昆虫细胞培养及其应用进展
摘要: 随着生命科学的迅速发展, 细胞工程愈来愈受到人们的重视。以昆虫细胞为对象的细胞培养技术在现代实验生物学上具有重要的价值, 已经广泛地应用于医学、农业及生物学的各个领域。本文综述了有关昆虫细胞培养的研究进展, 包括昆虫细胞培养基研究开发, 昆虫细胞系的建立和组织培养, 利用生物反应器大规模培养昆虫细胞, 昆虫细胞2杆状病毒表达系统,构建基因工程细胞系及其稳定性表达, 以及昆虫细胞培养的应用前景和研究展望。
关键词: 昆虫细胞系; 昆虫细胞培养; 基因表达;培养条件昆虫的组织培养最早始于1915 年, 直到1962 年Grace 才成功建立了世界上第一个细胞系, 此后昆虫细胞培养在世界范围内广泛开展, 不断有新细胞系建立的报道。现在, 昆虫细胞培养已在细胞生物学、分子生物学、昆虫学、病毒学、生物化学、遗传学等领域的研究工作中发挥着重要的作用。
1昆虫细胞培养基
昆虫细胞培养基的发展经历了天然培养基、合成培养基和无血清培养基三个阶段. 天然培养基采用取自动物体液或从组织中提取的成分作为培养液. 合成培养基最大的特点是各种成分已知.无血清培养基是在已知细胞所需营养物质和贴壁因子基础上, 在基础培养基中加入适宜的促细胞生长因子, 能够保证细胞生长良好无须补加血清的培养基. 昆虫细胞培养基的发展主要是合成培养基的发展.[1] 体外培养昆虫组织的首创者是R ichard Ben2dict (1915), 但他当
时没有合适的昆虫细胞培养基。T rager 首次研究了培养基中昆虫细胞的生长条件, 目的是证明单个细胞能在体外存活几天, 并利用昆虫细胞培养基研究昆虫和哺乳动物病毒。1956 年, Silver W yatt 改进了用于家蚕(B om byx m ori L innaeus) 蛹的培养基, 成功地使细胞存活了14d。他的培养基含有浓度与家蚕血淋巴成分相应的21 种氨基酸、5 种盐、3 种有机酸、以及果糖、海藻糖和葡萄糖, 并相应调解了pH 值和渗透压, 这为昆虫细胞培养基的研究奠定了重要的基础。1956 年就在W yatt 发表论文时, Grace 在W yatt 的培养液中增加了胆固醇、内分泌腺和卵巢组织的提取物以及含有10 种B 族维生素的混合物, 使4 龄家蚕幼虫的卵巢细胞存活了29d。从此, 昆虫细胞培养基的研究便迅速发展起来。到目前为止, 至少已报道了60 多种昆虫细胞培养基。许多昆虫培养基配方正不断得到改进, 以使之适于细胞生长。最通用的商品培养基Grace氏培养基、TC2100、IPL 241、TNM 2FH 以及经改良的哺乳动物细胞培养基TC1992M K 等。TC2100 适合于苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒在草地贪夜蛾细胞系(Sf9 细胞系) 中生长, 但它仅适用于实验室而不适用于大规模培养, IPL 241 提高了昆虫细胞系的生产规模, 利于杆状病毒的有效生产。这些培养基是呈液体或粉剂的商品, 使用时通常补充5%～10% FBS(牛血清) 和一些蛋白水解物或抽取等复杂添加剂。牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基, 含有丰富的细胞生长所必要的营养成分即提供生长因子、脂类、蛋白及无机盐。细胞培养的关键是培养基配方的开发, 已有多种培养基用于支持昆虫细胞系的生长。昆虫细
胞培养所用培养基一般均补加FBS, 血清提供了细胞生长过程中所需的营养物质和微量元素, 使细胞能健康生长和传代。但是FBS 的使用也存在着缺点: ①价格高; ②每批血清的质量不同, 影响细胞的生长和病毒复制; ③血清中的蛋白影响从培养的上清液中分离和提取重组蛋白, 使蛋白的纯化更加困难;④血清易被支原体污染。由于部分加入胎牛血清或牛血清使典型昆培养基变得很复杂。因此, 无论工业上或学术上, 开发无血清培养基都是必然的趋势。昆虫细胞无血清培养基的研究始于20 世纪60 年代末和70 年代初, 发展无血清培养基, 必须寻找适当的具有类似于血清功能的因子, 由于血清成分复杂, 具有多种促细胞生长和增殖因子, 因此要找到血清的替代物是相当困难的。目前, 通常的添加物有酵母自溶物、蛋白胨、胰蛋白胨、蛋黄乳液、酵母抽提物水解乳蛋白及微量元素等。近年来已先后研制出多种无血清或低蛋白培养基如SFM 25、CDM、Sf2900?、Excell400、ISFM 等, 但缺点是适用范围小。CDC 培养基的出现, 打破了无血清培养基的局限, 它既可用于双翅目细胞培养, 又可以用于鳞翅目细胞系的培养, 而且不需要预先的适应步骤。由于在无血清培养基中含有从血清或动物脏器中纯化的蛋白成分, 如胰岛素、转铁蛋白、白蛋白和脂蛋白等, 增加了分离纯化的难度和成本。细胞在无血清低蛋白或无蛋白培养基环境中对剪切应力更为敏感, 故需适当提高保护剂的浓度如FluronicRF68 到0. 3%。无血清培养基的应用有时会降低重组蛋白的产量, 在无血清培养基内, 较高的细胞生长密度与相对较低水平的重组蛋白产量这一事实表明, 促进细胞分裂的因子与促进重
组蛋白生产的杆状病毒感染晚期起作用的因子是不尽相同的。无血清培养基配方还需进一步改进以便适应于重组蛋白的表达。[2]
2昆虫细胞系的建立
昆虫细胞培养的奠基人是德国的R ichardBendict(187821958), 他在1915 年发表了有关昆虫细胞培养的第一篇论文。1956 年W aytt 在分析蚕淋巴化学成分的基础上, 模拟昆虫的血淋巴, 设计出最早的昆虫组织培养液。Grace 对W yatt 的培养基配方作了一些改进, 并首先建立了 4 个桉蚕蛾卵巢细胞系(1962)。虽然已建立了很多的昆虫细胞系, 但迄今为止, 研究和应用得最多的是草地贪叶蛾(Spodop tera f rug iperda)卵巢细胞系Sf21 及其克隆株Sf9 和粉纹夜蛾(T richop lusiani) 胚胎细胞系BT I2Tn52B124 (商业上称之为H igh Five)。昆虫细胞进行原代培养时, 为了克服微生物污染的问题, 可以对室内养虫进行体表消毒和在培养基中加入抗生素, 但传代培养时培养基中加入抗生素对细胞生长不利。最初培养的昆虫细胞主要以血细胞、成纤维细胞为主。而现在已建立的细胞系则主要来源于未发育成熟组织, 如胚胎、器官芽和卵巢。用未成熟或未分化的组织建立细胞系比用成熟组织容易, 主要是因为其中干细胞含量高。未成熟组织的细胞系建立早于成熟组织细胞系, 1962年Grace初次建立了4个桉蚕卵巢细胞系,在此之后又相继建立了多种未成熟组织的昆虫细胞系。1985年M itsuhashi等成功地建立了昆虫血球细胞系, 而对神经细胞、肌肉细胞、体壁细胞、马氏管、唾腺、脂肪体细胞进行离体培养仅存活一段时间。已有许多研究者尝试用成熟组织建立昆虫细胞系,
但不易成功。最近, 洪华珠建立了一株来自粉纹夜蛾(T richop lusia ni) 脂肪体的传代细胞系,Boyce 研究所也成功地建立了美洲粘虫中肠的细胞系。不管细胞来源是成熟组织还是未成熟组织, 细胞的原代培养均须经物理或酶解的方式将组织解离, 产生组织碎片或细胞悬液。原代培养初期细胞有一段时间需要适应新的外界环境, 细胞产生形态变异, 表明了细胞已开始生长, 细胞增长率的提高是其传代培养的一个前提。
