Sf9培养要点：
温度：27-28摄氏度
pH：，sf9最适的pH6.2，随培养时间的延长，Ph值会增加
传代时间：72h（三天左右）
细胞来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。此细胞系适用于InsectSelect系统。这两株细
（以上来自invitrogen）胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。
细胞特点：规则的带有颗粒球形。贴壁紧。
标准条件的定义：
培养最低密度：0.6×106/ml（健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。活率低于90％细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验）1×106/mL将出现对数生长状态
传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。
贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。形成单层细胞可以传代培养
悬浮培养：在细胞密度达到2.0×106-2.5×106细胞/mL后将密度调整至0.7×106-1.0×106细胞/mL进行悬浮传代。确保传代细胞密度不高于4×106个/mL或保持密度高于1×106个/mL以达到对数生长状态。
Sf9悬浮培养所需要的细胞数
培养基：sf-900 ⅢSFM（添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量）
培养瓶与培养体积：
冻存：一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。细胞需达到90％活率和80-90％融合的要求（如：低代次）推荐冻存几管。当融解细胞，它将会达到最佳使用状态。
1. 用细胞计数板计数细胞。需要足够的如上表所示密度的细胞冻存2-4管。细胞可是悬浮或贴壁培养；
2. 将无菌冻存管立于冰上，做好标记；
3. 室温400-600×g离心10min。移除上清。
4. 以给定的密度在冻存液中重悬细胞；
5. 移取1mL细胞悬液置于无菌冻存管中；
6. 置于-20℃1h，然后移至-80℃24-48h；
7. 储存于液氮中。
转染的细胞：需要的是对数期的细胞＞95%发育能力，可以完成成功的转染。
载氧：对于最优生长条件和蛋白的表达，昆虫细胞要求被动的通氧。积极的通氧系统要求溶氧饱和在10%-50%
Sf900II和sf900Ⅲ的区别：一般推荐Sf900II来大量表达蛋白
Sf900II含有表面活性剂（剪切力保护剂（保护细胞在转瓶中培养时不会受到剪切力伤害））
Sf9培养要点： 温度：27-28摄氏度 pH：，sf9最适的pH6.2，随培养时间的延长，Ph值会增加 传代时间：72h（三天左右） 细胞来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。此细胞系适用于InsectSelect系统。这两株细 （以上来自invitrogen）胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。 细胞特点：规则的带有颗粒球形。贴壁紧。 标准条件的定义： 培养最低密度：0.6×106/ml（健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。活率低于90％细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验）1×106/mL将出现对数生长状态 传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。 贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。形成单层细胞可以传代培养 悬浮培养：在细胞密度达到2.0×106-2.5×106细胞/mL后将密度调整至0.7×106-1.0×106细胞/mL进行悬浮传代。确保传代细胞密度不高于4×106个/mL或保持密度高于1×106个/mL以达到对数生长状态。 Sf9悬浮培养所需要的细胞数 培养基：sf-900 ⅢSFM（添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量） 培养瓶与培养体积： 冻存：一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。细胞需达到90％活率和80-90％融合的要求（如：低代次）推荐冻存几管。当融解细胞，它将会达到最佳使用状态。
