毛细管电色谱：分析多环芳烃
阎超,等
电色谱被用来分离一个含16种不同多环芳烃(PAHs)的混合物。
使用的熔融硅毛细管柱内径为50-150µm，用粒径为3µm的十八烷基键合相硅胶填充20-40cm长一段柱子。
一个20kv 的电压提供一个跨30-50cm长毛细管柱的电场，产生的电渗流驱动多环芳烃通过固定相。
通过激光诱导荧光一个双内腔氩离子激光器在257nm波长处检测PAHs。
在填充柱内检测到的柱效高达400000理论塔板数/米，而通过柱的烧结端后（用来固定填充）检测得到的柱效高达150000塔板数/米。
峰保留时间的重现性小于2%（RSD）。
每个单独的PAHs的检测下限在10-17~10-20mol（10-9~10-11M）之间，
毛细管柱的电动力分离对于复杂样品提供了一个高分离度和高柱效的分析。
毛细管区带电泳(CZE)用一个开口的毛细管以及毛细管柱壁上形成的电渗流对于利用带电物质不同的电泳淌度进行分离很有效，但对于电中性物质就没有效果了。
在Terabe等人的演示中，介绍了用胶束在电解液中分离（称为胶束电动毛细管色谱 MECC）电中性物质。
这种分离是基于不带电物质在电解液和胶束间形成的假固定相中的分配实现的。
尽管容易实现，但MECC 目前缺乏选择性，而且它不能实现象高效液相色谱（HPLC）固定相中那样有效的选择性。
因此，目前MECC还不能成为实验室中实用的技术。
在1974年Pretorius, Hopkins, and Schieke第一次通过在一根填充微粒的柱上施加电场，展示了电渗流可以扮演色谱分离中泵的角色。
这项技术被称作毛细管电色谱（CEC）。
他们演示了通过电渗流推动获得了比压力推动（HPLC）更高的柱效。
CEC自从1981年由Jorgenson 和Lukacs提出，到1982年Tsuda, Nomura和Nakagawa用它来分析不能被CZE分离的电中性的芳香类化合物。
Knox和Grant指出如果能够装填超微量尺寸的填料CEC能够得到相当于毛细管气相色谱的柱效率。
他们演示了分析一些PAHs的模型，随着粒径降低到小于1.5µm 而获得的柱效增加。
近来，Smith和Evans使用一个加压电色谱系统分离确定的药物成份。
此压力系统曾经在毛细管中有了小的气泡产生，这严重影响了电色谱的分离。
除了这些例子，CEC也因为生产和填充毛细管柱的困难而受到很少的注意。
在本研究中，我们利用了阎超先生发展出的填充毛细管柱的方法并展示了CEC能被用作常规的分析。
另外，我们扩展了Nie, Dadoo和Zare通过激光激发天然荧光分析PAHs的CZE 高灵敏度的工作。
我们报告了利用CEC结合紫外、激光诱导荧光（LIF）检测器得到高柱效、高灵敏度分析16种经由美国环境保护局(EPA)提供分类的PAHs污染物。
因为毛细管分离技术非常适合分析极小体积量（<1nL），所以对于任何那些要求高分离度和高柱效并且限量的分析研究来说这个方法被认为特别有用。
结果与讨论
填充毛细管柱：
我们发现几个因素对于填充毛细管柱实现一致性很重要。
烧结头的质量对于能够获得可靠结果很重要。
烧结头过热引起柱子堵塞，造成流动相流动减少或消失。
然而不够充分的加热将使固定相颗粒从烧结头漏出。
我们尝试在第二根毛细管上增加一个Teflon内衬的烧结，再同填充柱的出口端相连。
要获得一个满意的连接是繁琐和困难的。
然而就像在实验部分所说，我们仍然集中精力制作柱上的出口烧结。
从我们的经验来看，用电动力填充柱子要比用泵来填充的效果要好。
我们用3µm的ODS颗粒（90%）中加入1µm的纯硅胶颗粒（10%）来填充柱子。
这可能使电渗流更稳定，但没有做过更深入的研究。
另外，流动相的组成，彻底地脱气防止气泡产生，并且在进样前平衡柱子这些都要引起关注。
