第十章层析分离技术
- 格式:ppt
- 大小:2.83 MB
- 文档页数:76
色层分离技术层析是根据混合物中,溶质在互不相溶的两相之间分配行为的差别,引起移动速度的不同而进行分离的方法又称色谱法,层离法,层析法;可用于生产规模,也可作为分析检测,控制产品的质量。
1903年,俄国植物学家Tswett提出色层分离法的概念1931年,Kuhn和Lederr在氧化铝和碳酸钙柱体上,以制备规模分离胡罗卜素和叶黄素。
1938年,适用范围扩展到无色物质。
1940~1943年间,Tswett提出了前流分析和置换分析法。
50年代,气相色谱Martin和Synge,60年代,液相色谱DNA重组技术的发展,制备色谱研究成为热点英国生物学家Martin和Synge(1952诺贝尔化学奖他们首先提出了色谱塔板理论。
以理论塔板来表示分离效率,定量的描述、评价层析分离过程。
其次,他们根据液-液逆流萃取的原理,发明了液-液分配色谱。
特别是他们提出了远见卓识的预言:一、流动相可用气体代替液体,与液体相比,物质间的作用力减小了,这对分离更有好处;二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差,应能得到最小的理论塔板高(即增加了理论塔板数),这将会大大提高分离效率。
㈢ 层析的特点分离效率高:每米柱可达几千至几十万的塔板数,适于极复杂混合物的分离。
●应用范围广●选择性强:通过操作方法,洗脱方式和操作条件来实现。
●高灵敏度的在线检测:紫外、荧光、折光等●快速分离:高效层析剂和高压液相色谱●过程的自动化操作●色谱分离的规模:生物工业中的色谱分离色谱分析:<10mg 半制备:10~50mg 制备:0.1~10g 工业生产:>20g/d 分析色谱与制备及工业色谱的比较:⏹应用色谱技术范围不同:分析(柱,纸和薄板);制备(柱)⏹操作上不同:分析(进样量越小越好,检测灵敏度越高越佳;制备(进样量越大越好,色谱柱适当大)⏹色谱分离理论不同:理论塔板数的不同;分配系数不同;样品保留值与峰高的不同互不混溶的两相分别称为固定相和流动相;料液中的溶质在固定相和流动相之间发生扩散传质,产生分配平衡,分配系数大的溶质随流动相移动的速度小。
层析分离技术层析分离技术是一种重要的分离方法,广泛应用于化学、生物、环境等领域。
它基于物质在不同相之间的分配差异,通过多次分配和分离步骤,将混合物中的组分分离开来。
本文将从层析分离技术的原理、类型和应用方面进行介绍。
一、层析分离技术的原理层析分离技术基于物质在不同相中的分配差异,利用不同相中物质的亲疏水性、极性、分子尺寸等特性进行分离。
其原理可以概括为:当混合物通过固定相(静相)时,不同组分会因其与固定相的相互作用力不同而以不同速度通过固定相,从而实现分离。
1. 柱层析:柱层析是最常见的层析分离技术,其主要包括液相层析和气相层析两种形式。
液相层析是在液相中进行分离,常见的有凝胶层析、离子交换层析、亲和层析等;气相层析则是在气相中进行分离,常见的有气相色谱层析、气体吸附层析等。
2. 纸层析:纸层析是一种简单易行的层析分离方法,主要用于分离和鉴定有机化合物。
通过将样品溶液滴到纸上,然后在纸的一端浸入溶剂中,溶剂在纸上上升时,样品中的组分会因其与纸或溶剂的相互作用力不同而以不同速度迁移,从而实现分离。
3. 薄层层析:薄层层析是将样品溶液均匀涂布在薄层层析板上,然后将其浸入溶剂中进行分离。
薄层层析具有操作简便、分离效果好的特点,广泛应用于药物分析、天然产物分离等领域。
三、层析分离技术的应用1. 生物化学:层析分离技术在生物化学研究中得到广泛应用,如蛋白质纯化、核酸提取、酶活性分析等。
2. 药物分析:层析分离技术是药物分析中常用的方法之一,可以用于药物的纯化和分离、药物代谢产物的分析等。
3. 环境监测:层析分离技术可以用于环境中有机物、无机物和杂质的分离和测定,如水质检测、土壤污染分析等。
4. 食品安全:层析分离技术在食品安全领域也有广泛应用,可以用于食品中有害物质的检测和分离,如农药残留、重金属含量等。
层析分离技术作为一种重要的分离方法,具有原理简单、分离效果好、应用广泛的特点。
通过不同类型的层析分离技术,可以实现对混合物中不同组分的高效分离和纯化。
(一)凝胶层析法凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。
它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体,不带电荷,吸附力弱,操作条件比较温和,可在相当广的温度范围下进行,不需要有机溶剂,并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果。
