CTAB提取液配方

CTAB法提取DNA及注意事项

0.1g菌丝体（植物新鲜组织）+ CTAB+适量石英砂研磨－→混匀－→

65℃水浴1 h－→ 冰浴10min－→ 离心取研磨液于1.5mL

离心管－→ +700μL苯酚，混匀（5~20min）－→ 离心15min(10,000r) －→取上清液三次－→ +500μL（等体积）氯仿，混匀5—10 min－→ +离心15min －→取200μL上清液2次－→ 400μL异丙醇（等体积）上下颠5次，静置15min,离心10min－→去溶液，+700μL70%乙醇－→摇晃、离心10min－→去溶液，倒扣于纸上至酒精及水分挥发完

原理及注意事项：

1、 加CTAB研磨：这一步骤是使得细胞裂解，CTAB是离子型表面活性剂能溶解细胞膜及核膜蛋白，使核蛋白解聚、DNA游离。

（注意：若是用液氮研磨，则加CTAB前需将CTAB65℃预热，因为当环境温度低于15℃时，CTAB析出，加冰冷样品前需预热。在液氮中研磨使材料易于破碎，减少酶的作用）

2、 水浴过程中每需10 min混匀一次，使样品裂解充分。

3、 加氯仿：异戊醇（24:1），使蛋白质变性、抽提液分相，核酸水溶性强，离心可除去细胞碎片及大部分蛋白质。

4、 取上清液（400微升，避免吸油层），

RNA提取（提前分装75%乙醇-DEPC及DEPC水） Trizol一步法

1. 100 mg 叶片，液氮研磨（进口2 mL 管）。

2. 加入1 mL左右（800 μL）Trizol抽提液，摇匀，静置 5 min （室温）。

3. 按每 mL Trizol提取液加入200 μL 氯仿，剧烈震荡 15 s ，室温静置5 min （3 min）。

4. 1,2000 r ,4℃离心15 min （提前将离心机调至4℃，盖上盖子，按下short键）。取400-500μL 上清液（1.5 mL进口），加入等体积（500-600μL）异丙醇，颠倒混匀，-20℃，20 min （可省）。

菌丝DNA提取

前一天： 研钵高压锅内灭菌，121℃，30mins。放于冰箱中冷冻。

早 7：30 实验室，准备好各实验药品。

试验步骤：

1) 取长满平板的培养皿，分别做好标号，对应标号标记离心管，待用；

2) 取菌丝，约1g。将菌丝转移到研钵中，倒入少量液氮，约1.5mL，迅速研磨至粉末状。如果量多可直接转入离心管；量少，则可加入少量的2×CTAB缓冲液，再转入离心管，加入量记录；

3) 向每个离心管中加入65℃，2×CTAB，（按每克菌丝加2～2.5ml缓冲液）。

4) 65℃水浴30mins。

5) 向各试管中加入等体积氯仿异戊醇，间歇振荡2mins。4℃，12000rpm，8mins。离心完，将上清液用100μL枪头，贴液面一次次轻轻抽提至一新离心管中。

6) 分别加入3μLRNase，轻轻混匀，37℃水浴1h。

7) 重复过程5。

8) 加入预冷的无水乙醇（2倍上清液的体积）。上下混匀，冰箱保存30mins或隔夜。

9) 4℃，12000rpm离心，10mins；弃上清液，记录体积。

10) 加等体积的80%乙醇，上下混匀，4℃，12000rpm，5mins，弃上清液。

11) 超净台内吹干，6个样。

12) 加TE缓冲液，20~50μL，轻弹至DNA溶解。

13) -20℃保存。

1) 取1克菌丝放入研钵，加入液氮迅速研磨成粉末，转入7 mL的离心管，加2.5mL 65℃预热的抽提液（2 %(m/v)CTAB，100m mol/L Tris-HCl PH8.0，20mmol/L EDTA PH8.0，1.4mol/L NaCl），加巯基乙醇50μl,震荡,使蛋白质变性沉淀；

2) 65℃水浴1 h，每隔10 min振荡1次，加入2.5 mL的氯仿/异戊醇(24/1)混匀，除去蛋白质；

3) 8000 rpm,4℃离心10 min,取上清；

4) 加1/5体积65 ℃预热的CTAB/NaCl混匀，加入2.5 mL的氯仿:异戊醇(24:1)混匀；

CTAB方法提取RNA

叶片RNA的提取

（1）取叶片材料两克，液氮中研磨成细粉末。

（2）每管加入10ml65℃预热的CTAB提取液和500lβ-巯基乙醇，剧烈涡旋匀浆，65℃水浴温育30min。

（3）每管加入10ml氯仿：异戊醇（24：1），涡旋混匀，冰浴10min。4℃，12000rpm离心10min。

（4）取上清，加入1∕3体积的8MLiCl和500lβ-巯基乙醇，-20℃沉淀过夜。

（5）4℃，12000rpm离心20min。

（6）弃上清，沉淀用4ml异硫氰酸胍变性液溶解，加入120lβ-巯基乙醇和880l2MNaAc(pH4.0),混匀后加入5ml的酚：氯仿：异戊醇（25：24：

1），涡旋混匀，冰浴5min。4℃，12000rpm离心10min。

（7）取上清，加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），涡旋混匀，冰浴5min。4℃，12000rpm离心10min。

（8）取上清，加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），涡旋混匀，冰浴5min。4℃，12000rpm离心10min。

（9）取上清，加入1∕10体积的3MNaAc(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置过夜。 （10）4℃，14000rpm离心20min。弃上清，沉淀用预冷的75%乙醇漂洗2次，每次洗涤后，14000rpm离心10min，弃上清。冰上干燥RNA沉淀。

（11）加入100lRNae-free-ddH2O溶解沉淀。取10l稀释200倍检测UV

λ230、260、280下的OD值，检测RNA样品的纯度与浓度。取5μg进行RNA样品的电泳检测（电泳见图1.1），以检测rRNA的完整性，其余样品加入3倍体积的无水乙醇于－70℃下保存。

改良CTAB法提取黄瓜RNA

1、叶片液氮研磨，0.05g放入2ml离心管中，加入1mlCTAB裂解液，20ulβ-巯基乙醇提取缓冲液65℃水浴30-40min。800

2、8000rpm离心5min，取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）混匀离心8min,(重复1次，2ml离心管)600 500

3、取上清，加入1/4体积的LiCl(10M),-20℃放置2-3h(1.5ml离心管).125ul

4、10000 rpm/min离心10min，沉淀用100ulDEPC-H2O溶解。

5、 溶解液中加入等体积的酸酚/氯仿/异戊醇(25:24：1)抽提（酸酚现加）涡旋混匀，12000 rpm离心10min.

6、上清液用等体积的氯仿/异戊醇（24：1）抽提1-2次，冰上放置5-10min，12000 rpm离心10min.80

7、 取上清加入1/30体积的NaAC（pH=5.2）、1/10体积的无水乙醇冰浴10min（冰箱），12000 rpm离心10min（去糖）。60

8、取上清加入1/10体积的NaAC，2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置30-40min，12000 rpm离心15min.

9、去上清，用70%乙醇洗涤2次，每次洗后10000 rpm离心3min，风干沉淀用50ulDEPC- H2O溶解（不可太干，否则难溶解）.

10、取5ul溶解的RNA用紫外分光光度计测定260nm处吸光度，并计算RNA含量，再取1-3ug用于1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。如果质量好，DNAase酶消化后超低温冰箱保存。