福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度实验报告完整版

实验Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度一、实验目的1、掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理和标准曲线的绘制。

2、掌握分光光度计的基本原理及相关操作。

二、实验原理蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质-铜复合物，与铜络合的蛋白质中所含的酪氨酸和色氨酸残基，使磷钼酸-磷钨酸（Folin-酚试剂）还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。

三、实验器材试管、刻度吸管、分光光度计、坐标纸、微量加样器四、实验试剂1、试剂A为2% Na2CO3（用0.1mol/L的NaOH配制）2、试剂B为1% CuSO4·5H2O3、试剂C为2% 酒石酸钠或酒石酸钾4、试剂D为碱性铜溶液——用50份试剂A、1份试剂B和1份试剂C混合配制而成。

混合后的溶液一日内有效。

5、Folin-酚试剂6、标准牛血清清蛋白溶液准确称取牛血清蛋白0.4 g，溶于100mL 0.9% NaCl溶液中，稀释10倍后使用。

7、0.9% NaCl溶液8、待测血清样本五、实验操作在波长650 nm比色，读取吸光度。

以1 ~ 5管蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作图得标准曲线。

画好后注明所用仪器型号、编号，所用波长，比色杯内径，标准蛋白的种类及浓度，测定方法及制作日期。

根据第7管吸光度，由标准曲线找出其对应的浓度。

并将样品的浓度单位换算成蛋白质(g)/100mL 血清。

六、注意事项1、在用碱性铜溶液处理后，蛋白质发色能力增加3 ~ 15 倍。

加铜处理对酪氨酸与色氨酸的发色能力的影响较小，本法所显颜色有1/4来源于双缩脲反应。

2、检样内蛋白质的含量应在300 ug/mL 以内，浓度如超出这个范围，反应不呈线性关系。

3、发色反应在30 min内即接近极限，在0.5 h至1 h内颜色略有增加，在1.5 ~ 6 h内颜色稳定不变，因此，最好在发色后1.5 ~ 6 h内比色。

生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称Folin-酚试剂法测定蛋白质含量实验日期实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1.掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其实验操作技术。

2.掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。

二、实验原理1.双缩脲反应在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。

2.Folin-酚显色反应蛋白质- Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。

3.在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量，即可根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。

三、材料与方法：1.材料：①样品：健康人血清（300倍稀释）；正常人血清蛋白质含量：60~80 g/L②试剂：牛血清白蛋白标准液（200μg/ml）；碱性硫酸铜溶液（当日有效）；Folin-酚试剂③仪器与器材：V-1100分光光度计；恒温水浴箱；试管6支、试管架；加样枪、加样枪架；坐标纸试剂 1 2 3 4 5 6 牛血清白蛋白标准液- 0.2 0.4 0.6 0.8 - 样品液（稀释300倍）- - - - - 0.5 蒸馏水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.5 碱性硫酸铜 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 蛋白质浓度（μg/ml）0 40 60 80 160 未知四、结果与讨论：①结果：经三次重复测量后，得最终结果如下表和图：1 2 3 4 5 6C（μg/ml）0 40 80 120 160 未知A（吸光度）0 0.134 0.289 0.348 0.458 0.403根据表格和标准曲线可得，因为未知血清的吸光度为0.403，在标准曲线上可以的其稀释后的蛋白质浓度约为：138μg/ml故血清的蛋白质浓度C为：138×300×2=82800（μg/ml），即为:8.28（g/L)②讨论：A.本次试验中操作难度在于加样的时候，因为Lowry反应的显色随时间不断加深，所以在加样的时候要严格控制时间，我们组在加样的时候，先将牛血清和蒸馏水加完，再通过手机控制时间加入后面的试剂，操作过程可能出现过一些小的失误，但总体上还是比较合格的。

生化实验报告福林-酚试剂法测定蛋白质的浓度实验目的：利用福林-酚试剂法测定蛋白质的浓度。

实验原理：福林-酚试剂法是一种常用的蛋白质定量方法。

该方法利用在碱性条件下，蛋白质和福林-酚试剂在高温下反应生成可溶性淡红色复合物，其最大吸收峰位于560 nm。

该复合物的吸光度与蛋白质的浓度呈线性关系，可以通过比较不同浓度蛋白质标准溶液的吸光度来测定待测蛋白质的浓度。

实验步骤：1. 准备蛋白质标准溶液：称取不同浓度的蛋白质标准溶液（如1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL等）分别加入福林-酚试剂，使得最终浓度为0.2 mg/mL，并用称重瓶搅拌均匀。

