介导等温扩增技术在食品安全检测领域的应用研究进展范安妮;佘之蕴;张娟;周臣清;梁宇斌【摘要】环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年发展起来的一种新型核酸检测技术其采用特异识别靶序列上6个位点的4条引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在等温条件下进行核酸扩增,与传统核酸检测技术(PCR法、实时荧光定量PCR法)相比,具有操作简单、特异性强、灵敏度高、可肉眼判读结果等优点核酸检测是食品安全检测技术的一个重要手段,本文综述了LAMP技术在食品微生物检测、转基因成分检测、过敏原成分检测和动物源性成分检测领域的应用研究进展,探讨了LAMP技术在食品检测领域的发展前景,以期为食品快速、高通量检测技术建立提供参考%loop-mediated isothermal amplification(LAMP) is a novel nucleic acid amplification method developed in recent years.The nucleic acid amplification is performed ender isothermal conditions by a set of four specially designed primers and a DNA polymerase with strand displacement pared with the traditional nucleic acid detection technology (PCR and real-time fluorescence quantitative PCR),it has the advantages of easy operation,high specificity,sensitivity and visual interpretation.Nucleic acid detectiou is an important means of food safety detection.This review summarized the application research progresses mainly focused on food safety detection,including food microorganisms testing,genetically modified organisms testing,food allergens testing and food derived ingredients testing.In addition,the perspectives of LAMP in food detectiou were discussed for better and high volume testing in food safety detection.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2018(039)010【总页数】5页(P330-334)【关键词】环介导等温扩增技术(LAMP);食品安全;检测;核酸扩增【作者】范安妮;佘之蕴;张娟;周臣清;梁宇斌【作者单位】广东产品质量监督检验研究院,广东顺德528300;广东产品质量监督检验研究院,广东顺德528300;广东产品质量监督检验研究院,广东顺德528300;广东产品质量监督检验研究院,广东顺德528300;广东产品质量监督检验研究院,广东顺德528300【正文语种】中文【中图分类】TS207.3核酸扩增是分子生物学研究领域的一项重要技术,目前已广泛应用于医学诊断、食品检测、动植物检验检疫等行业中。

LAMP方法在食源性副溶血性弧菌属检测的应用【摘要】目的：探讨副溶血性弧菌属（vibrio parahaemo lyticus， vp）环介导等温扩增（lamp）在食源性食物检测中的应用价值。

方法：利用文献报道的lamp检测方法和分离培养法分别对12类286份食源性食品标本进行副溶血性弧菌检测；检测结果经统计学分析来评价lamp法和分离培养法的差异性。

结果：lamp 法从64份动物性水产标本中检出44份副溶血性弧菌阳性菌株，阳性率为68.75%，电泳和加荧光染料染色后均能判断结果；国标法从64份动物性水产标本中检出33份副溶血性弧菌阳性菌株，阳性率为51.6%。

两种方法的检测结果经统计学分析，p<0.005，结果有显著性差异，lamp法阳性率高于培养法。

lamp法可在24小时内从食品中检测出副溶血性弧菌，而国标法检出副溶血性弧菌需要4-7天，lamp法更快速。

结论：副溶血性弧菌属lamp法检测阳性率高于国标法，lamp法可用于食源性食物副溶血性弧菌属的快速检测。

【关键词】环介导等温扩增；副溶血性弧菌属；食源性；检测【中图分类号】r155 【文献标识码】a 【文章编号】1004-7484（2012）13-0555-02随着生活水平的不断提高，食源性食物的安全越来越受到全社会和政府各级部门的高度重视与关注，而与食源性食物安全相关的微生物检测已成为食品保障的重要措施之一[1]。

用lamp法可以快速、简便、准确的检测出食源性食物中致病性微生物，大大缩短检测时间，提高致病性微生物的检出率，为致病性微生物的分离培养提供指导方向和科学依据。

副溶血性弧菌是引起人类急性胃肠炎和食物中毒的一种重要的食源性致病菌，在海水产品中其感染水平可达80%[2]，在细菌性食物中毒中，由副溶血性弧菌引起的居首位[3]。

传统的副溶血性弧菌国标法[4]检测时间长，检出率低，不宜快速出结果。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，lamp）技术[7]是一种新型等温核酸扩增方法，针对靶基因设计4-6条引物，利用一种具有链置换活性的bst dna聚合酶，在恒温条件（60-65 ℃）保温约 60 分钟，即可完成核酸扩增反应，产物为针对靶基因扩增产生的各种大小的茎环状dna混合物，副产物为肉眼可见的白色焦磷酸镁沉淀。

核酸检测技术在食源性致病菌中的研究进展孔民路玮王圣涵丁延辉李成 ( 通讯作者）烟台市芝罘区疾病预防控制中心山东烟台264000摘要：食源性疾病已是世界性的公共健康问题，严重威胁人类生命健康。

