GE中低压层析柱 柱效测定方法 详解

层析柱原理和使用方法
层析柱原理是一种常用的色谱技术，可以分离复杂混合物中的各个组分。

层析柱是一个长管状结构，内部填充有吸附剂或离子交换树脂等材料。

根据组分在填料中的亲和性差异，不同组分会以不同的速度通过填料，从而实现分离。

层析柱的使用方法如下：
1. 样品预处理：将混合物中的目标组分溶解或悬浮于合适的溶剂中，并进行必要的样品处理（如pH调整、过滤等）。

2. 建立实验条件：选择合适的填料材料、填料粒径和填充方法，并确定适当的溶剂体系和流动相条件。

3. 装填填料：将选择好的填料装入柱中。

填料的打包密度和均匀性对色谱分离效果有重要影响，因此要确保填料的均匀性和紧密度。

4. 平衡柱：用流动相预浸柱，使填料均匀吸附流动相，并达到平衡状态。

平衡时间根据填料种类和样品性质而定。

5. 注射样品：将样品以适当的体积注射到柱中，并控制注射速度和压力。

6. 运行分析：启动流动相，控制流动相速度和温度，使样品组分逐渐分离，并记录结果。

7. 数据分析：根据检测器的信号，对分离出的目标组分进行定性和定量分析。

层析柱的使用注意事项：
1. 填料选择：根据被分离组分的性质选择合适的填料。

2. 流动相选择：要确保流动相对目标组分具有足够的分离能力。

3. 注射量控制：注射量应根据柱容量和检测器灵敏度进行合理
控制。

4. 柱温控制：柱温对于某些温度敏感性样品的分离效果有重要影响，可以根据需要进行柱温控制。

5. 柱保养：正确使用和保养层析柱，避免杂质吸附和填料破碎等情况的发生。

6. 数据分析：及时记录和分析实验结果，确保实验数据的准确性和可靠性。

柱效检测标准操作规程柱效检测是一种常用的质量控制方法，用于评估样品中各组分的分离效果。

为了确保检测结果准确可靠，必须按照标准的操作规程进行操作。

1. 仪器准备在进行柱效检测之前，首先要确保仪器设备的正常运行。

检查液相色谱仪的系统状态，确认其连接良好，并校准流速和温度等参数。

检查柱箱是否有足够的溶剂，确保柱温稳定。

校正检测器的波长，以确保正确的吸收峰位。

2. 样品准备样品的准备对柱效检测的结果至关重要。

首先，将样品溶解于合适的溶剂中，以获得适当的溶解度和浓度。

如果样品中存在固体颗粒，应使用滤膜对其进行过滤，以避免堵塞柱子。

还应添加内标物，以便准确测量样品中各组分的相对含量。

3. 校准标准曲线校准标准曲线是柱效检测的关键步骤之一。

准备一系列已知浓度的标准溶液，并根据不同浓度的标准溶液进行逐一检测。

根据不同浓度标准溶液的峰面积和浓度关系，绘制标准曲线。

通过标准曲线，可以计算出样品中各组分的浓度。

4. 柱子准备柱子是柱效检测的核心部分，因此必须确保柱子的良好状态。

在首次使用柱子之前，必须进行柱子的初步开孔。

然后，根据柱子的特性，在特定流速下，通过柱子进行适当的再平衡操作，以确保柱子表面的保护层充分恢复。

如果需要更换柱子，应根据仪器的规定进行操作。

5. 样品进样进行样品进样时，应根据样品的性质和含量确定进样量。

可选择恒压进样或恒体积进样方式，根据实际需求进行选择。

为了避免柱子的过载，不宜超过柱子的承载能力，同时应留出足够的空间区分样品中各组分的峰。

6. 流程优化在进行柱效检测之前，可以对流程进行优化，以提高样品分离的效果。

