实验一传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养
一、实验目的
了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。
二、常用细胞的种类
BHK-21：仓鼠肾传代细胞、PK-15：猪肾传代细胞、IBRS-2：猪肾传代细胞、Hela：人的子宫瘤细胞、Vero：非洲绿猴肾细胞、Marc-145：来源于Vero细胞、Sf9：昆虫细胞。
三、材料
1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头
2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞
3、0.25%胰酶
4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM
维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM
四、传代细胞培养的条件要求
1）细胞密度：2-3×105个/ml
2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8
3）培养温度
哺乳动物细胞一般为37℃
昆虫细胞28-30℃
五、常用细胞分散剂与作用原理
1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，
导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。
3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽
酶的混合物。
六、营养液
1、人工综合营养液
氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2、血清
1）血清的种类
胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。
2）血清的处理
无菌采集，过滤除菌。用前56℃灭活30min。
七、传代细胞系培养
1、优点：1) 可以无限的传代。
2) 不少细胞系对病毒很敏感。
3) 某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。
4) 生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。
2、缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。
细胞培养
步骤：
①取长满单层的细胞一瓶，掉到培养液。
②加入2ml胰酶消化液，置于37℃培养几分钟（也可以轻轻吹打几下），直到细胞间出现空隙或细胞变圆后倒掉消化液。（目的就是让细胞脱离贴壁状态，但不掉下来）
③加入生长液，吹打几次，使细胞分散成单个细胞（两三个聚集一起这种程度就好），然后分装于3个小瓶中，在每个瓶中补充生长液至10ml。
注意：胰酶消化不能太长（此时细胞大量脱离，会造成细胞损失，后面加生长液吹打时也不容易分散成单个细胞，容易成块，培养后长得不光滑）
细胞冻存
冻存液：现在一般用二甲亚砜，也可以用甘油。
步骤：
1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2. 取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。
3. 去除PBS，加入适量胰蛋白酶（覆盖培养皿表面）把单层生长的细胞消化下来；
4. 离心1000rpm，5min；
5. 去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
6. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml（不要加满，看冻存管的规格）
7. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
8. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
细胞复苏
目的：下一步实验需要或检测细胞冻存质量
步骤：
1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子（超净台操作），用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3. 离心，1000rpm，5min；
4. 弃去上清液（为了去掉冻存液），加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数（一般情况可以不用计数，尽快培养），调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5. 次日更换一次培养液，继续培养。
八、病毒（PRV）在传代细胞中的培养
步骤：
①取长满单层的细胞，倒掉培养液
（PEDV需要在①②步骤间架10ug/ml的胰酶，便于PEDV的体外生长）
②加入适量病毒悬液
③置温箱中感作（吸附）45min~1h。（即给予病毒入侵细胞并增值自己的时
间）
④取出瓶子，倒掉培养液，补充维持液，置温箱中继续培养，直至80%细胞病变
⑤收毒：将病变细胞至于-20℃冰箱中，冻存后取出自然解冻（冻融一般需要重复几次，以得到更多病毒液），解冻过程振荡几次，以使得细胞完全从瓶壁上脱落，然后将病毒液手机于盐水瓶或其他瓶中，低温贮藏备用。