到目前为止,全世界建立的昆虫细胞系有800株以上,分别来源于鳞翅目、双翅目、鞘翅目、蜚蠊目、膜翅目、直翅目、同翅目和半翅目等8 个目的170多种昆虫,然而其中大部分来自鳞翅目和双翅目,来源于其他目的昆虫细胞系仅占1Π10 左右(图1 ,个人统计) 。由于草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda 细胞株Sf 9 和Sf 21 ,以及粉纹夜蛾Trichoplusia ni 细胞株Tn5B124(商品名High Five) 对模式病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Autographa californica multicapsidnucleopolyhedrovirus(AcMNPV)非常敏感,因而成为各实验室普遍采用的细胞系(Granados et al. ,1994) 。[3]
3生物反应器大规模培养昆虫细胞
高效培养的方法是昆虫细胞大规模培养的关键, 昆虫细胞的培养条件与哺乳动物细胞基本相似, 现有的大部分昆虫细胞培养技术也是由动物细胞培养方法改进而来, 昆虫细胞培养系统大致可分为两种类型: 一类的生长细胞附着在培养器壁或其他支持物的表面; 另
一类的生长细胞悬浮在液体培养基内。前一类通常称为机质依赖型或停泊依赖型培养, 后一类称为悬浮培养。用生物反应器技术进行细胞悬浮培养是当今的研究热点,因为这项技术已成功应用于微生物与哺乳动物细胞的工业化生产。已有一些用转瓶、涡旋罐、空气补给生物反应器等不同类型容器进行昆虫细胞悬浮培养的研究报道。除了悬浮培养外, 昆虫细胞也可固定在高分子机质内或吸附在高分子聚合膜表面。由于昆虫细胞培养系统需氧量很高, 大量输氧操作如搅拌、喷气等都是必需的, 但这些操作产生的水剪切应力, 往往引起细胞的损伤和死亡。这个问题目前已经成为细胞大规模培养的关键性限制因子。大规模培养昆虫细胞时要考虑的因素很多,如生物反应器的设计、氧气转运、剪切应力、细胞密度、培养基组分以及装备成本等。在多数场合,大规模培养昆虫细胞用于生产重组杆状病毒表达外源蛋白, 都是作为间歇工艺流程进行的, 因为所有的细胞都因病毒感染的细胞病理效应(CPE)而引起死亡。用这一方法, 往往可以简单地预测何时去收获感染细胞。迄今, 由于“传代效应”的影响,连续或半连续生产杆状病毒的研究取得的成果有限。昆虫细胞进行悬浮扩大培养时, 细胞的敏感性问题是首先要解决的。搅拌槽生物反应器是当今生物工程领域的主要培养装置, 可以在液体表面通气, 也可以在反应器底部通气, 培养基内需添加甲基纤维素或FluronicRF68 等保护剂。根据昆虫细胞培养特点, 要求搅拌器转动时产生的剪切力小, 混和性能好, 围绕这两项要求, 已开发了不少形式的搅拌器, 迄今为止, 每年仍有不少这方面的论文和专利陆续发表。Sasaki 在搅拌浆上安装疏水性的
聚丙烯膜以实现无泡通气搅拌, 在这种改进的搅拌反应器内, 以灌注方式培养Sf21 细胞, 其密度可达2×107个/mL , 对数生长期可维持7 d 以上。Kamem 在11 L 带有螺旋浆式搅拌器的反应器内培养Sf9 细胞, 这种搅拌器在低转速和低剪切的前提下, 能获得良好的混合与传质效果。利用此装置, 在表面通气的情况下, 细胞密度可达到5. 5～6. 0×106个/mL , 细胞成活率高于98% ,106个细胞中异源蛋白产量可达5 Λg。由于相对低的细胞密度与产物浓度已在一定程度上限制了昆虫细胞的培养。目前, 焦点之一是寻找一种细胞培养方法, 既能提高细胞密度又能增加细胞产物, 同时能够降低生产成本。固定化昆虫细胞培养作为一项新技术, 近年来发展很快,A gathos 采用胶原蛋白为基质的微珠来固定化培养蚊子细胞, 密度高达2×107个/mL。King 采用海藻酸2聚L 2赖氨酸制备微囊来培养昆虫细胞, 细胞密度可达8×107个/mL。固定化培养的另一有效方法是堆积床, 为贴壁培养方式的一种, 昆虫细胞贴壁生长在颗粒状球上, 并在气升式反应器的降液区形成堆积床, 而升液区则进行通气供氧。堆积床法由于可提高培养表面积, 同时又能保持充足的供氧, 因此有很好的发展前景。
在体外培养昆虫细胞工作中,为了保种和长期保存昆虫细胞的活性,必须将细胞进行冷冻保存,并在需要时进行复苏培养。Knudson 和Bckley曾指出,脊椎动物细胞冻存方法也适用于昆虫细胞的冻存,但在冻存和复苏的方法上不尽相同。Spallanzani 在1776 年最早发表了冷处理对细胞生命活动的影响报道。1949 年,Polge 等人发现
了甘油对低温贮存的细胞的保护作用。1959 年,Lovelock 等人发现了一种新的化学保护剂,这就是人们所熟知的二甲亚砜(dimethylsulfoxide ,DMSO) 。但三桥淳指出,以甘油作为保护剂来冻存昆虫细胞同样可以取得很好的效果[4]。
离的中肠细胞一般是在细胞培养瓶或培养板中进行离体培养,贴壁的组织和细胞更容易培养成功,贴附和伸展因子可诱导细胞的伸展,层粘连蛋白和胶原家族的分子可以促进动物上皮细胞生长和分化,其中I型胶原分子的效果较好(刘芳宁和张彦明,2 0 0 7)0但是,Zhang 等(2 0 0 9)在培养中华蜜蜂中肠细胞时发现I型和I V型胶原蛋白并未对细胞贴壁起促进作用。S a n c h e z等(2 0 0 4)设计了一种促进中肠细胞贴壁的技术,在两层盖玻片中培养红脂大小蠹中肠细胞,在上面盖玻片的压力(71mg/ 0.8c m2)下促进细胞的生长,这有利于中肠细胞在离体条件下极性分化的产生,为中肠细胞离体培养技术开启了一个新的思路。[5]
4 昆虫细胞系的应用
4.1
昆虫细胞系在基础医学研究中的应用
在基础医学方面, 利用昆虫细胞研究虫媒病毒、以及病毒在昆虫细胞中的发育和侵染; 利用昆虫细胞系研究人类疾病基因; 利用昆虫细胞系检测药物, 特别是抗癌药物, 进行毒理学研究; 还有学者应用昆虫细胞系研究昆虫细胞的凋亡和细胞周期调控, 这些研究为进一步探
讨人类细胞凋亡机制及某些疾病治疗提供了实验基础。细胞周期调控备受关注。果蝇的细胞周期蛋白Cyclin D在胚胎发育的不同时期表达, 而 D 型周期蛋白的表达增高, 可以在许多类型的癌细胞中被检测到, 是细胞癌变的一个重要标记性蛋白。有关细胞周期调控蛋白CycD在果蝇发育中的调控机制, 为肿瘤细胞突变机制的研究奠定了很好的基础。同时也有助于找出抑制肿瘤细胞分裂的方案。
4.2
基因工程- 昆虫杆状病毒表达系统
自1983年Sm ith等创建了昆虫杆状病毒表达载体系统( BaculovirusExpressionV ector System,BEVS ) 以来, 昆虫细胞作为重组病毒的表达载体得到了更快更好的发展。利用病毒昆虫细胞表达系统高效表达人体基因, 获得具有治疗疾病的干扰素等蛋白质、多肽和其他具有生物活性的物质, 并最终利用昆虫细胞系作为生物反应器、生产基因工程药物和疫苗。利用杆状病毒表达系统在Sf9细胞中表达人纤维介素蛋白 2 (hfgl2) 凝血酶原酶并检测其蛋白活性, 为开发重型肝炎蛋白芯片或ELISA诊断试剂盒提供阳性对照, 也可用于血清特异性抗体的检测, 更为研究该蛋白体外功能学提供了有利的工具。姚文荣等构建狂犬病毒核蛋白( NP) 基因的重组杆状病毒表达载体, 在昆虫细胞中表达具有免疫原性的狂犬病毒核蛋
白, 结果证实该表达产物可以用于狂犬病的检测及诊断。用RT- PCR 方法扩增兔出血症病毒(RHDV ) 衣壳蛋白VP60基因, 通过克隆、转化得到重组穿梭载体Bac- m id-VP60, 用此质粒转染Sf9细胞, 得
到重组病毒rAcV - Bac-VP60, 为兔病毒出血症基因工程疫苗的研制奠定了基础。
4.3
昆虫细胞系在杀虫剂研究中的应用
既往在研究杀虫剂药效、毒性作用机制及昆虫抗药性等方面, 主要采用活体昆虫进行相关研究。但活体生物测定需要的周期长, 昆虫对药剂的敏感性受季节、温度以及品系等因素的影响较大, 其结果需要校正。为寻找更好的研究方法, 近年来有部分学者应用昆虫细胞系研究杀虫剂毒性。许名飞等应用美国棉铃虫细胞研究灭多威对该细胞基础代谢热值的影响, 提示应用昆虫细胞可以为药物毒理研究提供参考。也有学者通过八种昆虫离体细胞系对灭多威农药的敏感性进行研究。本课题组利用MDEC- 07114对灭多威的毒效进行测