⒈凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。
如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开,由于它们在分配系数上有显著差异,这种分离又称组别分离,一般可选用SephadexG-25和G-50,对于小肽和低分子量的物质(1000-5000)的脱盐可使用SephadexG-10,G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离,这种分离又叫分级分离。
一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶,层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部,由于Kd不同,最后得到分离。
⒉柱的直径与长度根据经验,组别分离时,大多采用2-30cm长的层析柱,分级分离时,一般需要100cm左右长的层析柱,其直径在1-5cm范围内,小于1cm产生管壁效应,大于5cm则稀释现象严重。
长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间,但对移动慢的物质宜在30-40之间。
⒊凝胶柱的制备:凝胶型号选定后,将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀,溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。
自然溶胀费时较长,加热可使溶胀加速,即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸,1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。
加热法既可节省时间又可消毒。
凝胶的装填:将层析柱与地面垂直固定在架子上,下端流出口用夹子夹紧,柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器,柱内充满洗脱液,将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中,然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内,这样凝胶粒水平上升,直到所需高度为止,拆除柱顶装置,用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。
稍放置一段时间,再开始流动平衡,流速应低于层析时所需的流速。
层析分离的基本原理层析分离的基本原理1. 层析分离的定义层析分离(Chromatographic Separation)是一种常用的物质分离技术,通过样品在固定或液相介质中的运动速度差异,使不同组分在给定条件下相互分离。
层析分离技术广泛应用于化学、生物、制药等多个领域。
2. 层析分离的主要原理层析分离的主要原理是基于分子在吸附剂上的相互作用,其中吸附质与固定相通过物理吸附或化学吸附相互作用,从而分离出不同成分。
3. 层析分离的基本步骤层析分离通常包括以下几个基本步骤:•样品加载:将待分离的样品溶液加载到固定相或液相上。
•洗涤:通过洗涤剂,去除样品中的杂质,使得目标物质更加纯净。
•洗脱:通过改变流动相组成或条件,使目标物质从吸附剂上脱附,实现分离。
•采集分离产物:脱附的目标物质被采集以获取纯净的样品。
4. 层析分离的分类根据分离介质的性质和相之间的联系,层析分离可分为多种类型,常见的包括:•吸附层析:通过目标物质与吸附剂的物理或化学吸附进行分离。
•离子交换层析:基于离子交换树脂对样品中的离子进行选择性吸附和释放。
•凝胶层析:利用凝胶材料对分子的尺寸选择性吸附和分离。
•气相层析:利用固定相和流动相的相互作用分离气体中的成分。
5. 层析分离的应用领域层析分离技术在众多领域中得到广泛应用,主要包括以下几个方面:•制药领域:用于药物的提取纯化、药效物质的分离等。
•化学领域:用于化学品的生产、分离和纯化。
•生物学领域:用于蛋白质、细胞等生物分子的分离和纯化。
•环境分析:用于环境样品中有害物质的分析和监测。
•食品安全:用于检验和分离食品中的添加物、残留物等。
6. 层析分离的优势和不足层析分离具有以下优势:•高效:能在短时间内分离和纯化目标物质。
•选择性强:能针对具体的目标物质进行选择性吸附和分离。
•可逆性:可通过调整条件实现目标物质的洗脱和重复利用。
然而,层析分离也存在一些不足之处:•对分子大小敏感:无法对相似大小的分子进行有效分离。