在传统的食源性致病菌检测方法中，免疫学方法和传统培养法具有灵敏度低、检测周期长等不足，已不能满足人类对食源性致病菌的检测需求。

随着医疗设备与技术的发展，多种核酸检测方法逐渐应用于食源性致病菌检测中，现对其在食源性致病菌检测应用中的优缺点、适用范围等进行展开概述，以便为更快速、准确、简单的检测方法提供思路。

关键词：食源性; 致病菌; 核酸检测; 研究进展目前，食源性疾病的发病率呈逐年升高趋势，对人类健康造成了严重危害[1]。

食源性疾病主要是因食用经致病菌、毒素等污染的水或食物而导致的一类疾病，其致病因子包括细菌、真菌、病毒等[2]。

医学现已确认可引起食源性疾病的致病菌超过31种。

为减少食源性疾病的发生，确保食品供应安全，检测食品中是否含有食源性致病菌具有重要意义[3]。

在食源性致病菌的检测方法中，免疫学方法和传统培养法是较为常见的两种方法。

免疫学方法具有方便快速、操作简单等特点，但其在应用中灵敏度较低，且易发生漏筛。

传统培养法在应用中具有工作量大、灵敏度低、检测周期长等不足，且每次仅可检出单一菌种。

这两种方法越来越不能满足食源性致病菌的检测需求，具有一定的局限性[4]。

随着医疗技术与设备的进步，核酸检测方法逐渐应用于食源性致病菌检测，本文旨在概述在食源性致病菌检测中应用核酸检测方法的研究进展。

1核酸检测方法核酸检测方法主要包括普通聚合酶链式反应法（PCR）、多重PCR（mPCR）、实时荧光定量PCR法（qPCR）、核酸依赖性扩增法（NASBA）、环介导等温扩增法（LAMP）、基因芯片法、聚合酶螺旋反应法（PSR）、重组酶聚合酶扩增技术（RPA）等，其主要是通过设计引物或探针对目标病原体特定的RNA或DNA序列进行检测。

LAMP在阪崎克罗诺杆菌检测中的研究进展王彦人1，焦敬波1，张钧森1，康青1，李萍1，杜欣军1*(1.省部共建食品营养与安全国家重点实验室，天津科技大学食品科学与工程学院，天津，300457)摘要：阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）是一类食源性致病菌，可引起新生儿脑膜炎、败血症等疾病。

环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP）技术是一类新型的恒温核酸扩增技术，具有灵敏度高、耗时短、特异性强、对设备需求低等特点，可与多种检测方法结合应用于食源性致病微生物的检测。

本文旨在阐明LAMP的基本原理并归纳结合不同检测方法的LAMP技术在阪崎克罗诺杆菌快速检测中的研究进展。

关键词：阪崎克罗诺杆菌；环介导等温扩增；快速检测中图分类号：TS201.6Process of Loop-Mediated Isothermal Amplification for Detection inCronobacter sakazakiiWANG Yanren1，JIAO Jingbo1，ZHANG Junsen1，KANG Qing1，LI Ping1，DU Xinjun1*(1. State Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, College of Food Science and Engineering, TianjinUniversity of Science and Technology, Tianjin 300457, China)Abastract:Cronobacter sakazakii is a kind of foodborne conditional pathogenic bacteria, which can cause neonatal meningitis, septicemia and other diseases. Loop-mediated isothermal amplification technique (LAMP) is a new type of isothermal nucleic acid amplification technique with high sensitivity, rapidity and low equipment requirements. It can be combined with a variety of detection methods for practical application and has been widely used in the detection of foodborne microorganisms. This paper aims to elucidate the phylogenetic taxonomy of C. sakazakii, the basic principles of LAMP, and to summarize the progress of LAMP technology combined with different detection methods in the detection of C. sakazakii.Keywords: Cronobacter sakazakii, loop-mediated isothermal amplification (LAMP), rapid detection阪崎克罗诺杆菌为克罗诺杆菌属（Cronobacter，主要种型如表1所示）中最为典型的一类食源性致病菌种，易感染全年龄段人群0，致死率高达40~80%0。