2. 制备待测蛋白质样品：将待测蛋白质样品溶解在适量的缓冲液中，使其浓度在标准曲线的线性范围内。

3. 加入福林-酚试剂：取相同体积的蛋白质标准溶液和待测蛋白质样品分别加入福林-酚试剂，并用试管架将其放入预热至60°C的水浴中反应15分钟。

4. 冷却：将试管从水浴中取出，放置到冰水中冷却至室温。

5. 测定吸光度：使用分光光度计将各个标准溶液和待测样品的吸光度分别置于560 nm处测量。

6. 建立标准曲线：依次将标准溶液的吸光度值绘制于纵轴，浓度值绘制于横轴，得到标准曲线。

7. 测定样品浓度：根据待测样品的吸光度值和标准曲线，确定其蛋白质浓度。

实验注意事项：1. 确保福林-酚试剂无色，否则应更换新的试剂。

2. 需要在60°C的水浴或恒温器中对试剂进行反应，确保反应温度稳定。

3. 温度过高或过低都会影响测定的准确性，应控制好试管在水浴中的时间。

4. 标准曲线的制备需要使用不同浓度的标准溶液，并且至少应包含一组空白对照组。

5. 测定待测样品时，应确保其在线性范围内，并尽量重复测定。

实验结果：根据实验步骤中的吸光度测定值和标准曲线的关系，可以得到样品中蛋白质的浓度。

实验结论：利用福林-酚试剂法可以测定蛋白质的浓度。

该方法简单、快速、灵敏度高，适用于常规蛋白质浓度的测定。

Folin- 酚试剂法测定蛋白质含量实验目的掌握Folin- 酚试剂法测定蛋白质含量的原理、操作技术掌握制作标准曲线的要领，并通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量。

提高在严格时间限定下的实验操作能力。

二、实验原理蛋白质分子中酪氨酸可以和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸- 磷钼酸）起蓝色反应，此法由folin 在1921 年开创。

1951年，Lowry 对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。

第一步：双缩脲反应在碱性溶液中,双缩脲（H2NOC－NH－CONH2能）与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物。

即在碱性溶液中，蛋白质分子中的具有双缩脲结构的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+ 作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。

第二步：Folin- 酚显色反应Folin- 酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐- 磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。

蛋白质- Cu2+复合物中所含的带酚羟基的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。

在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比较即可求出样品中蛋白质的含量。

三、实验材料（一）样品健康人血清（300倍稀释，正常人血清蛋白质含量：60~80 g/L ）（二）试剂牛血清白蛋白标准液（200μg/ml ），碱性硫酸铜溶液，Folin- 酚试剂（三）仪器与器材V-1100分光光度计，恒温水浴箱，移液管（2mL），洗耳球，试管6 支，试管架，加样枪，加样枪架四、实验步骤（一）操作步骤见表1-1表1-1 folin- 酚试剂法定量蛋白质实验步骤重复测三次，求平均值用于绘制标准曲线。

二）注意事项1.操作控制：folin- 酚试剂加到碱性铜- 蛋白质溶液中后，必须立即混匀，使还原反应发生在磷钼酸- 磷钨酸被破坏之前2.时间控制：因反应显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。

蛋白质的定量测定――福林酚法(Folin―酚试剂法)实验原理Folin—酚试剂法最早是由Lowry确定的测定蛋白质浓度的基本方法。

以后在生物化学领域得到广泛的应用。

此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

这个方法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时较长，要严格控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。

凡干扰双缩脲反应的基团，如 -CO-NH2, -CH2-NH2, CS-NH2以及Tris缓冲液、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物均可干扰Folin—酚反应，而且对后者的影响还要大得多。

此外，酚类、柠檬酸对此反应也有干扰作用。

Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。

甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。

蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。

乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。

此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。

此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。

本法可测定范围是25—250μg蛋白质。

试剂和器材一、试剂Folin—酚试剂:试剂甲：1) 4%碳酸钠溶液2) 0.2mol/L氢氧化钠溶液3) 1%硫酸铜溶液4) 2%酒石酸钾钠溶液。

临用前将（1）与（2）等体积配制碳酸钠—氢氧化钠溶液。

（3）与（4）等体积配制成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。

然后这两种试剂按50:1的比例配合，即成Folin—酚试剂甲。

此试剂临用前配制，一天内有效。

试剂乙：称钨酸钠（Na2WO2?2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4?2H2O）25g置2000mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL，85%磷酸50mL和浓硫酸100mL。