1. 用细胞计数板计数细胞。需要足够的如上表所示密度的细胞冻存2-4管。细胞可是悬浮或贴壁培养； 2. 将无菌冻存管立于冰上，做好标记； 3. 室温400-600×g离心10min。移除上清。 4. 以给定的密度在冻存液中重悬细胞； 5. 移取1mL细胞悬液置于无菌冻存管中； 6. 置于-20℃1h，然后移至-80℃24-48h； 7. 储存于液氮中。 转染的细胞：需要的是对数期的细胞＞95%发育能力，可以完成成功的转染。 载氧：对于最优生长条件和蛋白的表达，昆虫细胞要求被动的通氧。积极的通氧系统要求溶氧饱和在10%-50% Sf900II和sf900Ⅲ的区别：一般推荐Sf900II来大量表达蛋白 Sf900II含有表面活性剂（剪切力保护剂（保护细胞在转瓶中培养时不会受到剪切力伤害）） 当设计纯化多聚组氨酸标签蛋白的计划时，注意无血清培养基不能直接用于螯合树脂，因为培养基的成分会除去树脂中的镍离子。
1.操作台基本要求： 2.随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20℃或-80℃冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。 3.细胞污染： （1）细菌污染
（2）酵母污染 （3）霉菌污染 初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。 （4）病毒污染 一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。 （5）支原体污染 唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE、PCR、免疫染色、放射自显影 4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出 5．适合贴壁的细胞和悬浮的细胞
6.基础培养基，减血清培养基，无血清培养基 7.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4； 成纤维细胞系适合轻度偏碱（pH7.4-7.7） Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长8.温度：大多数人和哺乳动物细胞系在36℃至37℃最佳 昆虫细胞在27℃为最佳 禽类细胞在38.5℃最佳 冷血动物（15℃-26℃） 9.动物细胞形态划分： ●成纤维细胞，贴附生长 ●上皮样细胞呈多角形，贴附 ●淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附 ●特殊形态： ?I型有长突触 ?Ⅱ型没有轴突 10.细胞增长模式
11.何时传代？ ●哺乳动物：生长的PH值通常表示乳酸储积，且有毒性，当PH迅速降低（） 0.1-0.2PH单位），同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。 ●昆虫细胞PH值会上升但不超过6.4 12．贴壁细胞的解离
昆虫细胞表达系统 昆虫细胞表达系统是四大表达系统（昆虫细胞、细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统）之一。昆虫细胞表达系统原理是通过转座作用将转移载体中的表达组件定点转座到能在大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体（Bacmid）上，通过抗性和蓝白斑筛选到重组穿梭质粒，提取穿梭质粒DNA转染昆虫细胞后，得到的子代病毒即为重组病毒。将病毒上清浸染昆虫细胞，获得表达的重组蛋白。 杆状病毒是一类闭合环状双链病毒，病毒粒子呈杆状，以昆虫为主要宿主。杆状病毒还是一种出芽型分泌性病毒粒子，在感染细胞后能迅速在培养细胞中水平传播而保持细胞在相当长的时间内不裂解，从而最大限度地保持了外源蛋白的稳定，昆虫细胞表达系统又被称为昆虫杆状病毒系统。昆虫细胞表达系统本身是一个蛋白裂解性系统，在杆状病毒感染昆虫细胞的过程中，杆状病毒可以编码一些蛋白酶如木瓜蛋白酶等导致蛋白的降解。因此，收集细胞后，在裂解细胞之前要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白的降解。 昆虫细胞表达系统属于真核细胞表达系统，但又不同于酵母及哺乳动物细胞表达系统，酵母表达的蛋白易纯化但也易降解，而哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白具有生物活性但成本高。