通过调整流速、温度和溶剂梯度等条件，在获得准确结果的同时，也可以节约分析时间和溶剂消耗。

在优化过程中，要注意避免流速过高引起的柱塞现象。

7. 检测结果处理与分析在检测结束后，要对检测结果进行处理和分析。

首先，可以通过检测器记录的色谱图进行初步分析，查看样品中各组分的峰形和峰高。

然后，可以将峰面积与标准曲线进行比较，计算出样品中各组分的相对含量。

ge层析柱
GE层析柱是生物制药领域常用的一种类固相萃取技术，由GE Healthcare开发并广泛应用于蛋白质纯化、抗体纯化和其他生物大分子的富集和纯化过程中。

GE层析柱采用高精度的工业级硅胶填充物，使得柱床具有高比表面积、大孔道体积和独特的孔隙结构，以实现良好的选择性和分离效果。

在离子交换层析中，GE层析柱利用带电荷的蛋白质和层析填料上相反电荷之间的可逆相互作用进行分离。

目标蛋白质与填料结合，洗脱条件改变时，结合的组分被洗脱下来。

通常提高盐浓度或改变pH进行洗脱，最常用盐(NaCl)梯度洗脱，目标蛋白在和填料结合时被浓缩，然后收集到纯的组分里。

操作标准目得:为了使BＰG3００层析柱装柱过程可重复,并能够得到较好得柱效,故建立此操作规范。

范围:配合ÄKTA prｏcｅsｓ系统进行有效得蛋白质纯化操作。

责任人:层析工序操作人员标准操作程序:1基本术语概念填料因子(PackｉｎｇFａｃtor, PＦ):指在在装柱过程中,用低流速(如６0ｃm/h)对填料进行沉降压缩得到得调料高度与最后装柱完成时填料高度(柱高)得比值,GＥHC生产得各种常见填料得PF参见《GEＨC ＡxiＣhroｍ300－10０0columns UseｒＭanuａl 28-95６２—89 Ｅｄiｔiｏn AＡ》;线性流速(liｎeａr flow ratｅ):单位时间内液体流经得直线距离,常用cm／h表示;体积流速(volume floｗratｅ):单位时间内液体流经得空间容积,常用ml/mｉｎ表示;换算:２准备工作2.１检查层析柱得完整性,所带配件,就是否水平(用水平仪矫正),就是否清洁(如有污染应进行清洗)、2、２确定所用填料及其特性、浓度等以DＥAE ＳｅpｈaroｓｅFast Flｏw填料为例,其填料因子(PF)为1.１５,新填料(slｕｒｒy)浓度为75％(保存于2０%乙醇中),耐压3bａｒ。

2。

3 确定放大后得工艺参数以ＸX生化制药股份有限公司得放大工艺为例,中试工艺参数:柱高h＝10ｃm;体积流速v1=3mｌ/min;柱内径d=１、６cm、即,线性流速v ２=v1/s 柱=3/(3、14×0。

82) cm/mi ｎ=1.５ cm ／min;样品与填料接触时间t ＝h ／v2=１０/1、5min ＝6。

67mi ｎ;在工艺得线性放大中h 、ｖ2与t 均不变,则可保证样品出峰得位置(洗脱时间)与形状不变、使用ＢP Ｇ３００层析柱进行放大得工艺参数:装柱体积V 柱= S 柱h=3。

1４×1、52×１L=7Ｌ;装柱需要sl ｕr ｒｙ体积V ｓｌurry =Ｖ柱×PF/C sl ｕr ｒy以ＤE ＡE Sepharo ｓe Fast F ｌow 为填料,则,V slur ｒｙ＝7×1。

柱效测定以及影响因素柱效测定（Column Efficiency Determination）是指在色谱分析中通过柱沉淀试剂的稳定迁移时间与溶质峰宽的比值来评估柱效的一种方法。