环介导等温扩增技术原理引言随着生物技术的快速发展，分子生物学中的核酸扩增技术逐渐成为研究的重要工具之一。

而环介导等温扩增技术作为一种新的核酸扩增方法，具有快速、简便、高效等优点，在生物医学研究、临床诊断、食品安全等领域发挥着重要的作用。

等温扩增技术的背景传统的PCR（聚合酶链式反应）技术是通过循环升温、降温的方法来完成DNA扩增过程。

然而，该技术要求精确的温度控制，对设备和试剂的稳定性要求很高。

此外，传统PCR扩增过程中存在高温引起的扩增产物降解等问题。

因此，研究人员不断寻求一种更为简便、高效的核酸扩增方法。

等温扩增技术由此应运而生。

等温扩增技术的原理等温扩增是指在恒定的温度下，通过酶的作用，在核酸模板的辅助下，使扩增产物逐渐积累的过程。

其中，环介导等温扩增技术作为一种新兴的等温扩增方法，与其他方法相比具有更高的特异性和敏感性。

环介导等温扩增技术的反应体系环介导等温扩增技术通常包括三个主要组分：核酸模板、引物和酶。

核酸模板核酸模板是等温扩增的起始物质，可以是DNA或RNA。

在反应过程中，核酸模板会经历多次复制，从而实现扩增。

引物引物是用来引导扩增反应的小片段核酸序列。

在环介导等温扩增技术中，引物会与核酸模板序列互补结合，作为复制的起始点。

酶环介导等温扩增技术中主要使用的酶是DNA环介导聚合酶（Bst DNA polymerase）。

该酶具有良好的耐热性，可以在高温条件下活性稳定，并且具有DNA依赖性DNA聚合酶和脱氧核苷酸酶活性。

环介导等温扩增技术的具体过程环介导等温扩增技术主要通过以下几个步骤完成扩增过程：1. 首先，将反应体系中的DNA模板加热至解链温度，使DNA模板解链成两条单链。

2. 然后，引物与DNA模板序列互补结合，形成引物-模板复合物。

3. 酶（Bst DNA polymerase）结合在引物-模板复合物上，并且开始在DNA模板的3’端进行DNA合成。

该酶具有脱氧核苷酸酶活性，可以在DNA合成过程中消除RNA、DNA杂质。

L A M P检测综述戴婷婷集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]环介导等温扩增技术的应用研究进展戴婷婷1，陆辰晨2，郑小波2（1南方现代林业协同创新中心，南京林业大学林学院，江苏南京210037；2南京农业大学植物保护学院，江苏南京210095；）摘要：环介导等温扩增技术（Loop–mediated isothermal amplification，LAMP）采用特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在等温条件（60℃~65℃）下60 min左右进行核酸扩增，其扩增效率可达到109~1010个数量级，具有特异性强、灵敏度高、等温、操作简单和检测结果快速等优点，已广泛应用于病毒、细菌、寄生虫、菌物等病原物的检测中。

本文对LAMP技术原理及其在病原物检测中的应用做了简要综述。

关键词：环介导等温扩增技术；应用；检测；病原物中图分类号：文献标志码：文章编号：Application Research Progress Of Loop-Mediated IsothermalAmplificationDAI Ting-ting1; LU Chen-chen2; ZHENG Xiao-bo2(1Southern China Collaborative Innovation Center of Sustainable Forestry, College of Forestry, Nanjing Forestry University, Nanjing, Jiangsu 210037, China；2College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)Abstract：A new method of gene amplification called Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has been developed in recent years. LAMP assay possess characteristic of simpleness, fleetness and high specificity. The whole procedure is very simple and rapid which can be completed in less than 80 min under isothermal conditions employing a set of six specially designed primers of a target gene, by incubating all the reagents in a single tube. LAMP does not require a thermal cycler and can be performed simply with a heating block or water bath. Considering the advantags of rapid amplication, simple operation and easy detection, LAMP has potential applications for diagnosis as well as surveillance of infectious diseases in developing countries without requiring sophisticated equipment or skilled personnel. LAMP has been widely applied to the detection of such pathogens as virus，bacteria, parasite, fungi etc. This article summarized the principle of LAMP，and the application in detection of pathogenic microorganisms.KEY WORDS：Loop-mediated isothermal amplification; application; detection; pathogenic microorganisms核酸扩增技术是分子生物学领域的一项重要的研究手段，核酸扩增技术主要包括常规PCR 为基础的变温扩增技术以及等温扩增技术两大类。