定, 并从细胞水平就药物对MDEC- 07114细胞周期以及超微结构的影响进行研究。昆虫细胞可在严格控制的实验条件下,简化影响因素, 并且细胞生长周期短、耗药极少, 进行毒力测定精度高、重复性好, 可同时进行多个药剂的筛选, 更能满足化学杀虫剂和天然源杀虫剂筛选所需的快速和准确的要求, 为杀虫剂开发研究、药效筛选提供实验基础。目前由于化学杀虫剂引起的抗药性日益严重以及造成的环境污染, 使生物杀虫剂成为国内外害虫防治技术的一个新的发展方向。生物杀虫剂主要包括细菌杀虫剂, 如苏云金杆菌( Bt); 杀虫抗生素, 如Success, Conserve,Tracer,Spin Tor;真菌杀虫剂, 如白僵菌制剂Boverin。[6]
参考文献:
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6、童丹丹,吴艳蕾,郑桂玲等.昆虫中肠细胞的离体培养. 环境昆虫学报,May2 01 3,3 5(3):3 9 0-3 9 8
细胞培养综述 摘要：为了模拟机体生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。培养出的活细胞具有量大、均一和可重复性的特点，可以通过各种物理、化学、生物等因素进行调控，并且可以通过倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记等多样的方法进行研究，已广泛运用在不同科学研究领域。 关键词：分化，细胞分型，生长增殖过程，传代 一、体、外细胞的差异和分化 1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系[1]。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。 虽然体外细胞与机体细胞存有差异，但并未失去研究的意义。且不论其有许多性状仍与体相同（如体外培养的心肌细胞仍可博动），只从细胞遗传学（Cyto－genetics）的角度看，离体细胞仍带有全套的二倍体基因。细胞在培养中的表现，只不过是相应基因关闭／开启
引起的现象，这并非是绝对缺陷。恰恰相反，在培养的细胞中某些特定功能的丧失，可为该基因的表达与调控提供线索。 2、分化；体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的政变，细胞分化的表现和在体不同。细胞是否表现分化关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为[2]。 二、体外培养细胞的分型 （一）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能接体组织学标推判定，仅大致分成以下四型： 1、成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。 2、上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态[3]。 3、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其
我国大规模细胞培养生物反应器综述 文章比较全面的介绍了我国目前生物反应器的现状,各种品种发酵的特点.提出了反应器的设计要以代 谢流分析为核心,要从系统生物学的角度出发. 1、发展大规模细胞培养及其生物反应器 借助于细胞培养进行各种产品生产已是我国生物技术产业化的重要组成部分，涉及医药、化工、轻工、食品、农业、海洋、环保等行业。培养的细胞不仅只是微生物，用于生物技术产品生产的动物细胞、植物细胞和藻类细胞大规模培养已引起了大家重视，显露出令人鼓舞的前景。而且随着生物技术的发展，在人类今后发现的一切具有生物活性的物质都可以借助于细胞培养方法得到。它们可以是细胞代谢产物、生物转化、酶或某基因表达产物。 此外，随着人类社会经济发展，如果没有基于科技进步的大力开发，能源和资源将难以支撑人类社会进一步发展的目标，人类社会的发展必须将基于碳氢化合物的经济转变为基于碳水化合物的经济。这种能源结构和资源结构的转变将直接关系到我国经济的可持续发展，社会的稳定、和国家安全。解决上述问题的最有效方法就是发展工业微生物，只有工业微生物才能将来源于太阳能的可再生资源碳水化合物转变为现代社会所需要的化工原料和能源。 显而易见，要进行这些产品的生产，无不涉及到细胞代谢与大规模培养研究。为了提高生产水平，除了获得高生产能力的细胞株外，生物反应器是重要的核心技术，必需提供有利于生物过程研究的装置技术和高效节能的生产装置。但是在生物技术产业化平台中，细胞大规模培养技术等中下游技术是我国最薄弱的技术环节之一，以我国生物医药等领域产业化来说，与先进国家的差距是全面的。滞后的一个重要原因之一就是缺乏相配套工艺的工业化放大技术研究和相应的装备技术支撑。例如以哺乳类细胞培养技术来看，西方国家基因工程抗体的开发已经进入大规模细胞反应阶段，细胞工程研究规模已经达到1000L以上，基因工程抗体的生产反应系统最大规模达到20000L以上。相形之下，我国多数药物开发单位的细胞反应规模仍停留在2-30L 规模，100L的培养技术还不稳定，长期以来都是照抄照搬国外的技术和进口国外设备。国内只能生产一些低档装置, 仅靠科研成果模仿和基础科学的跟随。 与其他各行业的装备制造业一样，生物反应器为生物技术产业再生产和扩大再生产提供共性技术和关键技术，它的发展水平也反映了国家在科学技术、工艺设计、材料、加工制造等方面的综合配套能力。装备制造业和商品化的迫切性可以归纳为如下几点： l 每年有大量的从摇瓶到不同大小的实验室生物反应器进行生物技术的实验室研究或中试放大的项目，这些项目有的已购买设备，但需要维修，有的则需新添有关装置。 l 每年有相当数量的生物技术工程项目投入，需要大量的用于生产的生物反应器，传统生物技术的生物反应器一般体积较大（几十M3到上百M3），而现代生物技术所需的反应器装置体积较小，但技术要求高。 l 随着不同产品过程优化与放大技术研究的进展，迫切需要新设计原理的生物反应器发挥作用。由此，必需有不断更新技术的生物反应装置推向市场，或者对现有生物反应器生产装置进行新技术改造，这也是包括制药、食品、轻工在内的传统产业现代生物技术改造的主要内容之一。 l 随着生物技术的发展，需要性能更高的生物反应器，例如哺乳类动物细胞大规模培养是当前高附加值的糖基化活性蛋白医药产品的发展趋势，如何开发适应动物细胞特殊需要的生物反应器并商品化就成为迫切需要
A549细胞的培养 A549细胞为人肺腺癌细胞，属于传代细胞系，可稳定地传代培养。一般用胰酶消化后，加入生长液稀释，以1：2～1：3传代培养都是可行的。 一、 [所需溶液] 1，细胞冲洗液：磷酸盐缓冲液(PBS)——无Ca、Mg NACL 8.00g； KCL 0.20g; KH2PO4 0.20g; Na2HPO4 .。12H2O 1.15g 加水至 1 000mL,将PH调至7.4，高压灭菌。 2，胰酶-PBS消化液 结晶胰酶 2.5g; 高压灭菌后的PBS 1000ml 用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过0.22μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置—20℃保存。 3，细胞培养液：RPMI 1640培养液 二、［细胞的维持和培养］ １，细胞的复苏 （１）准备一个盛有40℃温水的烧杯，从液氮罐中取出存有Ａ５４９细胞的冻存管，放于40℃温水中，用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化（2-3 min）。