细菌表达系统属于原核表达系统，操作简单、周期短收益大、表达产物稳定，但是表达基因的相对分子量有限，且不能对表达产物进行翻译后加工修饰。而昆虫细胞表达系统具有很多优点： (1)具有糖基化作用、乙酰化作用、磷酸化作用等一系列蛋白质翻译加工修饰系统； (2)正确的蛋白折叠、二硫键形成，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白，有利于表达产物形成天然的高级结构； (3)具有对重组蛋白进行定位的功能，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等；
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养 一、实验目的 了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。 二、常用细胞的种类 BHK-21：仓鼠肾传代细胞 PK-15：猪肾传代细胞 IBRS-2：猪肾传代细胞 Hela：人的子宫瘤细胞 Vero：非洲绿猴肾细胞 Marc-145：来源于Vero细胞 TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞 Sf9：昆虫细胞 三、材料 1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头 2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞 3、0.25%胰酶 4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM
5、伪狂犬病病毒液（PRV） 四、传代细胞培养的条件要求 1）细胞密度：2-3×105个/ml 2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3）培养温度 哺乳动物细胞一般为37℃ 昆虫细胞28-30℃ 五、常用细胞分散剂与作用原理 1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解， 导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。 2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。 3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽 酶的混合物。 六、营养液 1、人工综合营养液 氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。 2、血清 1）血清的种类 胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。 2）血清的处理
昆虫的一般形态特征教案 一、说教材 教材：高等教育出版社出版的《植物保护技术》第二版 “实验实训1.昆虫的一般形态特征”。 （一）地位和作用： 1、通过实验观察进一步认识昆虫体躯的组成及附器。 2、复习和巩固昆虫口器、触角、足、翅的构造及类型。 3、为鉴别昆虫打下坚实的基础。 （二）教学目标分析 1、知识目标 （1）认识昆虫体躯外部形态结构和特征。 （2）理解昆虫口器、触角、足、翅的各部分构造和作用。 （3）掌握昆虫的口器、触角、足、翅的基本类型。 2、能力目标 （1）学会观察昆虫的外部形态。 （2）培养学生合作学习的能力。 3、德育目标 发展学生的科学探究能力，培养学生对自然和社会的责任感。 （三）教学重难点 1、认识昆虫体躯外部形态结构和特征。 2、掌握昆虫口器、触角、足、翅的结构及类型，特别是触角类型繁多，学生不容 易掌握，则是教学难点。 二、说教法： 1、借助多媒体弥补实验过程中不容易观察到部分结构，如把昆虫的体躯放大,蜜蜂的 触角放大，蝴蝶的翅放大、蝗虫的后足放大、蝗虫的口器放大，通过感官和视觉， 把抽象变为具体，把难以理解的内容用多媒体展现出来，调动学生的直观功能，对 突破难点创造了良好的氛围，真正达到了对触角、口器、足、翅的结构的理解。 2、利用多媒体的趣味性，吸引学生的注意力。 1）、触角的类型部分，通过学生观察后回答，答对一个给一个动画笑脸，答错一 个给一个动画哭脸，体现多媒体的趣味性特点，这集中了学生的注意力，激发了学 生的学生兴趣和好奇心。培养了学生的创造性思维。 2）、对于昆虫的足、翅的类型，学生观察后，答对一个就把该类型的图片展现 出来，把无声的教学内容，变得有声有色，有静有动，带学生进入教学的情景 之中，使学生对学习内容产生极大的情趣，自然的步入积极的思维状态中。三、说学法 （１）课前准备 组织学生外出捕捉昆虫，要求学生在家附近搜集昆虫，由于学生个人的兴趣、经验、所处环境不同，学生搜集到的昆虫种类、数量不同，这就为学生提供了一 个广阔的空间，形成了开放性的学习过程。同时，这一阶段的学习具有很强的灵 活性，为本节课教学作好了充分的准备。 （２）教学实验 利用搜集到的昆虫材料，认识、辨别、分析昆虫各部分结构及分类，这就让
