层析分离纯化技术PPT课件
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第三章层析概论一、层析以基质为固定相(柱状或薄层状),以液体或气体为流动相,有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换作用,最终结果是使混合物得到分离。
目前,这种方法已作为纯化或鉴定各种化合物的一种重要手段。
1903年俄国植物学家茨维特首先将碳酸钙细粉装入玻璃管内使其成柱形,然后把石油醚抽提的植物色素溶液倾入,让其通过碳酸钙柱,接着用石油醚洗涤发现,各种色层彼此可分开,柱上端呈黄色,较下端呈绿色,这就是早期的吸附层析碳酸钙细粉植物色素溶液石油醚洗涤二、层析类型层析方法可根据不同的标准分成若干类型:按流动相分类:液相层析和气相层析;按固定相“床”的形式分类:柱层析、薄板(层)层析、薄膜层析等等,详见表3~1。
三、层析常用术语1.固定相固定相是由层析基质组成的。
其基质包括:固体物质(如吸附剂、离子交换剂)液体物质(如固定在纤维素或硅胶上的溶液),这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。
2.流动相在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体称为流动相。
在柱层析时,流动相又称洗脱剂或洗涤剂(即推动有效成分或杂质向一定方面移动的溶液)。
在薄层层析时,流动相又称展层剂。
3.操作容量即在特定条件下,某种成分与基质反应达到平衡时,存在于基质上的饱和容量;一般以每克(或毫升)基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。
(mmol/g, mg/g, mmol/ml, mg/ml)其数值大,表明基质对某种成分的结合力强;否则反之。
4.床体积(Vt)通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积(Vt)。
Vt是基质的外水体积(V0)和内水体积(Vi)以及自身体积(Vg)的总和,即:Vt = V0+ Vi + Vg(详见图3-1)5.外水体积(V0)外水体积指基质颗粒之间体积的总和。
6.内水体积(Vi)内水体积是指基质颗粒内部体积的总和。
7.基质体积(Vg)基质体积是指基质自身所具有的体积。
常见分离纯化技术原理---介绍离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析、分配层析和电泳原理1、离子交换层析法⏹原理:根据离子间作用力的不同而将物质分离的方法⏹离子交换剂可解离出阴离子或阳离子,当待分离的溶液中含有阳离子时可以与阳离子交换剂的阳离子交换吸附在离子交换介质上,带电量不同的物质与离子交换剂的结合力不同,解离的条件不同,可通过改变条件,促使其解离和分部收集待分离物。
Sampleapplication and wash Elution Equilibration Regeneration-------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++anion exchanger bead ----------离子交换层析步骤和发生的变化2、凝胶过滤层析技术●概念(排阻层析,分子筛层析):当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时,根据它们分子大小不同而进行分离的技术。
●原理:凝胶颗粒内部具有多孔网状结构,被分离的混合物流过层析柱时,比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内,在凝胶颗粒之间的空隙向下移动,并最先被洗脱出来;比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外,在柱内经过的路程较长移动速度较慢,最后被洗脱出来。
⏹凝胶过滤法测定相对分子量◆蛋白质分子通过凝胶的洗脱体积取决于它的斯脱克半径;◆如果未知蛋白与理想的非水化球体有相同的洗脱体积,则认为这种蛋白质具有与球体相同的的斯脱克半径;◆因此,实验中只要测得标准蛋白的洗脱体积,再测得未知蛋白的洗脱体积就可以得到它的相对分子量。
3、疏水作用层析⏹非极性氨基酸残基组成的疏水区域可使蛋白质结合非极性分子,利用这种相互作用蛋白质可被吸附在基质上。
⏹在不带电荷的载体上偶联疏水基团而形成疏水吸附剂⏹利用载体和样品疏水基团间的相互作用使它们吸附在一起,然后改变层析条件,减弱疏水作用,使吸附的蛋白质从吸附剂上解吸下来。