（２）在无菌操作台中采用75%的乙醇彻底擦拭冻存管，然后打开冻存管，注意动作要轻柔。 （３）加入10ml以上预热的细胞培养液至25cm2培养瓶中。（４）倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。 （５）8-10h后，更换新的培养液。 （６）常规传代培养。 ２， A549细胞更换新的培养液 （１）无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。 （２）用PBS反复冲洗细胞2～3遍。 （３）加入新鲜的预热好的培养液及10%的胎牛血清。 （４）倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。 ３， A549细胞的传代 （１）无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。 （２）向已经长满的细胞中加入消化液1ml，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有的细胞表面，吸弃或倒掉，轻轻冲洗细胞表面2～3遍，以尽可能去除原培养液中的牛血清。 （３）加入1ml消化液，在室温1-2min后把培养瓶放置在倒置显微镜下观察，发现细胞的胞质回缩、胞间质增大后，立即终止消化。 （４）加入5ml预热至37℃的培养液，用玻璃吸管反复吹打以分散细胞。吹打过程按顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有的底部都被吹到。
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/b414202668.html, 昆虫滞育研究进展 作者：卓德干李照会门兴元等 来源：《山东农业科学》2010年第08期 摘要：昆虫的滞育是对不利环境的适应，受光周期、温度、湿度和食料等因素的影响。滞育期间昆虫体内发生代谢物质积累、能量代谢降低、脂肪和氨基酸含量改变等变化，这－系列复杂的生命活动通过昆虫自身神经及内分泌系统共同响应与整合进行。 关键词：滞育；诱导因素；生理生化基础；内分泌调节 中图分类号：Q965 文献标识号：A 文章编号：1001—4942(2010)08—0086—05 昆虫属变温动物，各种外界环境诸如光照、温度、湿度、水、食料等的不适宜都对昆虫滞育有诱导作用。滞育是昆虫对不利环境条件的一种适应，也是昆虫生活周期与季节变化保持一致的－种基本手段，具有遗传特性。根据滞育特性的不同，滞育通常分为兼性滞育和专性滞育。兼性滞育指多化性昆虫滞育的诱导和解除是由光周期、温度或者两者的变化导致的；专性滞育则是针对－化性昆虫而言，其滞育出现在确定的诱导期和特定的虫龄，滞育的开始独立于环境。研究昆虫滞育对防治害虫、保护益虫有重要意义。本文综述了环境因素(光周期、温度、湿度、食料等)对兼性滞育诱导的影响、昆虫滞育的生理生化基础和滞育的激素调节等。 1 昆虫滞育的诱导因素 1.1光周期 光周期是所有的环境因子中最有规律的，也是预测季节变化最可靠的，因此是大多数昆虫滞育诱导的主要因子。在长日照下发育而在短日照下进入滞育的昆虫种类通常称为长日照型，反之称为短日照型。大多数的昆虫种类分属于这两种类型，例如大草蛉(Chrysopa septempunctata)是短光照诱导滞育型，诱导预蛹滞育的临界光周期处于(10.5L／13.5D)和(11L／13D)之间；有些昆虫的种群则同时存在长日照和短日照的关系，如黑纹粉蝶(P／er／s me／ete Menetries)是以蛹滞育，夏滞育和冬滞育分别被较长日照(>13L／11D)和短日照( 同时，光周期暗期受到光冲击后也会影响有些昆虫的滞育。Fantinou等(1995)对西非蛀茎夜蛾(Sesamia nonagrioldes)幼虫进行的研究发现，当给诱导滞育的光周期(10L/l4D)暗期的前－
实验记录 24/2/2014 一、细胞培养 一、培养基的配制 a. RPMI 1640 1×（with L-glutamine）类培养基组分：RPMI ，10%FBS（胎牛血清），双抗生素（penicillin，盘尼西林（青霉素），streptomycin，链霉素）； 配制方法：500 ml RPMI(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 双抗生素 b. DMEM 1×类培养基组分：DEMI，10% FBS，双抗生素； 配制方法：500 ml DMEM(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 双抗生素 二、培养细胞RNA的提取 1.从培养箱中拿出6孔板（每孔培养2 ml），吸出培养液； 2.PBS清洗；用大枪管吸取PBS加入每个培养孔中（枪头不要触碰培养板，防止交叉污染），用1 ml枪吹匀清洗（把培养板倾斜，吸溶液指最高处打出）。重复以上操作一次。 3. 每孔中加1 ml Trizol ，吸出放-80℃冰箱冷冻。 三、培养细胞DNA的提取 1.从培养箱中拿出6孔板（每孔培养2 ml），吸出培养液； 2.PBS清洗；用大枪管吸取PBS加入每个培养孔中（枪头不要触碰培养板，防止交叉污染），用1 ml枪吹匀清洗（把培养板倾斜，吸溶液至最高处打出）。重复以上操作一次。 3. 向培养板中加酶消化（时间较长，放进培养箱，看到有白色悬浮后取出），取出加DMEM类培养基； 4. 吸出至1.5 ml 离心管，3600 rpm，4 min离心； 5. 吸出上清（不要触及沉淀），加PBS 1ml清洗，3600 rpm，4 min离心； 四、常用细胞系（人） 名称细胞类型来源核型培养液 A431 上皮型表皮细胞肿瘤非整倍体（76，XX）DMEM+10%FBS HeLa 上皮样宫颈癌非整倍体（81-83，XX）MEM+NEAA 10%FBS Hep G2 上皮样肝细胞癌非整倍体（55，XY）MEM+NEAA 10%FBS MEM：极限必需培养液（Eagle）；NEAA：非必需氨基酸；DMEM：Dulbecco’s MEM改良培养液；RPMI：Roswell Park Memorial 研究所；BrdU：5-溴脱氧尿苷；APRI：腺苷磷酸核糖转移酶 实验室除snu系列与国产7721用1640培养基，其它用DMEM培养基。 五、原代培养----肝细胞 1.切除乳鼠肝脏组织放进小烧杯中，用PBS或培养液漂洗2-3次，去除血污； 2.加少量培养液，用剪子把组织剪碎，1 平方mm左右，再用吸管吹打； 3.加含10%小牛血清的1640培养液，制成均匀的细胞悬液，移入培养瓶，将组织块放在培养瓶底部，采用薄层营养液培养法，盖上瓶盖。 4.换液，只将旧的培养液吸弃，换上新的培养基。 六、传代培养 1.显微镜观察是否需要传代 细胞生长良好：上清液清亮，无悬浮物，折光性好，均质而透明，胞膜完整，胞内颗粒少，无空泡和脂滴。细胞生长不良：悬浮物多，发差增大，胞膜不完整，胞质中颗粒多，出现空泡和脂滴。