实验一传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养 一、实验目的 了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。 二、常用细胞的种类 BHK-21：仓鼠肾传代细胞、PK-15：猪肾传代细胞、IBRS-2：猪肾传代细胞、Hela：人的子宫瘤细胞、Vero：非洲绿猴肾细胞、Marc-145：来源于Vero细胞、Sf9：昆虫细胞。 三、材料 1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头 2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞 3、0.25%胰酶 4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 四、传代细胞培养的条件要求 1）细胞密度：2-3×105个/ml 2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3）培养温度 哺乳动物细胞一般为37℃ 昆虫细胞28-30℃ 五、常用细胞分散剂与作用原理 1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解， 导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。 2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。 3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽 酶的混合物。 六、营养液 1、人工综合营养液 氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2、血清 1）血清的种类 胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。 2）血清的处理 无菌采集，过滤除菌。用前56℃灭活30min。 七、传代细胞系培养 1、优点：1) 可以无限的传代。 2) 不少细胞系对病毒很敏感。 3) 某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。 4) 生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。 2、缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。 细胞培养 步骤： ①取长满单层的细胞一瓶，掉到培养液。 ②加入2ml胰酶消化液，置于37℃培养几分钟（也可以轻轻吹打几下），直到细胞间出现空隙或细胞变圆后倒掉消化液。（目的就是让细胞脱离贴壁状态，但不掉下来） ③加入生长液，吹打几次，使细胞分散成单个细胞（两三个聚集一起这种程度就好），然后分装于3个小瓶中，在每个瓶中补充生长液至10ml。 注意：胰酶消化不能太长（此时细胞大量脱离，会造成细胞损失，后面加生长液吹打时也不容易分散成单个细胞，容易成块，培养后长得不光滑） 细胞冻存 冻存液：现在一般用二甲亚砜，也可以用甘油。 步骤： 1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液； 2. 取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。