㊃综 述㊃D O I :10.3969/j.i s s n .1672-9455.2024.07.031环介导等温扩增技术在病原微生物临床检测中的应用*廖 川1,梁丽娜1,黄少宇2,马梦霞3,李雪斌4综述,韦贵将1ә审校1.右江民族医学院附属医院医学检验中心/广西高校高发病临床分子诊断研究重点实验室/百色市高发病临床分子诊断与研发重点实验室,广西百色533000;2.广西壮族自治区田东县人民医院医学检验科,广西百色533000;3.右江民族医学院医学检验学院,广西百色533000;4.右江民族医学院附属医院神经内科,广西百色533000摘 要:病原微生物是威胁人类健康的重要因素之一,快速㊁准确的检测方法对于感染性疾病的诊断具有重要意义㊂环介导等温扩增(L AM P )是一种恒温扩增方法,具有反应时间短㊁操作简便㊁灵敏度高㊁特异度高㊁检测成本低等优点,因此被广泛应用于感染性疾病的快速诊断㊂基于这种情况,该文主要阐述了L AM P 的原理㊁特点及其在临床常见病原微生物检测方面的应用与研究进展㊂L AM P 技术现在已经被应用于病原微生物的检测,且具有较高的灵敏度及特异度,但该技术仍有易产生假阳性㊁引物设计复杂等不足之处㊂该文综述了近年来L AM P 技术在病原微生物感染中的应用与进展,并对其未来的发展前景进行了展望,以期在资源有限的环境中为病原微生物感染的快速诊断提供合理的研究方向㊂关键词:环介导等温扩增技术; 核酸检测; 病原微生物; 核酸扩增; 结核分枝杆菌中图法分类号:R 446.5文献标志码:A文章编号:1672-9455(2024)07-1003-06A p p l i c a t i o n o f l o o p -m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n t e c h n i qu e i n p a t h o g e n i c m i c r o o r ga n i s m s c l i n i c a l d e t e c t i o n *L I A O C h u a n 1,L I A N G L i n a 1,HU A N G S h a o y u 2,MA M e n g x i a 3,L I X u e b i n 4,WE I G u i j i a n g1ә1.M e d i c a l L a b o r a t o r y C e n t e r ,A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f Y o u j i a n g M e d i c a l U n i v e r s i t y fo r N a t i o n a l i t i e s /K e y L a b o r a t o r y o f C l i n i c a l M o l e c u l a r D i a g n o s i s a n d R e s e a r c h f o r H i gh I n c i d e n c e D i s e a s e s i n G u a n g x i U n i v e r s i t i e s /B a i s e K e y L a b o r a t o r y o f C l i n i c a l M o l e c u l a r D i a gn o s i s ,R e s e a r c h a n d D e v e l o p m e n t f o r H i g h I n c i d e n c e D i s e a s e s ,B a i s e ,G u a n g x i 533000,C h i n a ;2.D e p a r t m e n t o f M e d i c a l L a b o r a t o r y ,T i a n d o n g C o u n t y P e o p l e 's H o s p i t a l o f G u a n g x i Z h u a n g A u t o n o m o u s R e g i o n ,B a i s e ,G u a n g x i 533000,C h i n a ;3.S c h o o l o f L a b o r a t o r y M e d i c i n e ,Y o u j i a n g Me d i c a l U n i v e r s i t yf o r N a t i o n a l i t i e s ,B a i s e ,G u a ng x i 533000,Chi n a ;4.D e p a r t m e n t o f N e u r o l o g y ,A f fi l i a t e d H o s p i t a l o f Y o u j i a n g M e d i c a l U n i v e r s i t y f o r N a t i o n a l i t i e s ,B a i s e ,G u a n gx i 533000,C h i n a A b s t r a c t :P a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s a r e o n e o f t h e i m p o r t a n t f a c t o r s t h r e a t e n i n g h u m a n h e a l t h .R a pi d a n d a c c u r a t e d e t e c t i o n m e t h o d s a r e o f g r e a t s i g n i f i c a n c e f o r t h e d i a g n o s i s o f i n f e c t i o u s d i s e a s e s .L o o