Sf9培养要点： 温度：27-28摄氏度 pH：，sf9最适的pH6.2，随培养时间的延长，Ph值会增加 传代时间：72h（三天左右） 细胞来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。此细胞系适用于InsectSelect系统。这两株细 （以上来自invitrogen）胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。 细胞特点：规则的带有颗粒球形。贴壁紧。 标准条件的定义： 培养最低密度：0.6×106/ml（健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。活率低于90％细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验）1×106/mL将出现对数生长状态 传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。 贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。形成单层细胞可以传代培养 悬浮培养：在细胞密度达到2.0×106-2.5×106细胞/mL后将密度调整至0.7×106-1.0×106细胞/mL进行悬浮传代。确保传代细胞密度不高于4×106个/mL或保持密度高于1×106个/mL以达到对数生长状态。 Sf9悬浮培养所需要的细胞数 培养基：sf-900 ⅢSFM（添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量） 培养瓶与培养体积： 冻存：一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。细胞需达到90％活率和80-90％融合的要求（如：低代次）推荐冻存几管。当融解细胞，它将会达到最佳使用状态。
1. 用细胞计数板计数细胞。需要足够的如上表所示密度的细胞冻存2-4管。细胞可是悬浮或贴壁培养； 2. 将无菌冻存管立于冰上，做好标记； 3. 室温400-600×g离心10min。移除上清。 4. 以给定的密度在冻存液中重悬细胞； 5. 移取1mL细胞悬液置于无菌冻存管中； 6. 置于-20℃1h，然后移至-80℃24-48h； 7. 储存于液氮中。 转染的细胞：需要的是对数期的细胞＞95%发育能力，可以完成成功的转染。 载氧：对于最优生长条件和蛋白的表达，昆虫细胞要求被动的通氧。积极的通氧系统要求溶氧饱和在10%-50% Sf900II和sf900Ⅲ的区别：一般推荐Sf900II来大量表达蛋白 Sf900II含有表面活性剂（剪切力保护剂（保护细胞在转瓶中培养时不会受到剪切力伤害）） 当设计纯化多聚组氨酸标签蛋白的计划时，注意无血清培养基不能直接用于螯合树脂，因为培养基的成分会除去树脂中的镍离子。
细胞培养技术原理及应用研究进展 姓名：赵鹏学号：158033038 专业：流行病与卫生统计学 摘要：细胞培养是指将采集体内组织的细胞模拟体内生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术，已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法。文章对细胞培养技术的应用作一综述。 关键词：细胞培养；应用；研究进展 细胞是构成机体的基本单位，是生命活动的基本单位。一切有机体（除病毒）都是由细胞组成的。细胞具有独立的、有序的自控代谢体系。因此，对细胞的深入研究是揭开生命奥秘、征服疾病的关键。细胞培养是指将采集体内组织的细胞模拟体内生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术。细胞培养技术的优点是可以直接观察活细胞的形态结构、生命活动及其变化；提供大量生物性状相似的试验对象，特别是研究大型动物（奶牛）时具有耗资少的优点。但模拟体内环境仍与实际有很大的差异，因此利用细胞培养技术的试验结果不可以轻易做出与体内等同的结论。 动物组织（细胞）培养开始于20世纪初，现已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法[1 ]。随着细胞培养技术的不断发展，现在也广泛应用于动物生产研究。20 世纪60 年代，该技术应用于水产动物的病毒分离和纯化，对于鱼类疾病的防治具有重要作用。近年来研究发现单一种子细胞难以完成构建复杂组织的需要，因此产生了联合培养细胞技术。联合培养下的细胞之间存在着精细的相互调控关系，因而更符合仿生学的原理且更有利于种子细胞的增殖与分化，为复杂的细胞诱导分化以及体外组织构建提供了新思路、新方法[2 ]。 1 细胞培养 细胞培养是将活体组织或细胞从试验动物体内取出，放在模拟体内生存环境的体外环境（无菌、适温、营养丰富）中，使高体细胞生长、发育的一种方法。按照培养的结构成分不同，将其分为组织培养、细胞培养及器官培养等。根据细胞是否在支持物上生长，将其分为贴壁型和悬浮型。一般来说，圆形细胞如淋巴细胞属于悬浮型，而胞体梭型（成纤维型细胞）、扁平不规则（上皮型细胞）等属于贴壁型，贴壁型细胞必需贴附在支持物表面生长。细胞培养开始于1906 年，Harrison 用蛙新鲜淋巴液培养蛙胚神经组织4 周，首次成功地利用体外培养液培养神经元，标志着组织细胞的体外培养模式的基本建立。随着细胞培养技术的不断发展和完善，20 世纪50 年代进入繁盛阶段，细胞培养逐渐被基础研究与应用领域所应用，特别是在医学领域得到迅速的发展。目前，细胞培养技术已经涉及到生物学、农业、环境保护等领域[ 3 ]。 目前，在细胞培养过程中，只能根据离体细胞的特点和培养条件，提供满足其生长和发育的一些基本生理条件。必须在无菌条件下进行，细胞感染微生物后，会因被夺营养物质而导致细胞生长缓慢或停滞，甚至死亡。需要提供适宜的温度和pH，一般哺乳动物细胞培养的温度控制在37 ℃，鱼类的温度要低一些。温度过高或过低时，均不利于细胞生长甚至会导致细胞死亡。动物细胞最适宜pH一般控制在7.2~7.4，在此范围细胞生长活跃，增殖速度快，如果过低或过高性，细胞会因为细胞膜受损而死亡。细胞离体培养技术的关键是细胞培养液的设计，理想的细胞培养液可以同时解决细胞离体培养所需要的pH、渗透压、营养物质、调节物质的全部需要。细胞培养液中需含有细胞增殖、生长所需要的各种营养物质。如提供能量的物质（N源、C源）、代谢调节控制的物质（无机盐、维生素、激素）。另外，在细胞培养过程中需要提供一定量的气体（O2和CO2）。CO2具有调节pH和缓冲的作用，一般提供5% CO2。
1.操作台基本要求： 2.随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20℃或-80℃冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。 3.细胞污染： （1）细菌污染
（2）酵母污染 （3）霉菌污染 初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。 （4）病毒污染 一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。 （5）支原体污染 唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE、PCR、免疫染色、放射自显影 4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出 5．适合贴壁的细胞和悬浮的细胞