https://www.doczj.com/doc/d35380118.html, sf9昆虫细胞 货号基因名称规格货期 huayueyang-531sf9昆虫细胞1ml 现货 细胞描述： Sf9昆虫细胞，可以用来包装扩增杆状病毒并表达蛋白。Sf9昆虫细胞增殖能力取决于培养技术、培养条件等综合因素。请按照正确的培养方法来复苏、传代，以此保证细胞具备良好的增殖能力，方便您的后继研究顺利进行。 质量控制： 本细胞经过严格的质量检测，不含有细菌、真菌、病毒（HIV、HBV、HCV）和支原体等。 培养条件： 27℃，PH值7.2~7.4，120–140rpm，无菌恒温培养。 用途： 本产品仅供科研使用，不可用于治疗等其他用途。 细胞相关操作： sf9细胞复苏 1.37°C水浴预热培养基； 2.从液氮中取出细胞放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）； 3.在超净台中加入5ml的培养基重悬细胞，1000rpm离心5min； 4.4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞，用血小球计数板进行细胞计数，按细胞密度3-5×105/ml接种到25ml无菌摇瓶中（带空气过滤通气孔的摇瓶）； 5.摇瓶置于27°C培养箱中的摇瓶架上，120–140rpm培养。 sf9细胞传代 1.取细胞计数(详见sf9细胞冻存)，当细胞密度达到1–3×106/ml时，可传代； 2.37°C水浴预热培养基； 3.在超净台中，加适量预热好的培养基到无菌摇瓶中，以细胞终密度为3-5×105/ml接种细胞（也可1000rpm，5min离心后弃上清，用预热好的培养基重悬并调整细胞密度为3-5×105/ml）； 4.摇瓶置于27°C培养箱中的摇瓶架上，120–140rpm培养。 注：昆虫细胞对氧的要求较高，因此，悬浮培养必须具有高表面积体积比，否则细胞的生长会受到抑制。培养基的体积不能超过摇瓶的五分之二；即100毫升的摇瓶不能超过40ml培养基，250ml摇瓶不能超过100ml培养基。
实验一昆虫外部形态 特征
一昆虫解剖镜的构造和使用 解剖镜、双目解剖镜又称体视显微镜、立体显微镜、实体显微镜等。其形式虽然多种多样，但结构基本一致现以22XB—01型解剖镜为例介绍如下。【目的】1.掌握解剖镜的基本构造和使用方法 【材料】解剖镜 【用具】 【内容和方法】 一、解剖镜的构造和功能 （一）机械部分 1．底座是全镜的最下面的部分。在底座的中央有1个可活动的圆盘，即载物盘。载物盘通常为一面为白色，一面为黑色，也有的为通明的玻璃制 成。在底座的中后部有1对压脚，用以压虫体和其它易动物体之用。 支柱是支持镜体的部件，是焦距的粗调装置，可使镜体上下移动，左右旋转。 ２．调焦装置为了避免镜身向下滑动和左右偏转，在支柱的上部和下部分别装了两个螺丝。上方的为锁紧螺丝下方的为升降螺丝。 ３．倍率盘在镜体中央，有1个两侧转动的圆盘，用以改变放大倍率之用。
双目解剖镜构造图 （二）光学部分 1. 物镜在镜体下，安装有大物镜（镜体内部还有变倍物镜）。 2．棱镜罩镜身上面为两个棱镜罩，内部为棱镜，使物象倒转，在目镜中可看到物体的正像。 3．目镜管和目镜在棱镜罩的上方，左右各有一个目镜管，用以承放目镜4．视觉圈一般是位于右边的目镜管上端。视觉圈可调节目镜的上下距离，使得观察者左右两眼都可以看到清晰物体。 5．眼罩，为了防止外来光线的干扰，多在目镜上设有眼罩，便于更好地进行观察。 6．防尘罩有些型号解剖镜带有防尘罩，使用前后均放在目镜管上端。 二、解剖镜的使用方法和注意事项
1．在取用（或者放回解剖镜）时，若需要连镜箱搬动，应将镜箱锁好，以免解剖镜零件倾出而损坏。同时镜箱的钥匙必须拔除，避免不小心将钥匙碰断在锁孔里。 2．取用解剖镜时，必须用右手握持柱，右手托住底座，小心平稳地取出或移动，严禁单手取用或移动。 3．使用前必须检查附件是否有无缺少及镜体各部有无害损坏，转动升降螺丝有无故障，若有问题立即报告，否则自己负责。 4．镜管上若有防尘罩，应取下防尘罩换上目镜，再将眼罩放在目镜的上端。注意用完后再将防尘罩放回目镜管上。 5．将所观察的物体置于玻片上或蜡盘中，再放到载物盘上，待观察。 7．拧开锁紧螺丝，先把镜体先上升到一定高度，然后锁紧镜体。 8．观察时，可先转动目镜管，使得两个目镜间的宽度适合于自己两眼间的距离。然后转动升降螺丝，使没有视觉圈的目镜成像清晰，另一目镜若不清晰，可转动视觉圈，直至两眼同时看到清晰的物像时为至。如果需要放大观察时，再转动倍率盘直到所需要的放大倍率。 9．在调节焦距时，转动升降螺丝时不能太快。在使用的过程中，若遇到故障应立即停止使用，并向老师报告。 10．使用时若发现目镜或物镜上有异物时千万不能用手、布、手绢、衣服等去擦摸，应用吸耳球吹或用擦镜纸轻轻擦拭。 11．用毕后，先将载物盘上的东西拿走，松开锁紧螺丝将镜体放下，并锁紧。取出目镜，换上防尘罩。将元件全部放回，注意不要与其它镜互换。12．用布把镜身擦干净，放入镜箱内，锁紧镜箱。