柱效是指柱对样品的分离能力，它取决于柱填充剂的形状和物理化学性质，以及流体力学特性和柱床操作参数等一系列因素。

柱效测定可以帮助分析人员评估柱的性能，并确定最佳的柱操作参数，以提高分离效果和增强分析结果的准确性。

影响柱效的因素较多，下面将对其中几个关键因素进行详细说明。

1.柱填充剂：柱的填充剂是决定柱效的关键因素之一、填充剂的表面性质、孔径大小、孔隙度以及孔道分布等特性都会对柱效产生影响。

孔径大小直接影响柱的分离能力，较小的孔径可提供更大的表面积，并且具有更好的分离效果。

孔隙度和孔道分布则决定了样品分子在柱中的扩散速度和传质能力。

因此，选择合适的填充剂是提高柱效的重要步骤。

2.面层润湿性：表面润湿性是表征柱填充剂孔道分布均匀性和表面润湿程度的重要指标。

不同样品的表面润湿性不同，一些样品在柱填充剂的表面上难以均匀分布，导致部分样品分子的扩散速度较快，使得分离能力降低。

因此，在选择填充剂时，要根据不同的液相样品，选择适合的表面润湿性，以提高柱效。

3.柱长度和内径：柱的长度和内径是影响柱效的重要参数之一、柱长度的选择与待分离的成分数目和分离程度有关，理论上，柱越长，分离程度越高。

然而，随着柱长度的增加，分析时间也会增加。

柱内径越小，柱效越高，但是流速也会减小，分析时间会延长。

因此，在实际应用中，需要根据分析要求平衡分离效果和分析时间，选择合适的柱长度和内径。

4.流速和温度：流速和温度是影响柱效的重要操作参数。

流速的选择需要平衡分离效果和分析时间。

流速过高可能会导致溶质在柱中的分离不完全，流速过低则分析时间会较长。

温度的选择与柱的填充剂和待分离的样品有关。

温度的升高可以提高溶质的扩散速度和减小粘度，有利于更好的分离效果。

但同时，温度过高也可能会引起溶解度的变化和柱填充剂的损失，影响柱效。

层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识一、实验目的和内容目的：1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法；2. 熟悉凝胶层析的一般过程；3. 了解凝胶介质的选择原则和应用领域。

内容：1. Sephadex G-50凝胶柱的装填；2. 凝胶柱柱效测定；3．凝胶再生的方法。

二、实验仪器和试剂1. 实验仪器层析柱（1×40 cm），砝码天平，玻璃棒，分部收集器，核酸蛋白质检测仪，记录仪，滴头吸管2. 实验材料和试剂Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液，5％丙酮（PBS缓冲液作为溶剂）三、实验步骤清洗层析柱测定层析柱的内径、高度，计算所需凝胶的体积根据Sephadex G-50的膨胀体积，计算所需干凝胶的质量称取相应质量的干凝胶，加入其总吸液量10倍的0.02 mol/L PBS在100℃水浴中加热溶胀1小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液（重复使用的填料，从此步开始）边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉积待沉积的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口通过2-3倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定(流速0.5～1 mL/min)始终保护凝胶上端有一段液体准备好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切沿管壁将5%丙酮溶液0.6 mL小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起（参考完成时间11：30）打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子按加样操作，用1 mL洗脱液冲洗管壁2次加入3－4 mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽将层析柱进水口连通恒流泵，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连，用两根导线将检测仪与记录仪连接起来，设置好基线的位置洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.02mol/LpH8.0的PBS，以0.5～1 mL/min流速洗脱，记录t r(记录仪纸速设为12cm/h，电压200mv；核酸蛋白监测仪检测波长254nm，灵敏度为0.1A)，计算单位高度的柱效（参考完成时间16：00）柱效计算公式：N = 5.54•［θr/( W 1/2)］2其中，θr为平均洗脱时间，W 1/2为半峰宽。