6.基础培养基，减血清培养基，无血清培养基 7.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4； 成纤维细胞系适合轻度偏碱（pH7.4-7.7） Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长8.温度：大多数人和哺乳动物细胞系在36℃至37℃最佳 昆虫细胞在27℃为最佳 禽类细胞在38.5℃最佳 冷血动物（15℃-26℃） 9.动物细胞形态划分： ●成纤维细胞，贴附生长 ●上皮样细胞呈多角形，贴附 ●淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附 ●特殊形态： ?I型有长突触 ?Ⅱ型没有轴突 10.细胞增长模式
11.何时传代？ ●哺乳动物：生长的PH值通常表示乳酸储积，且有毒性，当PH迅速降低（） 0.1-0.2PH单位），同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。 ●昆虫细胞PH值会上升但不超过6.4 12．贴壁细胞的解离
昆虫研究技术 1. 采集：利用一些工具，将分散各处的昆虫搜集到一起。 诱集：主要在于“引诱”。利用种种手段，将远处的昆虫诱集到一起。 2. 常见的昆虫的采集工具有哪些？ 捕虫网（空网，扫网，水网，马勒氏网），吸虫管，毒瓶，活虫采集盒，采集袋，纸袋， 贝氏漏斗集虫器，放大镜、虫筛、铲子、锯、镊子、毛笔、记录本、刮网、接虫伞等也是常用的。 3. 诱集的方法有哪些？ 灯光诱集，颜色诱集，气味诱集（糖醋诱集，食物诱集，性诱集）4. 昆虫的采集方法归纳哪几个字（8个字）？并解释。 1．找寄主，被害状（破叶、缀叶、断枝、蛀死、虫瘿）、分泌物（虫粪、密露等）及共生现象来搜索采集。 2．听用于具有鸣声、飞行声的大个体。 3．嗅本身具气味的昆虫（橘凤蝶）。 4．扫适用于草丛中或叶面及小枝上昆虫。 5．诱非常有效（灯、食物陷阱井）。 6．吸适用小型、量少的昆虫（飞虱）。 7．震受惊有伪死习性的昆虫（甲虫）。 8. 养饲养。 5.采集昆虫标本时应注意哪些事项？（思考） 1.要求完整及一定数量。 2.应尽量连同寄主一并采集。 3.作好采集时间、地点、海拔、 寄主、习性、为害、小生境等记录。 4.对幼体不能鉴定时，应尽量养至成虫。 5.采集计划应细心设计，到适宜的季节、地点、环境中进行采集。 6.要爱护生物，除去所需要的，不要滥杀乱采，尤其是对分布区狭
窄、数量极少的物种，不要一网打尽。特别是我国的特有种，更应加以保护。 第二章昆虫的饲养方法 1.要获得饲养的成功，取决于哪几个方面？ 虫源、饲料和环境条件3个方面。 2. 饲养的基本类型通常有几种（4种）？ 室外饲养，实验室饲养，大规模饲养，单种饲养 3. 解决饲料途径（有哪几个方面）？ 天然饲料，人工饲料，人工与天然饲料相配合 4. 大规模饲养的用途有哪些？ 昆虫病增殖毒用于生防。 作为家养动物饲料黄粉虫。 繁殖天敌用于田间释放，防治重要农林害虫。 生产不育性昆虫用低剂量射线照射昆虫，使体细胞可忍受，而生殖细胞受损，引起不育。产生不育雄虫与自然界雌虫交配后却无繁殖后代能力-我国不育性松毛虫。 5. 大规模饲养应具备哪些条件？ ①生活周期短；②生物潜能高；③食物需求简单；④特殊用途（虫草等）。 6. 天然饲料、人工饲料的优（特）点有哪些？ 天然食物（寄主）是最原始、简便、有效的饲料。 其特点： 昆虫易接受，饲养昆虫活力高； 受季节、气候和土地等因素的限制； 适合阶段性或季节性饲养-蚜、小菜蛾、二化螟等可室内育苗饲养。 人工饲料优点： A.不受气候、寄主等因子限制，能常年饲养； B.不受寄主、捕食和污染等因子干扰；
新疆农业大学 专业文献综述 题目: 细胞和分子水平上动物细胞培养的研究进展 姓名: 郑峰 学院: 食品科学与药学学院 专业: 食品科学 班级: 13级研究生 学号: 1340020279 成绩： 指导教师: 武运教授 2014年2 月20 日
细胞和分子水平上动物细胞培养的研究进展 摘要：利用动物细胞大规模培养技术可生产多种生物制品，为提高细胞活力和细胞生长密度，采用有多种添加成分的无血清培养基培养细胞，选择既有利于细胞生长又可提高培养细胞密度的微载体和条件温和、易操作、气体交换速度快的生物反应器，在线监控细胞生存环境和生理活动，减少培养过程中培养基的抑制因素，从而给细胞提供更好的生存环境;另外通过向细胞中导入抗凋亡基因，可减缓细胞凋亡的发生，提高细胞活性和蛋白产量，本文从分子水平和细胞水平两方面进行综述。 关键词：动物细胞;培养环境;DNA;微载体 Research advance in large-scale culture of animal cells at the level of Molecule and Single Cell Abstract:Many biological products were manufactured by means of large -scale culture of animal cells. To increase cell-specific productivity and cell density, serum-free media supplemented with several nutriments were used for cell culture, and micro carriers were chosen in favor of cell growth and high cell density. Bioreactors with simple manipulation, good qualification and aeration were adopted. More suitable conditions for cell growth could be given through on-line supervising the environment for cell growth and restraint factors in cell culturing. Furthermore, the anti -apoptosis genes using recombinant DNA technology can increase cell viability and productivity. Porous micro carriers was emphasized in large -scale culture of animal cells. Key words:animal cell; culture environment; DNA; micro carrier 组织培养技术是19世纪末由胚胎学技术衍生而来。近一个世纪以来，从能维持组织存活到生长出新细胞，从少数组织到各种组织细胞的培养，从精细的实验室培养技术到大规模的生产工艺，组织培养技术已成为生物制品生产以及基因工程等领域必不可少的工具之一。目前，动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、细胞培养环境的优化、生物反应器的改良、改变细胞特性、提高产品的产出率与保证其质量上。在动物细胞大规模培养的过程中，最根本的是使细胞的培养条件达到最优化，尽可能消除或减轻环境对细胞的