细胞培养这个生物学研究最基础的技术之一，已经渗透进了科研工作的方方面面。本文将与大家分享一篇细胞培养的攻略，也是公司一位同事9年细胞培养经验的总结，涵盖了昆虫细胞蛋白表达常用到的sf9细胞与哺乳动物细胞蛋白表达系统的CHO细胞与HEK293细胞，主要介绍了细胞复苏、细胞传代、细胞冻存的具体操作 方法。 细胞复苏： 1、细胞培养条件 2、复苏流程： （1）确认水浴锅的水清洁可用，方可提前打开37度预热。 （2）确认好复苏细胞的液氮罐中具体位置，并做好复苏登记。 （3）提前做好复苏准备，预热培养基。 （4）悬浮和贴壁细胞复苏参数：
（5）将细胞快速放入37度水浴锅中迅速溶解，1.8 ml时间大概1分30秒，1 ml 大概1 min左右，需计时，期间不要老是拿起来观察，需要快速复溶，避免细胞受到损伤。 （6）贴壁细胞需离心， 1000 rpm，5 min；悬浮细胞直接加入预热的培养基中然后放入培养箱中 （7）贴壁细胞离心后去除上清，用预热的培养基重悬细胞后加入到T25方瓶，最后放入培养箱中培养。 （8）取小样计数观察，细胞活力在70%以上算正常。低于70%活力可能细胞状态不太好，需要培养和恢复。 细胞传代培养 1．悬浮细胞传代流程： （1）先将装有细胞的摇瓶从培养箱拿出，用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台；（2）打开摇瓶瓶盖，用200 ul移液器取100~200 ul细胞放入1.5 mlEP管中，瓶盖过火，拧紧，将培养瓶放回摇床； （3）将200 ul细胞混匀，取10 ul细胞加入10 ul台盼蓝，显微镜下计数。根据细胞数决定下游实验； （4）细胞需计数两次求平均值； （5）悬浮细胞生长参数
昆虫细胞培养及其应用进展 摘要: 随着生命科学的迅速发展, 细胞工程愈来愈受到人们的重视。以昆虫细胞为对象的细胞培养技术在现代实验生物学上具有重要的价值, 已经广泛地应用于医学、农业及生物学的各个领域。本文综述了有关昆虫细胞培养的研究进展, 包括昆虫细胞培养基研究开发, 昆虫细胞系的建立和组织培养, 利用生物反应器大规模培养昆虫细胞, 昆虫细胞2杆状病毒表达系统,构建基因工程细胞系及其稳定性表达, 以及昆虫细胞培养的应用前景和研究展望。 关键词: 昆虫细胞系; 昆虫细胞培养; 基因表达;培养条件昆虫的组织培养最早始于1915 年, 直到1962 年Grace 才成功建立了世界上第一个细胞系, 此后昆虫细胞培养在世界范围内广泛开展, 不断有新细胞系建立的报道。现在, 昆虫细胞培养已在细胞生物学、分子生物学、昆虫学、病毒学、生物化学、遗传学等领域的研究工作中发挥着重要的作用。 1昆虫细胞培养基 昆虫细胞培养基的发展经历了天然培养基、合成培养基和无血清培养基三个阶段. 天然培养基采用取自动物体液或从组织中提取的成分作为培养液. 合成培养基最大的特点是各种成分已知.无血清培养基是在已知细胞所需营养物质和贴壁因子基础上, 在基础培养基中加入适宜的促细胞生长因子, 能够保证细胞生长良好无须补加血清的培养基. 昆虫细胞培养基的发展主要是合成培养基的发展.[1] 体外培养昆虫组织的首创者是R ichard Ben2dict (1915), 但他当
时没有合适的昆虫细胞培养基。T rager 首次研究了培养基中昆虫细胞的生长条件, 目的是证明单个细胞能在体外存活几天, 并利用昆虫细胞培养基研究昆虫和哺乳动物病毒。1956 年, Silver W yatt 改进了用于家蚕(B om byx m ori L innaeus) 蛹的培养基, 成功地使细胞存活了14d。他的培养基含有浓度与家蚕血淋巴成分相应的21 种氨基酸、5 种盐、3 种有机酸、以及果糖、海藻糖和葡萄糖, 并相应调解了pH 值和渗透压, 这为昆虫细胞培养基的研究奠定了重要的基础。1956 年就在W yatt 发表论文时, Grace 在W yatt 的培养液中增加了胆固醇、内分泌腺和卵巢组织的提取物以及含有10 种B 族维生素的混合物, 使4 龄家蚕幼虫的卵巢细胞存活了29d。从此, 昆虫细胞培养基的研究便迅速发展起来。到目前为止, 至少已报道了60 多种昆虫细胞培养基。许多昆虫培养基配方正不断得到改进, 以使之适于细胞生长。最通用的商品培养基Grace氏培养基、TC2100、IPL 241、TNM 2FH 以及经改良的哺乳动物细胞培养基TC1992M K 等。TC2100 适合于苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒在草地贪夜蛾细胞系(Sf9 细胞系) 中生长, 但它仅适用于实验室而不适用于大规模培养, IPL 241 提高了昆虫细胞系的生产规模, 利于杆状病毒的有效生产。这些培养基是呈液体或粉剂的商品, 使用时通常补充5%～10% FBS(牛血清) 和一些蛋白水解物或抽取等复杂添加剂。牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基, 含有丰富的细胞生长所必要的营养成分即提供生长因子、脂类、蛋白及无机盐。细胞培养的关键是培养基配方的开发, 已有多种培养基用于支持昆虫细胞系的生长。昆虫细