p-m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n (L AM P )i s o n e o f t h e i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n m e t h o d s ,w h i c h h a s t h e a d v a n t a ge s of s h o r t r e a c t i o n t i m e ,s i m p l e o p e r a t i o n ,h igh s e n si t i v i t y ,h i g h s p e c i f i c i t y a n d l o w c o s t ,s o i t i s w i d e l y us e d i n t h e r a p i d d i a g n o s i s o f i n f e c t i o u s d i s e a s e s .B a s e d o n t h i s s i t u a t i o n ,t h i s p a p e r m a i n l y e l a b o r a t e s t h e p r i n c i pl e a n d c h a r a c t e r i s t i c s o f L AM P a n d i t s a p p l i c a t i o n a n d r e s e a r c h p r o g r e s s i n t h e d e t e c t i o n o f c o mm o n p a t h o g e n i c m i -c r o o r g a n i s m s i n c l i n i c .L AM P t e c h n o l o g y h a s b e e n a p p l i e d t o t h e d e t e c t i o n o f p a t h o g e n i c m i c r o o r ga n i s m s w i t h h i g h s e n s i t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y ,b u t t h i s t ec h n o l o g y i s s t i l l p r o n e t o p r od u cef a l s e p o s i t i v e ,c o m p l e x p r i m e r d e -s ig n a n d o th e r s h o r t c o mi n g s .T h i s p a p e r r e v i e w s t h e a p p l i c a t i o n a n d p r o g r e s s o f L AM P t e c h n o l o g y in p a t h o -g e n i c m i c r o b i a l i n f e c t i o n i n r e c e n t y e a r s ,a n d o u t l o o k s i t s f u t u r e d e v e l o p m e n t p r o s pe c t i n o r d e r t o p r o v i d e a r e a s o n a b l e r e s e a r c h d i r e c t i o nf o r t h e r a p i d d i ag n o s i s o f p a th o ge n i c m i c r o b i a l i nf e c t i o n i n t h e e n v i r o n m e n t w i t h l i m i t e d r e s o u r c e s .K e y w o r d s :l o o p -m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n t e c h n i q u e ; n u c l e i c a c i d t e s t ; p a t h o g e n i c m i c r o o r -g a n i s m ; n u c l e i c a c i d a m p l i f i c a t i o n ; m yc o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s ㊃3001㊃检验医学与临床2024年4月第21卷第7期 L a b M e d C l i n ,A pr i l 2024,V o l .21,N o .7*基金项目:国家自然科学基金项目(82260418,82060570);右江民族医学院附属医院高层次人才项目(R 202011701);广西壮族自治区百色市科学研究与技术开发计划项目(百科20232031)㊂ә通信作者,E -m a i l :w e i g u i j i a n g2021@163.c o m ㊂病原微生物是指能够引起人和动物疾病的微小生物,对人类健康具有极大的威胁㊂临床上很多常见疾病都是病原微生物感染导致的,如各种病毒性肝炎㊁结核病㊁新型冠状病毒感染等,这类疾病通常都具有一定的传染性,有的甚至可以造成世界范围的大流行㊂因此,临床迫切需要一种能够准确㊁高效㊁快速㊁简便地识别相关病原体的检测方法㊂随着分子生物学研究的不断深入,核酸扩增技术在诊断领域的应用越来越广泛㊂其中最具代表性的是聚合酶链反应(P C R),它能在短时间内对靶标完成指数级扩增,且具有较高的灵敏度和特异度[1],因此很多病原微生物检测都将其作为诊断的参考标准㊂然而,P C R需要经历变温过程,对设备和操作者要求较高,从而导致其在欠发达地区和现场实施检测上的应用受到一定的限制㊂而等温扩增技术的出现就很好地解决了这一问题,该技术在恒定温度下即可完成扩增反应,摆脱了对高精密热循环仪的依赖,有望取代P