CTAB法提取DNA
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CTAB法提取真菌DNA
1. 离心收集样品，无菌水洗涤4次，吸干水分，液氮研磨。
2. 转移样品至含20ml 65℃预热的裂解缓冲液中, 65℃温育30min，每隔10min颠倒混匀一次。
3. 加入20ml CIA (氯仿:异戊醇=24:1)，静置2min，轻微震荡混合20min，4℃，10000rpm，10min。
4. 取上清，重复抽提一次。
5. 取上清于圆底50ml管，加入等V -20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，常温，10min，4℃，10000rpm，10min。
6. 弃上清，加入10ml 70%乙醇，洗涤沉淀两次。
7. 干燥1h。
8. 4ml TE 溶解沉淀。
9. 加入4ul RAase，37℃，1h。
10. 加入4ml CIA，静置2min，轻微震荡混合20min，4℃，10000rpm，10min。
11. 取上清，加入0.1V NaAc (3M, pH5.2)和2V 无水乙醇，-20℃，10min，4℃，10000rpm，10min。
12. 弃上清，加入5ml 70%乙醇，洗涤沉淀两次，将沉淀转入2ml EP管。
13. 干燥过夜。
14. 500ul ddH2O溶解沉淀。
15. 检测DNA的质量和浓度。
DNA提取缓冲液配制
工作液 Working Solution 存储液 Stock Solution
0.35M Glucose 34.68g 6.936g Glucose
0.1M Tris.HCl 50 mL 10.0 mL 1.0M Tris.HCl(pH 8.0)
5mM Na.EDTA 5 mL 1.0 mL 0.5M EDTA(pH 8.0)
2% PVP 10g 2g
1%(V/V)β-Me 5 mL 1.0 mL Liquid
dd Water 440 mL 88.0 mL
Total 500mL 100 mL
裂解缓冲液配制
工作液 Working Solution 存储液 Stock Solution
1.4M NaCl 40.908g 8.1816g Salt
0.1M Tris.HCl 50 mL 10 mL 1.0M Tris.HCl(pH 8.0)
20mM Na.EDTA 20 mL 4 mL 0.5M Na.EDTA(pH 8.0)
2%CTAB 10g 2g
2% PVP 10g 2g
1%(V/V)β-Me 5 mL 1.0 mL Liquid
dd Water 425 mL 85 mL
Total 500 mL 100 mL
Vd8 转化子DNA的小量提取
1. 1.5ml EP管离心（10000rpm，2min）收集菌体，约1/10V，无菌水洗涤2次，加入400ul提取液和少量石英砂，研磨仪高速研磨约4min，再次加入600ul提取液，颠倒混匀，10000rpm，5min，离心，弃上清。
2. 沉淀中加入500ul 65℃预热的裂解缓冲液，悬浮，65℃温育30min，每隔10min颠倒混匀一次。
3. 加入500ul CIA (氯仿:异戊醇=24:1)，颠倒混合50次，4℃，10000rpm，5min。
4. 取上清（约600ul），重复抽提一次。
5. 取上清（约500ul），加入0.6V（300ul） -20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，常温，10min。
6. 4℃，12000rpm，10min。
7. 弃上清，70%乙醇清洗沉淀2次，室温，干燥30min。
8. 用30ul TE溶解沉淀。
注意：1.样品收集时应避免样品间相互污染。
2.电转磨样前后都要进行酒精灼烧消毒。
3.提取过程中枪头应及时更换，防止样品间DNA污染。
所用材料为黄萎病菌经单孢分离后得到的转化子
仪器包括QIAGEN组织研磨仪，eppendorf高速控温离心机