充分混匀，使其溶解。

小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50mL及液溴数滴。

实验三：福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度一、实验目的1．学会制备无蛋白血滤液。

2．掌握Folin－Wu法测定血糖含量的原理和方法。

3．掌握7200型可见分光光度计的使用方法。

二,实验原理蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。

蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。

三.实验仪器1．试管2．移液管3．卵清蛋白片4．7220分光光度计四.实验试剂1、碱性硫酸铜溶液A液：无水碳酸钠35g，酒石酸钠13g及碳酸氢钠11g溶于蒸馏水，稀释定容至1000ml.B液：硫酸铜晶体5g，溶于蒸馏水并定容至100ml。

临用时，A液：B液=9：1混合（体积比），混合液于冰箱中保存（4℃）。

2、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）(1)1%葡萄糖母液：称取1.000g葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml。

(2)葡萄糖标准液：取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。

3、10%钨酸钠溶液：称取钨酸钠10g，溶于蒸馏水并定容至100毫升。

4、0.33mol/LH2SO4溶液：于53ml蒸馏水中加入1ml的浓硫酸。

五.实验步骤1、无蛋白血滤液的制备：用奥氏吸管吸取全血（已加抗凝剂）1ml,缓缓放入100ml锥形瓶中，加蒸馏水7ml，摇匀，溶血后（血液变为红色透明）加10%钨酸钠1ml，摇匀.。

再加0.33mol/L H2SO41ml，边加边摇，加毕充分摇匀，放置5～15分钟，至沉淀变为暗棕色（如不变色可再加0.33mol/L H2SO41-2滴）。

用干滤纸过滤。

先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液不清需重新过滤。

每毫升无蛋白血滤液相当于1/10ml全血。

2、血糖的定量测定：取25ml的血糖管3支，编号。

第一支血糖管中加入2ml蒸馏水（空白管）；第二支血糖管中加2ml标准葡萄糖液；用吸管吸取无蛋白血滤液2ml，放入第三支血糖管中。

Folin-酚试剂法测定蛋白质浓度高熹 168615140001一、实验目的熟悉并掌握Folin-酚法测定蛋白质浓度的原理和方法。

二、实验原理蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比，能用比色法测定蛋白质的浓度。

此法也适用于酪氨酸或色氨酸的定量测定。

三、实验器材1、紫外可见分光光度计2、试管3、移液枪4、恒温水浴锅四、实验试剂1、Folin-酚试剂A：取Na2CO31g溶于50ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中。

另取CuSO4·5H2O晶体0.5g，溶于100ml1%酒石酸钾100ml中。

将前者50ml与硫酸铜-酒石酸钾溶液1ml混合。

混合后溶液一日内有效。

2、Folin-酚试剂B：将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml蒸馏水、50ml85%磷酸继100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏10小时，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。

冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。

临用时，用1mol/l的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。

3、标准酪蛋白：500ug/ml4、稀释200倍的血清六、结果分析对1-6号进行线性回归分析，作图如下：三组样品的测量值分别为0.228、0.217和0.249，由于0.249偏差过大，则取0.228与0.217的平均0.223，则y=0.223时，x=0.323，即0.4ml稀释200倍的血清溶液中蛋白含量与0.323ml的500ug/ml标准酪蛋白相等。

则血清中蛋白含量为：500*0.323/0.4*200ug/ml=80750ug/ml。

七、实验反思第三组样品测量值偏差过大，考虑为未完全摇匀，以后实验要注意操作步骤及操作规范。

蛋白质浓度测定（Folin-酚法）
实验目的：
熟悉并掌握福林-酚法测定蛋白质浓度的原理和方法。

实验原理：
蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比，可用比色法测定蛋白质浓度。

实验器材：
样品血清（稀释200倍）
标准酪蛋白溶液（200ug/ml）
Folin-酚甲液：
A 4%Na2CO3：0.2mol/lNaOH=1:1
B 1%CuSO4:2%酒石酸钾钠=1:1
A:B=50:1 混匀
Folin-酚乙液
可见分光光度计、试管（9支）、移液枪、移液管、烧杯、希尔球。

实验步骤：
1、将九支试管洗净晾干并标号，按照下表内容依次按顺序加入试剂。

2、用可见分光光度计以1号试管溶液为空白测量九个试管溶液在640nm处的吸
光度。

3、以蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

4、由样品吸光度在标准曲线中找出样品浓度。

实验结果：
标准曲线：
样品平均吸光度=0.286
由标准曲线得酪蛋白样品浓度为107.04ug/ml
总结分析：
从实验结果数据分析，本次实验结果并不理想，主要问题为标准曲线线性关系不好，部分数据偏离较大，血清样品的三组平行也存在较大方差。

