脂肪酶的分离纯化

脂肪酶的概述与应用一脂肪酶概述、脂肪酶（Lipase，甘油酯水解酶）隶属于羧基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。

脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物（如霉菌、细菌等）组织中。

包括磷酸酯酶、固醇酶和羧酸酯酶。

脂肪酸广泛的应用于食品、药品、皮革、日用化工等方面脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。

植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。

脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；Schmid）。

脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。

脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。

迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同（Veeraragavan等）。

总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，对底物有特异性（Schmid等；Kazlauskas等）。

脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda和Desnnelv 就发现了这一现象。

溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。

这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征。

酯酶（E C3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸（≤C8）形成的酯。

酶的分离提纯实验原理酶的分离提纯是指从复杂的混合物中获得纯净的酶样品的过程。

此过程旨在去除其他杂质，并提高酶的比活性和纯度。

酶的分离提纯实验原理可以分为以下几个方面：1. 根据酶的生理特性进行分离：酶的分离可依据酶对pH值、温度、离子浓度、底物特异性等因素的敏感性进行。

常用分离方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、电泳等。

2. 分离的物理性质利用：酶可根据其分子大小、电荷、溶解度等物理性质进行分离。

例如，凝胶过滤层析通过选用合适的孔径筛选凝胶，使大分子酶无法进入凝胶孔隙，进而实现分离。

3. 分离的化学性质利用：酶可通过与其他物质的特异性相互作用来实现分离。

亲和层析是一种常用的方法，利用酶与某些配体（如某种金属离子、亲合剂等）的特异性结合来分离酶。

在实验中，通常采用以下步骤进行酶的分离提纯：1. 细胞破碎：从生物体中获得酶源，如细胞、组织、分泌物等。

通常使用超声波破碎、搅拌破碎、离心等方法破碎细胞，并保持样品低温以防止酶的失活。

2. 酶提取：将破碎的细胞溶液用适当的缓冲液进行提取，并添加必要的辅助物质（如阻聚剂、金属离子等）以保持酶的稳定和活性。

3. 初步分离：通常先进行粗提，包括沉淀、超滤、离心、酒精沉淀等方法，目的是将酶与其他细胞组分分离开来。

4. 层析：根据酶的物理性质或化学性质选择适当的层析方法。

离子交换层析是常用的方法之一，根据酶与离子交换基质之间的相互作用进行分离。

5. 亲和层析：利用酶与特定配体之间的结合进行分离。

例如，选择性地将酶与亲和基质（如亲和剂或金属离子）结合，然后利用特定条件（如改变pH值或添加竞争性配体）来解离酶。

6. 离心和浓缩：通过离心和浓缩等操作，将目标酶进一步分离和提纯。

7. 再结晶：通过结晶或沉淀等方法进行酶的最终纯化。

8. 活性测定和纯度检验：测定酶的比活性，评估酶的纯度和活性。

总之，酶的分离提纯实验原理基于酶对物理、化学条件的敏感性，通过适当的分离方法和步骤，去除杂质，提高酶的纯度和比活性。

黑曲霉脂肪酶的分离纯化（1）背景简介：脂肪酶全称为三酰基甘油水解酶，是一类能够将长链脂肪酸甘油酯水解成脂肪酸和二甘酯、单甘酯或甘油的生物酶。

它除了能够水解脂肪外，还具有催化酯化反应、酯交换反应、酸解反应、醇解反应以及氨解等反应的性质。

（2）理论途径：脂肪酶是蛋白质，因此大部分蛋白质的纯化方法也适用于脂肪酶。

常见的非特异性蛋白纯化方法有沉淀法、疏水层析、离子交换层析和凝胶过滤等。

文献研究以从极端生境下筛选得到的一株产脂肪酶菌株为研究对象，采用层析的方法分离纯化得到纯脂肪酶，并对其酶学性质进行了研究。

（3）具体操作流程及方法：1）利用形态分析和分子方法对产脂肪酶菌株进行鉴定，并对产酶条件进行优化；2）研究温度、pH、金属离子和蛋白酶抑制剂对粗酶活性影响；3）利用硫酸铵盐析、阴离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析等分离纯化脂肪酶；4）对纯脂肪酶进行酶学性质研究和一级结构鉴定。

（4）分离纯化具体方法及结果采用植物油1%（v/v）、酵母提取物1%（w/w）、KH2PO4 0.2%（w/w）、MgSO4 0.05%（w/w）、KCl 0.05%（w/w）等组成的培养基，接种量为1.5%（v/v）时，在28℃、180 r/m 下培养96h 后，发酵液中脂肪酶水解活性最大达到30IU/mL。

经过硫酸铵沉淀、离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析，从黑曲霉发酵液中分离纯化了脂肪酶，脂肪酶的酶活回收率为22.1%，纯化倍数为203 倍。