第十章生化分离技术和应用一、选择题⒈下列哪种方法可用于测定蛋白质的分子量()A、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法;B、280/260nm紫外吸收比值;C、凯氏定氮法;D、荧光分光光度法;E、Folin酚试剂法⒉氨基酸和蛋白质共有的理化性质为()A、胶体性质;B、两性性质;C、沉淀性质;D、变性性质;E、双缩脲性质⒊蛋白质溶液的稳定因素为()A、蛋白质溶液为真溶液;B、蛋白质在溶液中做布朗运动;C、蛋白质分子表面带有水化膜和同性电荷;D、蛋白质溶液的黏度大;E、以上都不对⒋关于蛋白质在等电点时的特性描述,哪项是错误的?()A、导电性最小;B、溶解度最小;C、黏度减小;D、电泳迁移率最小;E、以上都不对⒌今有①、②、③、④、四种蛋白质的混合液,等电点分别为:5.0、8.6、6.8和9.2 ,在pH8.6的条件下进行电泳分离,四种蛋白质电泳区带自正极的排列顺序为:()A、①、③、②、④;B、①、②、③、④;C、④、②、③、①;D、③、②、①、④;E、②、④、③、①;⒍盐析沉淀蛋白质的原理为()A、中和电荷,破坏水化膜;B、与蛋白质结合成不溶性盐;C、次级键断裂,蛋白质构象改变;D、调节蛋白质溶液的等电点;E、以上都不是⒎关于下列多肽Glu-His-Arg-Val-Lys-Asp的叙述,哪个是错的?()A、在pH12时,在电场中向阳极移动;B、在pH3时,在电场中向阴极移动;C、在pH5时,在电场中向阴极移动;D、在pH11时,在电场中向阴极移动;E、该肽的等电点大约在pH8⒏用下列方法测定蛋白质含量,哪一种方法需要完整的肽键()A、双缩脲反应;B、凯氏定氮;C、紫外吸收;D、茚三酮;E、奈氏试剂⒐蛋白质用硫酸铵沉淀后,可选用透析法除去硫酸铵,要确定硫酸铵是否从透析袋中除净,你选用下列哪一种试剂检查()A、茚三酮试剂;B、奈氏试剂;C、双缩脲试剂;D、Folin-酚试剂;E、斐林试剂⒑将抗体固定在层析柱的载体上,使抗原从流经此柱的蛋白质样品中分离出来,这种技术属于()A、吸附层析;B、离子交换层析;C、分配层析;D、亲和层析;E、凝胶过滤⒒若用电泳分离Gly-Lys、Asp-Val和Ala-His三种二肽,在下列哪个pH值条件下电泳最合适()A、pH2以下;B、pH2-4;C、pH7-9;D、pH10-12;E、pH12以上;⒓进行疏水层析时,以下哪种条件比较合适?()A、在有机溶剂存在时上柱,低盐溶液洗脱;B、在有机溶剂存在时上柱,高盐溶液洗脱;C、在低盐条件下上柱,高盐溶液洗脱;D、在高盐条件下上柱,按低盐、水和有剂溶剂顺序洗脱;E、低盐缓冲液上柱,低盐洗脱⒔对一个富含His残基的蛋白质,在使用离子交换层析时应优先考虑()A、严格控制蛋白质上样液的浓度;B、严格控制盐浓度;C、严格控制NaCl的浓度;D、严格控制洗脱液的pH值;E、严格控制洗脱液的体积⒕定性鉴定20种氨基酸的双向纸层析是()A、交换层析;B、亲合层析;C、分配层析;D、薄层层析二、判断是非⒈用凝胶过滤法分离蛋白质时,总是分子质量大的蛋白质首先被洗脱下来。
层析分离方法概述■层析法――是一种使不同分子相互分离的过程,当一混合样品被导入一固定相的支持体中,而另一流体(移动相)通过时,由于样品各组分与固定相和移动相相互作用的大小不同,使各组分通过固定相支持体的速率不同而得分离。
层析法的特点:能分离一系列结构较为相似的成分,以达到一般分离方法难以达到的目的。
■层析常见种类及用途:a.柱层析――分离量较大,主要用于分离制备;b.薄层层析――主要用于分析鉴定,也可用于半微量制备。
c.纸层析――主要用于分析鉴定,也可用于半微量制备。
■层析法按分离原理大体上又可以分为(1) 吸附层析(利用吸附能力的差别进行分离),常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等;(2) 分配层析(利用在二种不互溶的溶剂中分配比不同进行分离),常用的支持剂为硅胶、硅藻土、纤维粉等,反相硅胶(键合硅胶)、液滴逆流层析则是分配层析与逆流分溶的发展;(3) 离子交换层析(利用离子解离强度不同进行分离),常用的离子交换树脂有强酸性(磺酸型)、强碱性(季胺型)、弱酸性(羧酸型)、弱碱性(三级胺型);(4) 电泳(利用电流通过时,离子趋电性不同进行分离),常用的有纸电泳、琼脂电泳、凝胶电泳。
(5) 其他有气体层析、凝胶层析、亲和层析等,■层析方法的选择:(1)非极性的成分常选择氧化铝或硅胶吸附层析;(2)极性较大则采用分配层析或弱吸附剂吸附层析;(3)酸性、两性成分可用离子交换层析,有时也可用吸附层析及分配层析。
■各类化合物适宜的层析方法:a. 一般生物碱的分离可用硅胶或氧化铝层析,对极性较高的生物碱也可用分配层析,而对季胺型水溶性生物碱也可用分配层析或离子交换层析。
b. 甙类的层析分离往往决定于甙元的性质,如皂甙、强心甙,一般可用分配层析或硅胶吸附层析。