Sf9培养要点： 令狐采学 温度：27-28摄氏度 pH：，sf9最适的pH6.2，随培养时间的延长，Ph值会增加 传代时间：72h（三天左右） 细胞来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。此细胞系适用于InsectSelect系统。这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。（以上来自invitrogen） 细胞特点：规则的带有颗粒球形。贴壁紧。 标准条件的定义： 培养最低密度：0.6/ml（健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。活率低于90％细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验）1×/mL将出现对数生长状态 传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。 贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。形成单层细胞可以传代培养 悬浮培养：在细胞密度达到2.0×-2.5×细胞/mL后将密度调整至0.7×-1.0×细胞/mL进行悬浮传代。确保传代
细胞密度不高于4×个/mL或保持密度高于1×个/mL以达到对数生长状态。 Sf9悬浮培养所需要的细胞数 培养基：sf-900 Ⅲ SFM（添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量） 培养瓶与培养体积： 冻存：一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。细胞需达到90％活率和80-90％融合的要求（如：低代次）推荐冻存几管。当融解细胞，它将会达到最佳使用状态。 1. 用细胞计数板计数细胞。需要足够的如上表所示密度的细胞冻存2-4管。细胞可是悬浮或贴壁培养； 2. 将无菌冻存管立于冰上，做好标记； 3. 室温400-600×g离心10min。移除上清。 4. 以给定的密度在冻存液中重悬细胞； 5. 移取1mL细胞悬液置于无菌冻存管中； 6. 置于-20℃1h，然后移至-80℃24-48h； 7. 储存于液氮中。 转染的细胞：需要的是对数期的细胞＞95%发育能力，可以完成成功的转染。 载氧：对于最优生长条件和蛋白的表达，昆虫细胞要求被动的通氧。积极的通氧系统要求溶氧饱和在10%-50% Sf900II和sf900Ⅲ的区别：一般推荐Sf900II来大量表达蛋白Sf900II含有表面活性剂（剪切力保护剂（保护细胞在转瓶中培
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中得培养一、实验目得 了解倒置显微镜得构造与使用,了解不同传代细胞得形态及接毒后得病变特征,掌握细胞得传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。 二、常用细胞得种类 BHK-21:仓鼠肾传代细胞 PK-15:猪肾传代细胞 IBRS-2:猪肾传代细胞 Hela:人得子宫瘤细胞 Vero:非洲绿猴肾细胞 Marc-145:来源于Vero细胞 TK-143:人得胸苷激酶阴性细胞 Sf9:昆虫细胞 三、材料 1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头 2、BHK-21(baby hamster kidney)细胞 3、0、25%胰酶 4、生长液:含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素得DMEM 维持液:含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素得DMEM