昆虫细胞表达系统 昆虫细胞表达系统是四大表达系统（昆虫细胞、细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统）之一。昆虫细胞表达系统原理是通过转座作用将转移载体中的表达组件定点转座到能在大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体（Bacmid）上，通过抗性和蓝白斑筛选到重组穿梭质粒，提取穿梭质粒DNA转染昆虫细胞后，得到的子代病毒即为重组病毒。将病毒上清浸染昆虫细胞，获得表达的重组蛋白。 杆状病毒是一类闭合环状双链病毒，病毒粒子呈杆状，以昆虫为主要宿主。杆状病毒还是一种出芽型分泌性病毒粒子，在感染细胞后能迅速在培养细胞中水平传播而保持细胞在相当长的时间内不裂解，从而最大限度地保持了外源蛋白的稳定，昆虫细胞表达系统又被称为昆虫杆状病毒系统。昆虫细胞表达系统本身是一个蛋白裂解性系统，在杆状病毒感染昆虫细胞的过程中，杆状病毒可以编码一些蛋白酶如木瓜蛋白酶等导致蛋白的降解。因此，收集细胞后，在裂解细胞之前要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白的降解。 昆虫细胞表达系统属于真核细胞表达系统，但又不同于酵母及哺乳动物细胞表达系统，酵母表达的蛋白易纯化但也易降解，而哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白具有生物活性但成本高。细菌表达系统属于原核表达系统，操作简单、周期短收益大、表达产物稳定，但是表达基因的相对分子量有限，且不能对表达产物进行翻译后加工修饰。而昆虫细胞表达系统具有很多优点： (1)具有糖基化作用、乙酰化作用、磷酸化作用等一系列蛋白质翻译加工修饰系统； (2)正确的蛋白折叠、二硫键形成，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白，有利于表达产物形成天然的高级结构； (3)具有对重组蛋白进行定位的功能，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等；
昆虫天然免疫的研究进展 摘要：昆虫是目前地球陆地上最繁盛的物种类群，是人类取之不尽的资源宝库。近年来，昆虫的免疫在其基础和应用研究方面受到极大关注，通过实验来研究与昆虫免疫相关的机制、信号等问题，对害虫防治、益虫防病、开发利用抗菌物、研究人类免疫机制等有着非常重要的现实意义。 关键词: 昆虫；天然免疫；体液免疫；细胞免疫 Abstract：At present, insect is the most blooming species on the earth. And it is also a treasure-house of kinds of resources for humanity. For the past few years, the fundamental researches and application researches of insect immunity have been paid close attention to. Many scientific researchers study the mechanism and signal that related to insect’s immunity by doing experiments. It is of significance for pest control, preventing disease of beneficial insect, developing and using antibacterial material, studying humanity immunity and so on. Key words: Insect；Innate immunity；Humeral immunity；Cellular immunity 昆虫作为生物界分布最广、数量众多的一类群体, 在长期的进化过程中具备了高度的适应能力和独特的免疫体系。虽然昆虫没有像人一样的获得性免疫反应能力，但是昆虫拥有高效的先天性免疫反应系统。昆虫的先天性免疫系统包括体液免疫和细胞免疫两部分, 它们协同作用吞噬和清除血淋巴中的外源入侵物。[冯从经，陆剑锋，黄建华，等，2009]本文主要基于目前对昆虫天然免疫的研究进展做一简介。 1．体液免疫 1.1抗菌肽 抗菌肽（AMPs），具有广谱抗菌活性和高效杀菌性，一直以来都承载着人类的一个梦想——取代抗生素。人类已经发现多种抗菌肽，测定出其结构，并获得抗菌肽基因，如Mdatta2基因[柳峰松，孙玲玲，唐婷，等，2011]、MdDpt基因[柳峰松，王丽娜，唐婷，等，2009]。根据氨基酸组成和结构特征, 一般可以把昆虫抗细菌肽分为 4类：即形成两性分子α-螺旋的抗细菌肽类、有分子内二硫桥的抗细菌肽类、富含脯氨酸的抗细菌肽类及富含甘氨酸的抗细菌多肽类。[柳峰松，王丽娜，唐婷，李伟，2009]昆虫抗菌肽中除绝大多数对细菌具有广谱高效的抑杀作用外, 近 10 年来也陆续发现了10多种抗真菌肽。昆虫抗真菌肽可分成两类: 昆虫组成性抗真菌肽、经免疫诱导在血淋巴中产生的抗真菌肽, 即昆虫免疫诱导型抗真菌肽[谢咸升，董建臻，李静，等，2011]。 AMPs 的产生主要由以下两个不同信号转导途径的活化而产生的: Toll途径和Imd途径，这两种途径通过激活不同的转录因子来调控不同AMPs 的基因表达。[王英，黄复生，2008]昆虫抗菌肽既具有种的差异性,又具有一定的同源性,抗菌物质在昆虫中普遍存在,可能是昆虫—植物—病原菌长期协同进化在免疫学上的体现,可以作为抗性资源利用[谢咸升，李静，董建臻，等，2009]。但是目前对抗菌肽作用机制仍需进一步研究，面对病原菌抗药性的升级, 抗菌肽及其基
细胞培养基础知识 细胞培养基本条件 1、合适的细胞培养基 合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。 2、优质血清 目前，大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。 3、无菌无毒细胞培养环境 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。 4、恒定的细胞生长温度 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。 5、合适的气体环境 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。 细胞培养基种类与基本成分 细胞培养基的种类很多，按其来源分为合成培养基和天然培养基（目前使用的培养基绝大部分是合成培养基），按其物质状态分为干粉培养基和液体培
养基两类。干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌，液体培养基由专业商家提供，用户可直接使用，非常方便。 1、合成培养基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质： 氨基酸 氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺。 碳水化合物 碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。 无机盐 培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg ～320 mOsm/kg。标准培养液的渗透压在此范围内波动。特别注意：向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压，特别是溶于强酸或强碱中的物质。向培养液中添加HEPES 时需按以下方法调节钠离子浓度。