C R在诊断领域的地位㊂环介导等温扩增(L AM P)是由日本荣研株式会社N O T OM I等[2]于2000年研发,是一种较为成熟的等温扩增法,具有高效㊁快速㊁灵敏度高㊁特异性度强等优点,因此被应用于医学领域中细菌㊁病毒㊁寄生虫的检测[3-4]㊂1 L AM P的反应原理与特点1.1 L AM P的反应原理 L AM P的扩增过程可以分为两个阶段,即起始阶段和扩增循环阶段[2],扩增完成后可与多种技术相结合实现扩增产物的检测,不同的技术有不同的检测原理,如试纸条法㊁荧光法等,本文主要讲述L AM P的扩增原理㊂在扩增的过程中需要引物的参与,和其他扩增方法不同的是,L AM P 需要设计2对引物,即内部引物(F I P/B I P)和外部引物(F3/B3),通过这两对引物对靶基因的6个不同区域(F1-F1c㊁F2-F2c㊁F3-F3c㊁B1-B1c㊁B2-B2c㊁B3-B3c)特异性识别,因此L AM P具有极强的特异性㊂在起始阶段,当温度达到60~65ħ时,双链D N A处于解旋与结合的不稳态,其中上游内部引物F I P中的F2序列区段首先与模板目标区段的单链D N A中的F2c结合,在B s t D N A聚合酶的作用下自F2的3'末端延伸启动链置换D N A合成㊂外引物F3则与模板F3c结合并延伸,置换出由F I P链接的互补单链D N A,此单链的F1c与F1区段为互补结构,可通过自我碱基配对形成环状结构㊂以上述步骤中合成的5'端以茎环状结构的单联D N A为模板,下游内部引物B I P的B2序列区段与单链D N A模板的B2c 结合,在B s t D N A聚合酶的作用下启动链置换反应,自B2的3'末端开始延伸合成D N A㊂外引物B3则与模板B3c结合并延伸,置换出由B I P链接的互补单链D N A,此单链的F1与F1c区段互补,B1c与B1区段互补,形成哑铃状结构的单链D N A㊂哑铃状结构以3'末端的F1区段为起点,以自身为模板进行D N A合成㊂由此,哑铃状结构转变为茎环状结构,L AM P扩增进入循环阶段㊂循环阶段以起始阶段形成的单链D N A为模板,在内部引物与B s t D N A聚合酶的作用下,反复进行延伸和链置换反应,最终产生大量具有多个靶标反向重复序列的茎环D N A结构[2]㊂1.2 L AM P的特点 L AM P不需要进行高温变性,整个过程在60~65ħ反应60m i n即可完成㊂与其他核酸扩增法相比,L AM P具有更高的特异性和抗干扰性,因为它是通过2对引物特异性识别靶基因上的6个不同区域来启动反应㊂此外,L AM P的灵敏度也很高,能够在短时间内扩增出1ˑ107~1ˑ1010数量级的产物,比常规P C R高100倍左右[5],有报道指出L AM P最低可检测10个基因拷贝或更低的检测限[6]㊂而且L AM P对设备要求不高,一般的水浴锅即可满足需求㊂因此,L AM P具有高效㊁灵敏度高㊁特异性强㊁简便等优点㊂当然,L AM P也有其不足之处:首先,L AM P反应需要2对引物参与,因此对引物设计要求较高,如果引物设计不合理,就可能产生非特异性扩增片段影响结果的正确性㊂其次,由于L AM P 的灵敏度很高,在反应过程中易产生气溶胶污染,导致假阳性结果㊂最后,由于L AM P的扩增产物是长短不一且含有大量茎环结构的D N A双链,因此很难对其扩增产物进行定量分析㊂2 L AM P技术在病原微生物临床检测中的应用目前,临床上对于病原微生物感染的诊断方法主要有培养法㊁血清学方法及P C R㊂但这些方法都有其不足之处:培养法耗时较长;血清学方法特异度不高,易产生假阳性结果;P C R对设备和实验环境要求较高㊂而L AM P因其具有灵敏度高㊁特异性强㊁操作简便等优点,有望取代传统技术在病原微生物检测中的地位㊂2.1 L AM P技术在新型冠状病毒检测中的应用新型冠状病毒感染者主要表现为发热㊁咳嗽,严重者会休克甚至死亡㊂虽然目前已经上市了大量的疫苗,但对新型冠状病毒快速㊁准确㊁高效地诊断仍然是疫情防控的关键㊂实时反转录P C R因具有特异性强㊁灵敏度高等优点,被视为诊断新型冠状病毒感染的金标准[7],但它耗时较长,而且对设备和操作人员的要求也较高,因此在资源匮乏地区和现场实时检测新型冠状病毒的应用方面受到一定的限制㊂L AM P作为一种恒温扩增法,不仅操作简便,而且其灵敏度不低于反转录P C R[8],因此L AM P可以作为反转录P C R的替代方法以弥补其不足之处㊂目前,已经有大量基于L AM P的试剂盒被用于新型冠状病毒的检测,E i k e n 公司开发的L o o p a m p T M新型冠状病毒检测试剂盒基于N基因和R d R p基因设计,通过测量反应体系浊度确定检测结果㊂为了评估L o o p a m p T M新型冠状病毒㊃4001㊃检验医学与临床2024年4月第21卷第7期 L a b M e d C l i n,A p r i l2024,V o l.21,N o.7检测试剂盒的有效性,Y A N等[9]用该试剂盒检测新型冠状病毒,并使用L A-200浊度计对扩增产物进行实时检测,结果表明该反应能够在35m i n内检测到水平为10c o p y/μL的R N A㊂HU A N G等[4]针对新型冠状病毒的O R F1a b㊁S㊁N基因,将比色法与L AM P结合用于检测新型冠状病毒,该方法仅需30 m i n即可完成检测,通过肉眼判读结果,无须精密仪器,且灵敏度可达80c o p y/μL㊂此外,L AM P还可以和荧光检测[10]㊁微流控[11]等技术结合用于检测新型冠状病毒㊂这些方法的建立为新型冠状病毒快速㊁准确㊁高效地检测提供了新的思路,也为疫情防控做出了重大贡献㊂2.2 L AM P技术在结核分枝杆菌检测中的应用结核分枝杆菌是引起结核病的病原菌㊂2020年世界卫生组织(WHO)报告显示,我国结核感染人数位居世界第3位[12]㊂早期诊断并给予恰当的治疗是控制结核病传播的关键,因此,临床迫切需要寻找一种快速㊁准确㊁简单的检测方法㊂L AM P能在60~65ħ的条件下对结核分枝杆菌进行快速检测,1h即可完成试验[13]㊂贾枫等[14]通过临床试验对比了抗酸染色法㊁L