由实验结果可以看出，应该是溶液配制出现问题导致标准曲线线性关系较差。

经分析应该为添加试剂时移液枪操作不当导致配得溶液浓度不准，移液枪活塞有卡顿现象，添加试剂时可能会未按到底导致试剂添加量不准。

福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度一、原理蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。

蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。

二、实验仪器分光光度计,试管,移液管,容量瓶，分析天平，烧杯三、实验试剂1.Folin-酚试剂甲：碱性铜溶液甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中乙液：取CuSO4.5H2O晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100ml。

临用时按甲：乙=50：1混合使用。

2.Folin-酚试剂乙：将10g钨酸钠、2.5g钼酸钠、70ml蒸馏水、5ml85%磷酸继10ml浓盐酸置于150ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏1小时，再加入硫酸锂15g，蒸馏水5ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。

冷却，稀释至100ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。

临用时，用1mol/l的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。

标准蛋白质溶液：称取1g牛（人）血清蛋白片溶于0.9%氯化钠溶液中，并稀释至1000ml四、实验步骤1.标准曲线的绘制取7支干燥洁净的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。

各管加入1mlFo1in 酚试剂乙后，立即摇匀，放置15分钟后比色，在500nm 处记下各管光密度，以0号管为对照，以吸光度为纵坐标，标准蛋白质溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线2.样品测定准确吸取样液于干燥的试管中，同样按下表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。

室温放置10分钟后，再各加1毫升Fo1in 酚试剂乙，立即摇匀，放置15分钟，在500nm 处测定光密度值。

五、实验结果管号试剂 1 2样液（ml ） 1.0 1.0Folin-酚试剂甲 5.0 5.0（ml ）标准曲线的绘制：蛋白质浓度0.00 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 吸光度0.000 0.079 0.215 0.264 0.346 0.450 0.493则根据y=5.5072x=0.325得x为0.05901，则样液的浓度为0.5901mg/ml.六、实验结果分析及思考1、试说明Folin-酚法的优缺点该方法较双缩脲法反应灵敏，与0.1mg/ml浓度的蛋白质样品亦可得到很好的显色反应，使用很广泛，但花费时间长，其干扰因素较多。

1. 理解福林酚法测定蛋白质浓度的原理。

2. 掌握福林酚试剂的配制方法。

3. 学习使用分光光度计进行蛋白质定量分析。

4. 通过实验，提高实验操作技能和数据分析能力。

二、实验原理福林酚法是一种常用的蛋白质定量分析方法。

其原理基于蛋白质中的酪氨酸和色氨酸在碱性条件下与福林酚试剂反应，生成蓝色的复合物。

该复合物的颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，通过比色法可以测定蛋白质的浓度。

三、实验材料1. 标准蛋白质溶液（已知浓度）2. 待测蛋白质溶液3. 福林酚试剂4. 碱性铜试剂5. 0.1mol/L NaOH溶液6. 0.85mol/L H2SO4溶液7. 10% TCA溶液8. 1%牛血清白蛋白溶液9. 7200型可见分光光度计10. 移液器11. 试管12. 烧杯13. 移液管14. 实验记录表格1. 福林酚试剂的配制a. 称取10g钨酸钠、2.5g钼酸钠，加入70ml蒸馏水。

b. 加入5ml 85%磷酸和10ml浓盐酸，充分混匀。

c. 将混合溶液转移至150ml磨口圆底烧瓶中，接上磨口冷凝管，回馏1小时。

d. 加入15g硫酸锂和5ml蒸馏水，混匀。

2. 蛋白质样品的处理a. 取0.1ml标准蛋白质溶液，加入1.9ml 0.1mol/L NaOH溶液，混匀。

b. 取0.1ml待测蛋白质溶液，加入1.9ml 0.1mol/L NaOH溶液，混匀。

c. 将混合溶液转移至试管中，加入0.5ml福林酚试剂，混匀。

d. 室温下放置5分钟。

3. 碱性铜试剂的加入a. 取0.5ml碱性铜试剂，加入上述混合溶液中，混匀。

b. 室温下放置10分钟。

4. 比色测定a. 使用7200型可见分光光度计，在660nm波长下，测定样品的吸光度。

b. 以1%牛血清白蛋白溶液为空白对照，进行校正。

5. 结果计算a. 根据标准蛋白质溶液的吸光度，绘制标准曲线。

b. 根据待测蛋白质溶液的吸光度，从标准曲线上查得蛋白质浓度。

五、实验结果与分析1. 标准曲线的绘制：以标准蛋白质溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

folin酚试剂法测定蛋白浓度实验报告一、实验目的蛋白质是生命活动的主要承担者，其含量的测定在生物化学、临床医学、食品科学等领域具有重要意义。

本实验旨在掌握 Folin 酚试剂法测定蛋白质浓度的原理和操作方法，并通过实验数据计算样品中的蛋白质浓度。

二、实验原理Folin 酚试剂法是利用蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基能还原 Folin 酚试剂（磷钼酸磷钨酸），生成蓝色化合物的原理来测定蛋白质的浓度。