获得的脂肪酶在SDS- PAGE 图谱上显示为单条带，分子量约为41kDa。

酶的最适反应温度为50℃，在20-60℃内有较好的稳定性，60℃处理12h 仍残留90%的酶活；最适反应pH 为 5.0，在pH 3.0-5.0 内具有较好稳定性，pH 3.0 时处理20h 仍存有99%的酶活。

Cu2+、Ca2+对酶活有较大促进作用，而Fe2+基本使酶完全失活；多种极性较大的有机溶剂对其有激活作用。

经MALDI-TOF-MS 鉴定，该脂肪酶与黑曲霉CBS513.88 酯酶具有较高的同源性。

第37卷第5期2009年5月 化　学　工　程CHE M I CAL E NGI N EER I N G (CH I N A ) Vol .37No .5May 2009作者简介:杨建军(1973—),男,工程师,博士生,研究方向为生物催化与生物质转化,E 2mail:mysyjj@;马晓迅(1957—),男,教授,博士生导师,通讯联系人,电话:(029)88302633,E 2mail:maxy m@nwu .edu .cn 。

双水相系统分离纯化南极假丝酵母脂肪酶杨建军,马晓迅(西北大学化工学院,陕西西安　710069)摘要:对南极假丝酵母脂肪酶(CAL )在双水相中的分配情况进行了研究,考察了温度、聚乙二醇(PEG )相对分子质量、NaCl 质量分数和(NH 4)2S O 4质量分数对分配系数K (C AL )的影响,结果表明:温度对K (C AL )影响不大;低相对分子质量PEG 与蛋白质的疏水作用可促进C AL 的分配;二相间电势差等对分配平衡、有较大影响。

在PEG2000/(NH 4)2S O 4双水相体系中,CAL 最佳的萃取分离条件为:室温下,质量分数20%PEG2000,12%(NH 4)2S O 4,1.5%NaCl,此时,K (CAL )为8.16,C AL 回收率为91.2%。

关键词:脂肪酶;双水相;分离纯化中图分类号:Q 814.1 文献标识码:A 文章编号:100529954(2009)0520049204Separati on and puri fi cati on of Candida an ta rctica li pasei n aqueous two 2phase syste mYANG J i a n 2jun,M A X i a o 2xun(School of Che m ical Engineering,North west University,Xi ′an 710069,Shaanxi Pr ovince,China )Abstract:The partiti on behavi or of Candida an tarctica li pase (CAL )in aqueous t w o 2phase syste m (ATPS )was investigated .The effects of te mperature,relative molecular mass of polyethylene glycol (PEG ),the mass fracti onof NaCl and (NH 4)2S O 4on partiti on coefficient of CAL K (CAL )were studied .The results show that in ATPS,te mperature was uni m portant for partiti on coefficient of CAL K (CAL ),while the electric potential difference bet w een t op and bott om phase was i m portant .It was als o discovered that the less the molecule mass of PEG was,the more favorable conditi ons f or the CAL congregati on int o the phase because of the increased hydr ophobicity for med .A t the r oom te mperature,the op ti m ized extracti on conditi ons were as foll ows:mass fracti on 20%PEG 2000,12%(NH 4)2S O 4,1.5%NaCl,and K (CAL )was 8.16,the recovery rate of CAL was 91.2%.Key words:li pase;ATPS;purificati on 固定化脂肪酶催化酯交换反应生产生物柴油已成为近年来新能源研究的热点之一。

微生物脂肪酶的纯化方法概述摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。

脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。

本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。

关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术1.脂肪酶概述脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。

同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。

1.1脂肪酶的结构与性质在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。

研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。

其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。

与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd 不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。

脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。

在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。

此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。

1.2产脂肪酶微生物微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。

中的应用2023-11-08•酶在油脂制取中的应用•酶在油脂精炼中的应用•酶在油脂改性中的应用目录•酶在油脂工业中应用的前景•结论01酶在油脂制取中的应用脂肪酶在油脂水解中的应用脂肪酶具有高度的专一性，能够将甘油三酯分解成甘油二酯、甘油单酯和脂肪酸。

脂肪酶在油脂水解过程中具有高效性和专一性，能够提高水解产物的纯度和收率。

利用脂肪酶进行油脂水解可以获得高纯度的脂肪酸和甘油单酯等中间产物，这些中间产物在食品、化妆品、药品等领域具有广泛的应用价值。

蛋白酶在动物脂肪液化中的应用蛋白酶能够催化蛋白质的分解，在动物脂肪液化过程中，利用蛋白酶可以将动物脂肪中的胶原蛋白等蛋白质成分分解成小分子肽和氨基酸，从而提高了脂肪的流动性。