柱效和选择性：
图1显示了16种多环芳烃的典型电色谱图并且展现了CEC的高柱效（这些峰可以通过分别与标准样品的保留时间相比较而获得鉴定）。
理论塔板数对于苊(acenaphthalene)、荧蒽(fluoranthene)和苯并荧蒽(benzo fluoranthene)，分别达到110000、120000和150000理论塔板数/米。
因为检测器窗口在出口烧结后大约1~2mm，当溶质从填料端进入无填料部分时一些峰可能发生展宽，用一根150µm内径的柱子(填充长度20cm)，在出口烧结前就做一个窗口，柱效可以提高到400000理论塔板数/米。
这种高柱效的获得，却是以检测灵敏度降低为代价的，因为光通过填充颗粒时会有过多的散射造成灵敏度降低。
图1 图2
在等度流动相的条件下，（80%乙腈4mM四硼酸钠溶液）16种成分中有15种获得了基线分离，有两种组份苊(acenaphthalene)和芴(fluoren)在这一条件下同时洗脱，当流动相中乙腈的比例变为60%时，这两个峰能够分离（见图2）。
在流动相中使用低百分比的乙腈可以大大的增加后洗脱峰的保留时间。
我们认为梯度洗脱程序可以分离这两种组份苊(acenaphthalene)和芴(fluoren)并且在总的分析时间上不会有很明显的损失。
灵敏度、线性和重现性：
一系列不同稀释度（10倍~100000倍）的标准参照混合物来测定系统的最低检测限。
在流动相中加入乙腈可以明显的增强PAHs的荧光强度，因为不同的PAHs的荧光波长差别很
大，一个很宽的波长范围(280~600nm)被用来检测荧光发射。
使用一个狭缝来防止从毛细管壁以及光电倍增管产生的背景冷光。
从熔融硅胶毛细管壁产生的冷光大于600nm（用一个单色仪检测）结果，在这一区域检测荧光波长大的PAHs更困难。
我们发现一个70nm带宽的滤镜中心在400nm波长处获得的大多数PAHs的检测限比那些宽波长（280~600nm）检测器的检测限要好。
PAHs检测限中最大的变化由PAHs在257nm处吸收值的不同以及它们不同的荧光效率量造成的。
我们相信我们检测系统的灵敏度的受限是由于流动相中的荧光背景造成的。
这一问题可以通过适当的净化过程（例如溶剂过滤）来使之影响最小化，或者在使用前对流动相进行光漂白。
PAHs峰高的再现性和检测系统荧光响应的线性也能被测量。
峰高的变化（n=3）小于5%。
苯并荧蒽(benzo fluoranthene)被选作分析模型来进行线性测量。
响应在2×10-7到2×10-11M 之间呈线性，相关系数为0.9995。
PAHs保留时间的再现性在图3显示。
这四张电色谱图显示同一根柱在一周时间的进样情况。
峰保留时间的相对标准偏差小于2%。
我们在数根其他柱上得到了同样的结果。
图3
比较CEC同微径HPLC和MECC。
CEC的柱效要比微径HPLC高，因为电渗流的柱塞状流型。
我们比较了同一根柱用电流驱动和压力驱动（内径75µm，填充柱长33cm）的柱效。
结果显示在表2。
在我们的实验条件下，用CEC得到要高75%的柱效。
Terabe等人也试图用MECC的方法分离这16种PAHs。
由于使用高浓度的表面活性剂（100mM SDS）结合环糊精和尿素，部分成分的分离度可以达到。
使用了高浓度的SDS和尿素就不能使用LIF检测器，因为太高的荧光背景。
结论：
我们演示了CEC能够有效地在实验室里获得高柱效、高选择性地分离中性分子。
它结合了毛细管电动分离的高分离度和液相色谱通用性的优点。
结合了LIF检测器系统，在PAHs 受紫外激发的天然荧光基础上检测限可以被提高。
我们相信毛细管柱的填充生产会提高成为常规方式。
这种毛细管可以允许CEC能快速发展如同CZE在过去十年中的发展经验。