ge 层析柱
GE层析柱（GE Chromatography Column）是一种用于分离和纯化化合物的柱状装置。

层析是一种基于物质在不同相中的相互作用产生的差异来分离化合物的技术。

GE层析柱是由GE Healthcare（General Electric Healthcare）公司生产的，旨在满足生物制药和生命科学领域的分离和纯化需求。

GE层析柱通常由一个圆柱形的柱体和填充在柱体内的层析介质组成。

层析介质可以根据不同的分离目标和样品特性进行选择，常见的层析介质包括吸附剂、离子交换剂、凝胶、亲和剂等。

样品溶液通过层析柱时，由于样品和层析介质之间的相互作用不同，不同的化合物将以不同的速度通过柱体，从而实现化合物的分离和纯化。

GE层析柱具有高效、灵活、可靠的特点。

通过选择不同的层析介质和调节操作条件，可以实现高效的化合物分离和纯化。

此外，GE层析柱可以与GE Healthcare公司的其他生物分离和纯化产品（如色谱仪、蛋白质纯化系统等）进行配套使用，为用户提供全面的解决方案。

总的来说，GE层析柱是一种常用于生物制药和生命科学领域的分离和纯化设备，通过调节层析介质和操作条件，实现化合物的高效分离和纯化。

GE中低压层析柱柱效测定方法柱效测定是一项经常使用的操作，对于定量表征层析柱的工作状态是否良好，工艺的验证具有重要的意义。

但是实际工作中很多朋友都遇到不会测柱效或者测出来注销过低的状况，不知道如何解决。

所以今天我就给大家详细介绍一下柱效的正确测定方法，以及经常遇到的问题如何解决。

本方法适用于所有GE公司中低压液相色谱的预装柱及自己填装的层析柱。

介绍分为5个部分，测前准备、试剂选择、测柱效操作、测试结果积分、经常发生的问题。

1. 测前准备：⑴ÄKTA层析设备。

要求设备的型号与层析柱大小匹配，从上样阀门到紫外和电导检测器之间的体积要做到最小（管路内径尽量细，管路尽量短），这对于准确测量实验室小层析柱的柱效非常重要。

⑵测试平衡溶液及样品。

这个部分在试剂选择中单独细说。

⑶装填好的层析柱。

使用平衡缓冲液在测柱效的流速下至少平衡1.5 CV（柱体积），平衡方向与测柱效方向必须一致⑷样品环。

容积大于1%柱体积。

2. 试剂选择测柱效主要有两种测试系统：1 NaCl 测试系统；2 丙酮测试系统。

只要操作正确，两个系统测出来的结果是基本一致的。

但是要注意：各试剂的浓度不能随意改变，否则影响测试结果。

⑴NaCl测试系统对于所有种类的柱子和填料，都可以使用氯化钠系统测柱效平衡液： 0.4 M NaCl水溶液样品： 0.8 M NaCl水溶液3. 测柱效操作测柱效全程使用30 cm/h线性流速。

