大片段DNA片段回收、连接与转化2

加入1ml脱盐胶到1.5ml eppendorf管里，再套上 另外一个干净的1.5ml eppendorf管，冷却后拔去 上面的eppendorf管，加入连接产物，冰上放置1 小时后回收，4 º C保存。
转化
Test transformation: electroporation
吸取2ul 连接产物，加入到20 ul DH10B T1 －resistant cells中，电激，500ul SOC复苏1h， 铺100ul ，37 ºC培养。
Genomic DNA Fragment Recovery
回收
电洗脱
1. 切胶：切下胶块的两边，EB染色，根据照胶结果 切下中间未染色胶块上的特定区域（如 150~350kb）。
2. 将切下的胶进行第二次电泳筛选。（本 次不做）
a
a2 a1
b
b2 b1
3. 切下含DNA的胶块，按片段大小分成四部 分，每部分再切成四片，如下图并排装入 透析袋中。向透析袋中加200ul 1X TAE 挤净气泡，夹紧透析袋以125V/cm的电场 强度洗脱3.5h。
16º C反应16h 。
注意：若gDNA浓度很高，可用灭菌水进行稀释。 gDNA与Vector混合后，65º C温育15min,室温下冷 却10min,再加入连接酶和buffer。
连接终止 脱盐
连接终止：65 º C for 15 min 脱盐: 0.1M Glucose/1% agarose cones for 1h
4. 结束之后，倒转电场方向电泳1min。用剪 过的枪头吸出洗脱液。以λ DNA标准为对照 检测洗脱液中DNA 的浓度。
2ng 4 8 16 A B
连接
连接体系：
gDNA
Vector Ligase buffer Liga4ul（25ng） 10ul 2ul（5U/ul） 100ul