（病毒入侵细胞过程：吸附~入侵~脱壳~病毒大分子合成~装配~成熟~释放）
实验二、原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）
一、实验目的
了解不同原代细胞的形态，掌握鸡胚成纤维细胞的制备与培养方法。
二、材料
1、9-11日龄鸡胚（不宜过大，不然剪碎组织较为困难，杂细胞较多）
2、照蛋灯与蛋座
3、碘酊棉球与酒精棉球
4、大剪子、眼科剪、小镊子
5、平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶、
6、胰酶、生长液、维持液
三、细胞培养的条件要求
1）细胞密度
原代细胞：4-6×105个/ml
传代细胞：2-3×105个/ml
2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8
3）培养温度
哺乳动物细胞一般为37℃
昆虫细胞28-30℃
四、操作步骤
1、取9-11日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒气室部。
2、无菌操作下用剪子去除气室部卵壳，去除壳膜，穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚
颈部，取出鸡胚放于灭菌平皿中。
3、用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏，用DMEM（含10%FBS）冲冼2次。
4、将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状。
5、将剪碎的组织块倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶中，用DMEM充分冲洗，
并静置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加DMEM。如此反复冲洗2-3遍。
6、于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25%胰酶，并调pH至7.6-7.8，振荡混匀
后置37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次，使细胞消化完全（组织块变散松，沉降渐变缓慢时即表示消化足够）。
7、取出，静置几分钟，小心吸弃上层胰酶溶液，用DMEM轻洗2次后，加入
生长液5ml，用大口径吸管反复吹打，使细胞游离。
8、静置几分钟，使未消化好的组织块下沉。
9、细胞计数
取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫—枸椽酸（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10min，充分振荡后进行计数。
按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。
每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K（稀释倍数）。
活细胞数应在90%以上。
10、将计数好的细胞稀释到合适的浓度，使细胞量约为4-6×106个/ml，分层于细
胞培养瓶中，每瓶1ml，再补加DMEM生长液至10ml，盖上盖子，置于37℃恒温箱中培养。
五、结果的观察
于培养后每天观察结果，至长层单层。细胞量较大时，一天即可长成单层，细胞呈纤维状。
注意事项：①无菌，②组织块务必切成小块，③严格控制胰酶消化时间，④做好标注。
实习三鸡胚肾细胞（CEK）和鸡胚气管（CET）
器官培养物的制备
目的：1.掌握CEK和CET制备方法。
2.认识CEK的显微形态和CET纤毛摆动状态。
材料：19-21天龄戏鸡胚、0.25%胰酶、Hanks水解乳蛋白液（每100ml加小牛血清10ml和1ml庆大霉素，用于CEK培养；而用于CET的维持液无须加
小牛血清）、平皿、塑料吸头，其余用品同实习三。
内容与方法：
1.CED制备
（1）用洒精棉擦拭、火焰灼烧剪刀、镊子，准备好平皿。
（2）用洒精棉消毒蛋壳，无菌操作打开蛋的气室，剪断颈椎胸段，将头颈放入平皿（留做CET），用镊子挟稳胸椎，沿胸椎两侧剪去翼，稍向
外侧剪去腿，直至泄殖腔前剪去尾部，在此过程从上到下去除胸腹腔
内脏及生殖器官。
（3）用镊子钝性分离并取下肾脏，剪碎，BSS洗2次，倒入三角瓶。
（4）加入0.25%胰酶10ml，于37℃水浴消化30分钟，迅速用BSS将组织块轻轻冲洗2次，弃去冲洗后即加入10ml营养液，用吸管反复吹散
组织小块。
（5）经100目滤网滤入离心管，用羊皮纸封口，1000转/分钟离心5分钟，弃去上层液，确定细胞压积后，以1：300的稀释倍数加入新营养液
重新悬浮细胞，每一链霉素瓶加入1ml细胞悬液，放于培养架上，在
瓶上方做好标记，置37℃培养。
2．CET制备（可在CEK消化30分钟进行）
（1）小心剪开颈部腹侧皮肤。
（2）双手各持一镊子小心他离气管，去除周围的脂肪、结缔组织，尽量少夹伤气管，将整个气管剪入盛有少量BSS的平皿，进一步清除气管
外围组织。
（3）用带有塑料吸头的2ml注射器套上气管的一端，反复吸吹BSS，尽量冲洗出气管内的粘液，然后用尖镊子夹住气管中央，从两端分别尽
可能薄地剪下完整的气管环于另一盛有BSS的平皿中。
（4）用注射器针头钩起一个完好的气管环加入链霉素瓶中（内含1ml维持液），即可在倒置显微镜下观察纤毛摆动情况，或放37℃培养。