AM P法和改良罗氏培养法检测痰标本中结核分枝杆菌的阳性率㊁灵敏度和特异度㊂结果表明L AM P法在结核分枝杆菌的诊断中具有快速㊁灵敏等优点㊂此外,L AM P对于一些罕见的肺外结核病的诊断也具有很高的价值㊂K H A N 等[15]以m p t64和p s t S1为靶点,建立了多靶点L AM P检测骨关节结核患者结核分枝杆菌的方法,结果表明多靶点L AM P在骨关节结核总病例中的灵敏度显著高于多重P C R和G e n e X p e r t㊂S H A R MA 等[16]采用I S6110和M P B64靶点对35例临床疑似胃肠道结核患者的回盲活检标本和30例非结核对照者的回盲活检标本进行结核分枝杆菌复合体L AM P检测㊂结果表明,L AM P检测胃肠道结核分枝杆菌的灵敏度明显高于I S6110P C R和培养法㊂此外,在结核病的诊断方面,仍有大量基于L AM P的新技术不断被开发出来㊂如将L AM P技术与基于纳米颗粒的侧流装置(L F D)[17]及微流控芯片[18]等技术的联合应用㊂由此可见L AM P在结核病的诊断发面也有广阔的前景㊂2.3 L AM P技术在沙门菌检测中的应用沙门菌是全球最主要的食源性致病菌㊂若误食含有沙门菌的食物可导致食物中毒,严重者会引发肠胃炎㊁败血症等症状,若不及时就医甚至会危及生命㊂因此该菌被世界卫生组织(WHO)列为具有中等乃至严重危害的食源性病原菌[19]㊂目前临床上主要通过传统的实验室方法在标本中检测沙门菌㊂但这些传统的实验室方法操作复杂㊁耗时较长,需要3d以上才能通过多个分析步骤获得结果㊂近年来,随着核酸检测技术的不断发展与完善,许多基于核酸扩增的技术已经被广泛使用,如P C R㊁实时P C R等,这些方法均能将检测时间缩短到3d以内[20]㊂其中P C R虽然灵敏度高,但需要配备训练有素的人员和复杂的热循环仪,这使得其难以在设备不足的实验室和资源匮乏的现场环境中应用㊂而L AM P作为一种新型的核酸扩增技术,在病原微生物的检测方面有其独特的优势㊂自2005年L AM P被应用于沙门菌的检测之后,已经开发出数十种基于L AM P的沙门菌检测方法,这给临床早期诊断沙门菌感染带来了新的希望㊂近年来,随着对L AM P技术的深入研究,大量的商业试剂盒被用于沙门菌的快速检测[21]㊂此外,还有一些基于L AM P的新技术被开发出来㊂试纸条作为一种简单㊁快速的检测方法,常与L AM P技术结合用于现场快速检测,朱传新等[22]建立了环介导核酸恒温扩增结合试纸条(L AM P-L F D)检测技术用于沙门菌的快速检测,30m i n内即可完成检测,其灵敏度与P C R相当,为10c o p y/μL㊂D R A Z等[23]将L AM P与酶联免疫吸附试验(E L I S A)联合用于检测沙门菌D型血清型菌株,检测灵敏度为1ˑ103C F U/m L,比P C R-E L I S A的灵敏度高10倍㊂D R A Z等[23]将L AM P与表面增强拉曼技术联合用于检测肠炎沙门菌,其灵敏度比常规P C R高10倍,达到了66C F U/m L㊂与P C R相比,L AM P不仅快速㊁简单,而且具有高灵敏度㊁高特异度等优点,因此, L AM P技术具有替代传统方法检测沙门菌的潜力㊂2.4 L AM P技术在金黄色葡萄球菌检测中的应用金黄色葡萄球菌是一种常见的机会致病菌,当机体免疫力降低时,它可以迁移到其他组织或器官造成感染,严重者甚至出现菌血症,具有较高的致死率㊂目前临床上金黄色葡萄球菌的常规检测方法是微生物培养法,这种方法虽然具有较高的灵敏度和准确性,但检测过程烦琐㊁耗时较长[24]㊂很多患者因此错过了最佳治疗期㊂因此,开发一种快速㊁可靠的检测方法来检测金黄色葡萄球菌是临床上迫切需要的㊂近年来,越来越多的分子诊断技术被用于病原微生物的分类鉴定,与培养法相比,分子诊断技术具有快速㊁准确㊁灵敏等优点,常见的分子诊断技术有P C R㊁重组酶聚合酶扩增技术(R P A)㊁L AM P等㊂其中P C R在金黄色葡萄球菌的临床标本检测中具有较高的准确率[25],然而,由于需要昂贵的设备和熟练的操作人员,P C R在资源匮乏地区的应用受到一定的限制㊂L AM P作为一种恒温扩增法,无须昂贵的设备和复杂的操作步骤㊂WU等[3]开发了一种基于L AM P 的可视化检测法,通过使用比色指示剂羟基萘酚蓝目视检测金黄色葡萄球菌,结果表明L AM P的检测限为每反应8c o p y或每反应400C F U㊂与常规P C R相比,L AM P将检测限降低至1/10㊂邹作成等[26]也设㊃5001㊃检验医学与临床2024年4月第21卷第7期 L a b M e d C l i n,A p r i l2024,V o l.21,N o.7计了基于n u c基因的L AM P可视化检测法,该方法的检测限可达5.6ˑ101C F U/m L,其灵敏度比常规P C R高出10000倍㊂L I M等[27]以金黄色葡萄球菌的s p a和a r c C基因为靶标,将L AM P与P C R对比,结果表明二者的特异度㊁阳性预测值和阴性预测值完全一致,L AM P的检测限为2.5n g/μL或1ˑ102 C F U/m L,而P C R的检测限为12.5n g/μL或1ˑ103 C F U/m L㊂由此可见,在检测金黄色葡萄球菌方面,与P C R相比,L AM P不仅具有同样的特异度和准确率,而且检测时间更短,灵敏度更高㊂因此L AM P是一种很有前途的快速检测金黄色葡萄球菌的方法㊂2.5 L AM P技术在乙型肝炎病毒(H B V)检测中的应用 H B V是一种环状部分双链D N A病毒,主要通过血液传播,由于H B V感染早期没有任何症状,且感染者血液内缺乏乙型肝炎表面抗原,H B V-D N A含量较低,因此很难在早期检测到H B V感染㊂E L I S A和实时定量P C R是目前临床检测H B V最常用的方法[28],然而E L I S A诊断乙型肝炎的灵敏度非常低[29],实时定量P C R作为E L I S