平衡层析柱至少1.5 CV，将1% CV的样品（NaCl或丙酮）注射进入层析柱，使用平衡液冲洗直至电导或紫外280nm出现响应峰。

4. 测试结果积分以UNICORN6版本为例演示给大家看如何操作（各UNICORN版本操作基本一致）。

以NaCl系统测柱效的所有操作针对电导曲线，以丙酮系统测柱效的所有操作针对UV 280曲线（手头没有测柱效结果，所以随便找了一个图，里面有两个峰。

大家测柱效的结果只有一个峰）1) 在Evaluation窗口中打开测柱效结果文件，在Curve窗格中点击右键，选择Customize2) 勾选复选框去掉不需要显示的曲线3)在工具栏中点击峰积分按钮，进行积分处理或者在Integrate下拉菜单中点击Peak Intergrate进行积分处理4) 选择需要积分的曲线以及积分表存储位置，基线类型默认为Calculatebaseline5) 在积分窗口中点击Peak Window，出现以下窗口，通过拖动左右两条直线可以选择需要进行积分的范围，点击OK确认6) 在积分窗口点击Reject Peaks对需要分析的色谱峰可进行高级定义，包括最小峰高、峰宽、峰面积、峰个数等，在这里最常用的是在Peakarea is less than输入需要显示的最大峰的个数，点击OK确定7) 在Column height (bed height)一栏中输入柱床高度，在柱效测定中此项必须填写8) 点击积分窗口中Save and Edit Peak Table按钮，可以对峰进行高级操作9) 点击积分窗口中的OK，查看积分结果10) 在Peak data区域点击右键，选择Customize 在Select peak table columns对话框中找到需要显示的数据， plate height（HETP）、Asymmetry 等，点击OK执行。

层析柱效测定方法层析柱效测定方法（chromatographic column efficiency determination）是一种常用的分析方法，用于评估层析柱的分离效果和分离能力。

它是基于层析柱内物质的扩散和传质过程进行分析的。

层析柱是一种分离技术装置，由一系列填充物组成。

填充物通常是固体颗粒，具有特定的化学性质，用于分离混合物中的组分。

在层析柱内，混合物通过与填充物的相互作用，使组分分离出来。

层析柱效测定方法通过评估层析柱中物质的传质速率和峰形状，来判断层析柱的性能。

这种方法可以用于评估柱的分离效果、分离能力、分离度等指标，为柱的选择和优化提供依据。

层析柱效测定方法通常基于柱内物质的扩散和传质过程进行分析。

在柱内，混合物在填充物表面发生吸附，不同组分的吸附速率不同，导致分离。

通过测定柱内物质的扩散速率，可以评估层析柱的分离效果。

层析柱效测定方法可以通过测定柱内物质的保留时间、峰宽、峰高等参数进行分析。

保留时间是指物质从进样口进入柱内到出柱的时间，峰宽是指峰的宽度，峰高是指峰的高度。

这些参数可以通过实验测定，然后根据相关理论模型进行计算和分析。

层析柱效测定方法有多种实验方法和理论模型可供选择。

常用的方法包括质量平衡法、色谱法、逆向色谱法等。

这些方法在实验操作上有所差异，但都可以用于评估层析柱的分离效果和分离能力。

层析柱效测定方法在化学、生物、医药等领域都有广泛应用。

它可以用于分析混合物中的组分，研究物质的分离和纯化，以及评估柱的性能。

同时，层析柱效测定方法还可以用于优化柱的选择和操作条件，提高分离效果和分离能力。

层析柱效测定方法是一种常用的分析方法，用于评估层析柱的分离效果和分离能力。

它基于柱内物质的扩散和传质过程进行分析，通过测定保留时间、峰宽、峰高等参数来评估柱的性能。

层析柱效测定方法在化学、生物、医药等领域都有广泛应用，为分析、研究和优化提供了重要手段。

如何测定柱效
如何测定色谱柱柱效？
不通的色谱柱有不同的测试方法，来自不同厂家的同类色谱柱也往往采用不同的测试条件，所以最好按照色谱柱说明书中的测试报告测定柱效。

一般工作站的数据处理都有自动计算柱效值的功能，若没有工作站，可由公式计算：
柱效（理论塔板数）等于保留时间与峰宽之比值的平方再乘以16，或保留时间与半峰宽之比值的平方再乘以5.54
测定柱效时，不要接保护柱，同时注意连接的管路尽可能短，以减少死体积。

自己测定的柱效是会低于出厂时测试报告给出的值，因为一般情况下，应用实验室没有专门用于测柱效的仪器。

当然，使用了一段时间的色谱柱的柱效是会下降的。

以下是Waters用于C18(C8)柱效的测定方法：
流动相：乙腈+水＝60+40
流速：1.0 mL/min
检测波长：254 nm
测试样品：2 mL丙酮，0.20 mg苊，溶于100 mL流动相中
进样体积：3.0 L。