5、伪狂犬病病毒液(PRV) 四、传代细胞培养得条件要求 1)细胞密度:2-3×105个/ml 2)pH范围最适pH7、0-7、4,耐受pH6、6-7、8 3)培养温度 哺乳动物细胞一般为37℃ 昆虫细胞28-30℃ 五、常用细胞分散剂与作用原理 1、胰酶使精氨酸或赖氨酸得羧基与其她氨基酸得氨基之间得多肽链发生水解, 导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散得单个细胞。 2、乙二胺四乙酸二钠(EDTA):与二价钙、镁离子结合,从而使细胞分散。 3、灰色链丝菌酶:由灰色链丝菌提取得一种酶制剂,就是蛋白酶、氨肽酶与羧肽 酶得混合物。 六、营养液 1、人工综合营养液 氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。 2、血清 1)血清得种类 胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清,其中以新生犊牛血清使用最为广泛。 2)血清得处理
昆虫各目的主要形态特征： 1.直翅目：①体中型—大型、下口型、口器咀嚼式、单眼2—3个②前翅狭或小、皮革质特称“复翅”，休息时呈屋脊状复盖体上，后翅膜质，扇状、可纵折，后足大多跳跃式，有尾须，产卵器大多发达，多具听器和发音器③不完全变态，卵生、聚产、有卵囊保护，产在土中或植物里，属隐蔽式④多数具保护色，普遍有性二型现象，多数植食，少数肉食 2.半翅目：①口器刺吸式，喙管从前向后伸出，为害时只将口针插入植物组织内吮吸汁液②翅两对，前翅基部半革质，端部半膜质，称半鞘翅，休息时平复于体上，后翅膜质折叠于前翅下。将前翅展开，观察翅的分区，记住革片，膜片，爪片等各部位的划分。膜区的脉纹是分科的重要依据之一③体扁，前胸背板和中胸小盾片发达，腹部两侧常露出在半鞘翅外，无尾④有发达的臭腺，从腹面观察，位于后胸侧板⑤属不完全变态，本目昆虫多为植食性种类。也有捕食性益虫还有卫生害虫臭虫 3.同翅目：①口器刺吸式，从头的后方伸出，前翅质地均一，休息时左、右翅呈屋脊状复于体背不重叠（注意与半翅目的区别）蚜和蚧有无翅型②多数种类体上有腊膜，跗节1—3节③绝大多数是不完全变态，但蚧的幼虫有蛹，称过度变态④大多是两性生殖卵生，蚜科种类常营孤雌生殖；雌雄性二型现象普遍、蚜虫还具有多型现象⑤均为植食性，有的还能传播病害。分泌蜜露 4.鳞翅目：①体、翅上都被有鳞片，前翅上的鳞片组成图案可分线和纹（或斑）两类；线按位置由基部向端部顺次称基横线，内横线、中横线、外横线、亚缘线、缘线；斑按形态称环状纹、肾状纹、棒状纹，后翅常有新月纹，斑纹的变化是鉴定种的依据，除去鳞片可见明显脉纹这是科的重要依据②口器虹吸式是下颚的外颚叶极度延伸左右合并成喙管，只能吮吸花蜜等液体，不用时卷曲呈发条状，下唇须发达，下颚须退化很小③单眼2个或无；触角线状、梳状、羽状或球状或球杆状；无尾须④完全变态，卵圆球型，半球型，椭圆或扁平，表面有颗粒或刻纹；蛹大多为被蛹，少数为植食性，主要是幼虫期为害，仅小数肉食性，幼虫毛虫型、口器咀嚼式，下唇叶中间突起，叫吐丝器，能吐丝，唇基三角形，额夹“人”字。腹足底面有钩状刺（趾钩）依长度可分为单序，二序和三序，依排列形式可分为全环式、缺环式、二横带式、中列式，趾钩的变化是鉴别幼虫的重要依据⑤幼虫体上常有斑线和毛，其分布可作为识别种类的辅助特征，纵线以所在位置高低依次称背线，亚背线、气门上线、气门线 5.膜翅目：①头能动、咀嚼式。无尾，产卵器发达，多数呈针状，有刺蜇能力②翅两对膜质，前翅大后翅小，飞翔时以翅钩列连接，触角线状，棍棒状或膝状③腹部通常6—7可见节，第一腹节常并入胸部称并胸腹节④完全变态：幼虫变化大，广腰亚目食叶种类为“伪镯形”；细腰亚目多为蠕虫式（胸腹足退化）寄生蛾类幼虫为“原足型”分节不完全；蛹为裸蛹长有茧、巢保护⑤习性变化大，可食叶、蛀茎。有时取食花粉和吸蜜，有的肉食，捕食性或寄生有益种类多于有害种类；高等种类有社会性组织 6.缨翅目：①体微小，细长；两对翅狭长、翅脉简单，翅边缘有长而整齐的缘毛②头略带后口式，口器锉吸式③触角6-9节、末端数节尖锐，触角节上有钉状、角状突的感觉器，可作为种的鉴别特征④足的末端有泡状的中垫，爪退化⑤锯尾亚目的种类，腹末圆锥形，有锯状产卵器。管尾亚目的种类，腹末圆柱形，无产卵器⑥过渐变态，若虫和成虫形态相似，第三龄起出现翅芽，末龄幼虫不食少动似“蛹”。绝大多数植食性，少数捕食性（捕食蚜虫等） 7.鞘翅目：①小之大型，皮肤坚硬，口器咀嚼式②触角多样，线状、棒状等③无单眼；前胸发达，常常露出三角形的中胸小盾片④前翅硬化，角质，为鞘翅，休息时放于腹背上，后翅膜质，折叠在鞘翅下面⑤跗节5节，少数4或3节⑥卵呈圆形或圆球形等，完全变态 8.脉翅目：①头下口式，口器咀嚼式；跗节5节②翅二对、膜质、前后翅形状相似，脉纹呈网状，边缘多分叉③完全变态、幼虫有三对胸足、活泼、上、下颚呈尖锐的长管，用来咬住俘虏吮吸其体液，均为肉食性的益虫 9.双翅目：①体小至中型，头下口式，蚊的口器为刺吸式；蝇的口器舐吸式②仅一对前翅发达、膜质；后翅退化为平衡棒③复眼大、单眼3个，触角具芒状，线状或念珠状④雌虫腹末数节能伸缩，成为伪产卵器，没有真正的产卵器⑤完全变态，卵长卵型