蛋白酶在动物脂肪液化中的应用可以提高脂肪的品质和口感，同时也可以提高脂肪的利用率和附加值。

淀粉酶能够将淀粉分解成低分子糖类，在植物油提取过程中，利用淀粉酶可以破坏植物细胞壁，提高油脂的提取率。

淀粉酶在植物油提取中的应用可以提高油脂的产量和品质，同时也可以提供低分子糖类副产品，具有较高的经济价值。

淀粉酶在植物油提取中的应用02酶在油脂精炼中的应用脂肪酶在油脂脱臭中的应用脂肪酶在油脂脱臭过程中具有反应条件温和、对底物专一性要求较低、能耗低等优点。

脂肪酶脱臭方法对不同来源的油脂都具有良好的适用性，如大豆油、菜籽油、葵花籽油等。

脂肪酶可有效降低或消除油脂中不良气味，提高油脂的感官品质。

通过脂肪酶催化油脂中的不饱和脂肪酸，产生具有挥发性的小分子，从而消除油脂异味。

的加工性能。

利于保留油脂中的营养成分。

脂肪酶脱胶法适用于各种植物油和动物油的脱胶处理，如大豆油、花生油、鱼油等。

脂肪酶脱色方法适用于各种植物油和动物油的脱色处理，如大豆油、花生油、橄榄油等。

在使用脂肪酶进行油脂脱色处理时，需要控制反应温度、时间以及底物浓度等因素，以达到最佳的处理效果。

脂肪酶可催化油脂中色素成分的水解，从而实现油脂的脱色。

微生物脂肪酶的纯化方法概述摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。

脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。

本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。

关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术1.脂肪酶概述脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。

同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。

1.1脂肪酶的结构与性质在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。

研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。

其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。

与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd 不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。

脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。

在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。

此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。

1.2产脂肪酶微生物微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。

脂肪酶产生菌的筛选与分离姓名：赵倩班级：12生物技术学号：12103179 摘要:近年来随着化石资源的枯竭，能源危机越演越烈，生物柴油作为可再生的绿色能源得到了人们的广泛关注。

目前用于制备生物柴油的脂肪酶Novozyme435和假丝生物柴油的脂肪酶Novozyme435和假丝酵母、无根根酶和青霉等微生物脂肪酶，还有下面即将介绍的一麻疯树油为主要原料生产生物柴油的脂肪酶。

该脂肪酶来自于一种用麻疯树油筛选出的细菌。

关键词:脂肪酶生产菌;筛选;产酶条件一、脂肪酶及其应用前景脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，它可以在油——水界面上将油脂水解成甘油和脂肪。

在微——水界面上将油脂水解成甘油和脂肪。

在微生物及动植物体内普遍存在。

目前已发现多种具有不同酶学性质和底物特异性的微生物脂肪酶，其在水解、酯化、转酯及酯类手性合成等反应中都表现出较好的应用前景。

脂肪酶广泛运用于食品加工及风味改革、油脂水解、皮革绢纺原料脱脂、化妆、洗涤、医药、能源等领域。

二、材料和方法1.1试样麻疯树种子油预处理半年以上的土壤1.2培养基及试剂富集培养基(g/L):酵母膏2g ,K2HPO41 g，MgSO4,·7H20 0.1g，(NH4)2S041.0g,NaCl 0.5 g，pH 7. 0.驯化培养基(g/L ): (NH4)2SO4, 2.0 g,K2HPO41.0 g，K2HPO41.0 g，Na2HPO41.0g，NaCl 0.5g, MgSO4,·7H20 0.5 g, pH7.0.选择性平板培养基(g/L):酵母粉0.5 g , (NH4)2SO40.5 g，KH2PO40.3 g，NaCl 0.5 g，MgSO4,·7H20 0.2g，琼脂20.0 g,pH7.0.将上述溶液灭菌冷却至60℃左右加入均质后的2%的三丁酸甘油酯溶液,用紫外灯照射灭菌30 min以上备用.种子培养基(g/L):蛋白陈10.0 g,酵母膏5g，NaCl 5.0 g.产酶培养基(g / L):大豆油5.0 g , (NH4)2SO42.0 g，MgSO4,·7H20 3.0 g，K2HPO4 1.0 g,胆汁1. 0 g.三、脂肪酶产生菌的分离取6克含经粉碎处理麻疯树种子油预处理半年以上的土壤，与40ml无菌水混合，180r/min震荡的土壤，与40ml无菌水混合，180r/min震荡 30min，取5ml上清液加到富集培养基中，与 30min，取5ml上清液加到富集培养基中，与30℃ 180r/min培养48h后取15ml转接入 30℃、180r/min培养48h后取15ml 转接入 60ml新鲜的富集培养基中，连续转接3 60ml新鲜的富集培养基中，连续转接3次。