该蓝色化合物在一定条件下的吸光度与蛋白质浓度成正比，通过测定吸光度并绘制标准曲线，即可计算出样品中蛋白质的浓度。

三、实验材料与仪器1、实验材料（1）标准蛋白质溶液：牛血清白蛋白（BSA），浓度为 1mg/mL。

（2）样品溶液：待测定蛋白质浓度的溶液。

（3）Folin 酚试剂甲液：由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成。

（4）Folin 酚试剂乙液：由磷钼酸、磷钨酸和蒸馏水组成。

2、实验仪器（1）分光光度计（2）移液器（3）容量瓶（4）试管（5）恒温水浴锅四、实验步骤1、标准曲线的绘制（1）取 6 支干净的试管，分别编号为 0、1、2、3、4、5。

（2）按表 1 向各试管中加入标准蛋白质溶液和蒸馏水。

表 1 标准曲线绘制的加样量｜试管编号｜ 0 ｜ 1 ｜ 2 ｜ 3 ｜ 4 ｜ 5 ｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜标准蛋白质溶液（mL）｜ 0 ｜ 02 ｜ 04 ｜ 06 ｜ 08 ｜ 10 ｜｜蒸馏水（mL）｜ 10 ｜ 08 ｜ 06 ｜ 04 ｜ 02 ｜ 0 ｜（3）向各试管中加入 5mL Folin 酚试剂甲液，摇匀，于室温下放置10 分钟。

（4）再向各试管中加入 05mL Folin 酚试剂乙液，立即摇匀，于 50℃恒温水浴锅中保温 30 分钟。

（5）以 0 号试管为空白对照，在分光光度计上于 650nm 波长处测定各试管溶液的吸光度（A）。

（6）以蛋白质浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线。

folin酚法测定蛋白质含量Folin-酚法是一种测定蛋白质含量的经典方法，其历史可以追溯到1948年。

此方法的基本原理是酚类物质在碱性条件下与蛋白质反应，生成一种深蓝色的复合物，该复合物在760nm处的吸光度与蛋白质浓度成正比，因此可以通过测定吸光度来计算蛋白质浓度。

以下是Folin-酚法测定蛋白质含量的详细步骤：一、实验准备1.实验材料：o待测样品（蛋白质溶液）o Na2CO3o NaHCO3o硫酸铜o酒石酸钾钠o氯仿o无水乙醇o磷酸二氢钾o氢氧化钠2.实验设备：o分光光度计o研钵或电动搅拌器o漏斗和滤纸o玻璃试管和试管架o移液管o搅拌棒二、实验步骤3.准备Folin-酚试剂：将10g的酒石酸钾钠与50g的Na2CO3、NaHCO3混合在研钵中，充分研磨后转移至烧杯中，加入80ml的蒸馏水，搅拌至溶解。

将溶液煮沸并保持1分钟，然后冷却至室温。

将混合物转移至1L容量瓶中，用蒸馏水定容至1L。

4.取1ml待测蛋白质溶液（约0.01-1mg蛋白质）加入到试管中。

5.向试管中加入5ml Folin-酚试剂，混匀。

6.将混合物在室温下保持30分钟，期间不时搅拌。

7.在760nm波长下，用分光光度计测定混合物的吸光度。

为了获得更准确的结果，可以以蒸馏水为空白对照调零。

8.根据标准曲线计算蛋白质浓度。

可以通过绘制已知蛋白质浓度与其对应的吸光度的曲线图来制作标准曲线。

根据待测样品的吸光度，可以在曲线上找到对应的蛋白质浓度。

9.根据需要，可以进一步计算蛋白质的含量（mg/mL或mg/g）。

三、注意事项和局限性1.Folin-酚法对碱性环境非常敏感，如果在试剂准备和混合过程中出现不慎或操作不当，可能会影响到最终的测定结果。

因此，操作者需要熟练和准确的掌握该方法的操作步骤。

2.本方法不适用于测定含有大量酚类物质或还原性物质的样品，这些物质可能会干扰蛋白质与Folin-酚试剂的反应，导致结果偏差。

3.一些蛋白质的氨基酸序列中含有酪氨酸或色氨酸残基，这些残基可以与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，导致吸光度偏高，最终结果可能偏高也可能偏低。