多克隆细胞系的研究价值 J6-1人白血病细胞系30年的研究 【摘要】 J6-1细胞系是我国建立的第一株人白血病细胞系，是EBV和HHV-6双重感染的多克隆细胞系。J6-1细胞系建系30年来，从J6-1细胞克隆了许多细胞因子、受体及其他基因，提供了许多有关白血病细胞性质和功能的信息，从而衍生出多项研究课题，而所有这些显示出多克隆细胞系特有的研究价值。本文就30年来J6-1人白血病细胞系的研究作一评述，包括J6-1细胞系的异质性和多克隆性，J6-1细胞群体的生存机制和J6-1细胞系的异常细胞间通讯及其意义，以及J6-1细胞系的启示。 【关键词】白血病细胞系、细胞克隆 Research Value of Multi clone Cell Line： A Comment for the 30th Anniversary of J6 1 Human Leukemic Cell Line ——Editorial Abstract J6-1 cell line is the first leukemic cell line established in China. It is a multi clone cell line infected with both EBV and HHV-6. Many cytokines, receptors and other genes were cloned from J6-1 cell line since its establishment 30 years ago. Valuable information on leukemic characteristics and functions were obtained from the studies on this cell line, which could be categorized into several research subjects. These achievements implied the unique research value of multi clone cell lines.This comment focuses attention on research advance of the J6-1 leukemic cell line in 30 years, including heterogeneity and multi cloning of J60-1 cells, survival mechanism of J6-1 cell populations, abnormal intercellalar communication of J6-1 cells with its significance and inspiration from J6-1 cell line. Key words leukemic cell line; multi clone cell line; herpes virus infection; leukemic cells characterization、Cells cloned J6-1细胞系为EBV和人类疱疹病毒 6型(HHV-6)双重感染的多克隆细胞系，30年来J6-1细胞系提供了大量有关白血病细胞性质和功能的信息，在长期研究中我们体会到多克隆细胞系有其独特的性质，应该继续发挥其研究价值。J6-1细胞系的研究带动了对于白血病等一系列疾病的治疗，在疾病治疗领域奠定了一定的基础。 1、J6-1细胞系的异质性和多克隆性 1.1 J6-1细胞系的异质性
实用哺乳动物细胞培养手册 细胞培养基本概念 细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可以是细胞群。 细胞培养目的与用途 1、科学研究：药物研究开发与基础研究 药物研究与开发 (1) 新药筛选：如化学合成药物药效研究、中药有效成分筛选与鉴定等。 (2) 疫苗研究与开发：如病毒性疫苗的研究与开发（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。 (3) 基因工程药物研究与开发：如干扰素研究与开发，细胞生长因子研究与开发等。 (4) 细胞工程药物研究与开发：生物活性多肽研究与开发，人参皂甙、紫杉醇等生物活性成分研究与开发。 (5) 单克隆抗体制备：包括诊断用单克隆抗体，治疗用单克隆抗体。 基础研究 (1) 药物作用机理 (2) 基因功能 (3) 疾病发生机理 2、生物制药 (1) 疫苗生产：如病毒性疫苗（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。 (2) 基因工程药物生产：如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素、粒细胞生长因子、胸腺肽等 (3) 诊断用和药用单克隆抗体生产 (4) 细胞工程药物生产：生物细胞内的一些生物活性多肽，生物活性物质等 细胞培养基本条件 1、合适的细胞培养基 合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。 2、优质血清 目前，大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。 2 3、无菌无毒细胞培养环境 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。 4、恒定的细胞生长温度
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养 一、实验目的 了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。 二、常用细胞的种类 BHK-21：仓鼠肾传代细胞 PK-15：猪肾传代细胞 IBRS-2：猪肾传代细胞 Hela：人的子宫瘤细胞 Vero：非洲绿猴肾细胞 Marc-145：来源于Vero细胞 TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞 Sf9：昆虫细胞 三、材料 1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头 2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞 3、0.25%胰酶 4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM
5、伪狂犬病病毒液（PRV） 四、传代细胞培养的条件要求 1）细胞密度：2-3×105个/ml 2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3）培养温度 哺乳动物细胞一般为37℃ 昆虫细胞28-30℃ 五、常用细胞分散剂与作用原理 1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解， 导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。 2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。 3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽 酶的混合物。 六、营养液 1、人工综合营养液 氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。 2、血清 1）血清的种类 胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。 2）血清的处理