A的替代方法,其灵敏度较高,但它对实验设备和环境要求也很高[30],在资源不足的情况下很难满足,因此,需要开发出一种快速㊁灵敏㊁特异㊁易于使用的H B V检测方法㊂C H E N等[31]通过使用L AM P检测H B V,该方法可以不用提取D N A直接检测血液中的H B V,其灵敏度为每反应10c o p y,与P C R相当㊂C HE N等[32]设计了一种L AM P与基于纳米颗粒的LF D用于临床上H B V的检测,在60m i n内即可完成结果的读取,其灵敏度为每反应7.5I U㊂MA I T Y等[33]同样将L AM P与L F D结合用于检测H B V,结果表明H B V-L AM P-L F D法检测H B V的灵敏度为92%,特异度为100%,检测限低至500p g/μL㊂为了更好地评估L AM P对H B V诊断的准确性,C H E N等[34]通过检索E m b a s e㊁C o c h r a n e L i b r a r y和P u b M e d数据库中使用L AM P检测H B V的研究,然后使用Q U A D A S-2工具提取数据并评估文献质量,分析发现L AM P检测H B V的灵敏度和特异度分别为0.91和0.97,阳性似然比㊁阴性似然比㊁诊断优势比分别为16.93㊁0.08和397.57㊂由此可见,与P C R相比,L AM P是一种简便㊁快速㊁有效的检测H B V的方法㊂因此, L AM P可以取代其他方法用于临床诊断H B V感染㊂2.6 L AM P技术在华支睾吸虫检测中的应用华支睾吸虫又称肝吸虫,是临床上常见的一种人类寄生虫,主要流行于中国㊁韩国和越南等国家[35]㊂感染早期无明显症状,随着病情的发展,患者会出现腹部不适㊁黄疸㊁发热㊁呕吐和腹泻等,甚至可能引发癌变,因此华支睾吸虫被WHO的国际癌症研究机构归类为Ⅰ类生物致癌物[36]㊂华支睾吸虫的准确诊断对于患者的治疗极为重要,目前临床上主要通过涂片镜检法和血清学方法来诊断华支睾吸虫,但镜检法阳性率较低,因此轻度感染病例可能会被遗漏;而血清学方法又无法判断是既往感染还是现在感染[37]㊂虽然已经开发出了几种基于P C R的检测方法,但它们的灵敏度和特异度波动较大[38]㊂近年来,L AM P也被用于华支睾吸虫的检测,R A HMA N等[39]将L AM P用于检测从韩国的华支睾吸虫疫区采集的人粪便样品,并使用K a t o-K a t z 方法和实时P C R作为参考标准,L AM P测定显示灵敏度为97.1%(95%C I:90.1%~99.2%),特异度为100.0%(95%C I:92.9%~100.0%)㊂此外,朱海等[40]以华支睾吸虫I T S2基因为靶标成功建立了一种可用于检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的L AM P方法,该方法对华支睾吸虫成虫D N A的最低检出限可达到3.33ˑ10-4n g/μL,灵敏度和特异度与P C R法一致,均为100%,相对于P C R,L AM P不仅具有很高的灵敏度和特异度,而且操作更加简便㊁反应时间更短㊂因此,L AM P完全可以替代其他方法用于临床检测华支睾吸虫㊂3总结与展望3.1 L AM P的优势 L AM P是一种新型的恒温扩增技术,在模板㊁多条引物及链置换酶的参与下,无须温度循环即可快速完成扩增过程㊂与P C R相比, L AM P无须精密的控温装置,操作简便㊁快捷,更适用于资源条件有限的基层医院使用,在病原微生物的现场检测方面有非常广阔的前景㊂3.2 L AM P的不足近年来,L AM P技术发展迅速,但仍然面临着许多困难与挑战:(1)由于L AM P 技术灵敏度高,一旦开盖容易形成气溶胶污染,加上目前国内大多数实验室不能严格分区,假阳性问题比较严重,因此需要通过设置空白对照确定是否为假阳性,并且在实验过程中使用实时浊度仪,避免开盖导致的污染㊂(2)L AM P与其他恒温扩增法不同,它需要2对引物参与反应,因此引物设计比较复杂,有些疾病的靶基因可能不适合用L AM P方法检测㊂(3)由于L AM P技术发展时间较短,因此它的集成检测设备不够成熟㊁商品化应用有待加强㊂3.3未来展望随着L AM P技术的发展及其与多学科技术的联合创新,上述问题都将会得到解决㊂总之,L AM P技术作为一种新型核酸扩增检测技术,在现场快速检测和基层应用于诊断病原微生物感染的前景较广阔,但仍需要不断深入研究㊂参考文献[1]K E L L E R M,N A U E J,Z E N G E R L E R,e t a l.A u t o m a t e df o r e n s i c a n i m a l f a m i l y i d e n t i f i c a t i o n b y n e s t e d P C R a n dm e l t c u r v e a n a l y s i s o n a n o f f-t h e-s h e l f t h e r m o c y c l e r a u g-m e n t e d w i t h a c e n t r i f u g a l m i c r o f l u i d i c d i s k s e g m e n t[J].㊃6001㊃检验医学与临床2024年4月第21卷第7期 L a b M e d C l i n,A p r i l2024,V o l.21,N o.7P L o S O n e,2015,10(7):e0131845.[2]N O T OM I T,O K A Y AMA H,MA S U B U C H I H,e t a l.L o o p-m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n o f D N A[J].N u-c l e i c A c id s Re s,2000,28(12):e63.[3]WU C,Z E N G Y,H E Y.R a 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