c. 芳香油、甾体、萜类(结合成甙除外)包括萜类内酯,往往首选氧化铝及硅胶层析,若在氧化铝柱上有次级反应,则宜用硅胶吸附层析。
d. 黄酮体、单宁等多元酚衍生物可用聚酰胺吸附层析。
层析分离技术层析分离技术是一种在化学分析中常用的分离技术,通过不同物质在固相与液相之间的分配系数差异来实现分离。
该技术广泛应用于环境监测、食品安全、药物分析等领域,具有高效、灵敏、选择性好等优点。
层析分离技术的基本原理是根据不同物质在固相与液相之间的分配行为来实现分离。
在层析柱中填充有固定相,通常为多孔性的吸附剂或离子交换剂。
样品溶液经过层析柱时,不同成分在固相与液相之间的分配系数不同,从而在柱中发生分离。
层析分离技术的基本步骤包括样品处理、样品注入、洗脱和检测等。
首先,对样品进行必要的前处理,如提取、浓缩、稀释等,以适应层析分离的要求。
然后,将样品注入层析柱,样品中的不同成分在固相与液相之间进行分配。
根据不同物质的亲和性差异,可以通过改变液相的成分、pH值或温度等条件来调节分离效果。
接着,通过洗脱剂的使用,将目标物质从固相上洗脱下来。
最后,对洗脱液进行检测,可以使用各种分析方法,如光谱法、电化学法、质谱法等,对目标物质进行定量或定性分析。
层析分离技术有多种类型,常见的有薄层层析、柱层析、气相层析等。
薄层层析是一种简单、快速、经济的分离方法,广泛应用于药物分析、农药残留检测等领域。
柱层析是一种常用的分离技术,通过将样品溶液通过填充有固定相的柱子进行分离,可实现复杂样品的分离与纯化。
气相层析则是利用气体作为载气相,将样品中的揮发性成分进行分离,适用于挥发性物质的分析。
层析分离技术在实际应用中具有广泛的优势。
首先,层析分离技术可以实现对复杂混合物的分离与纯化,可用于样品预处理、纯化与富集等过程。
其次,层析分离技术具有高效、灵敏的特点,能够对微量物质进行分离与检测。
此外,层析分离技术选择性好,可通过调节条件来实现对目标物质的选择性分离。
最后,层析分离技术操作简单,设备成本低,易于实施。
层析分离技术是一种常用的分离技术,通过不同物质在固相与液相之间的分配行为来实现分离。
该技术在环境监测、食品安全、药物分析等领域具有广泛应用,具有高效、灵敏、选择性好等优点。
Ft V R R •=m s m s V V K q q k =='b u 色层分离技术色层分离:是一组相关技术的总称,也称为色谱分离或层析分离。
按固定相的基质(载体)类型分类:层析:载体一般为软基质的凝胶,常用的有纤维素、琼脂糖、交联葡聚糖、交联琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等,只适合在低压下操作。
色谱:载体一般为高强度的经过表面该性的硅胶、聚甲基丙烯酸或聚苯乙烯材料,适合在高压下使用。
也有人将层析称为色谱。
用途:用在产品的精制阶段,目标是获得合乎使用要求的产品。
层析:一般用于生物大分子或酶的批量纯化。
高压液相色谱:具有生物活性的小分子物质的分离纯化。
色层分离过程包含两部分:●固定相:载体或载体+功能基团●流动相(洗脱液):缓冲液或有机溶剂 对于高压液相色谱和低压层析,操作模式有很大区别。
液相色谱的基本原理和参数●保留时间(t R )和保留体积(V R )从进样开始到后来出现样品的浓度极大值所需的时间为保留时间,用t R 表示。
在这段时间内冲洗剂(流动相)流过的体积为保留体积,用V R 表示。
理论塔板数的计算公式为:2)(σRt N =容量因子k ' 和平衡常数K某物质的k '定义为在分配平衡时该物质在两相中绝对量之比。
而平衡常数K 为平衡时,物质在两相的浓度比:)()('m s q q k 物质在流动相的量物质在固定相的量=)/)/(m m s s V q V q K 物质在流动相的浓度(物质在固定相的浓度= Vs 和Vm 分别为柱内固定相和流动相所占的体积。
于是有 溶质在固定相停留的时间分数= '1'k k q q q m s s +=+ 溶质在流动相停留的时间分数'11k q q q m s m +=+= 在柱内溶质只有转移到流动相时才能沿柱的方向向前移动,所以对于一个在柱内有保留的溶质,其谱带移动速度( )总是小于流动相的移动速度( ),而等于流动相的移动速度与该谱带对应的溶质在流动相停留的时间分数之积:)'11(k u u m b += 而当柱长一定时,溶质谱带的移动速度和流动相的移动速度与它们通过柱子所花费的时间成反比: Ro R m b t t u u = )'1(0k t t R R += 当柱外死体积可忽略不计时,m R V V =0 s m m m R KV V k V V V +=+='0'0001'R R R R R R R t t t t t t t k =-=-= 柱效率: 塔板高度(H )和塔板数(N )是衡量色谱柱效率的两个重要指标。