细胞培养实验技术大全 第一章细胞培养的基本原理与技术 现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。 第一节体外培养的概念 一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。 组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。 细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。 器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。 二、体内、外细胞的差异和分化 1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。 2、分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。 第二节细胞培养的一般过程 一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。 二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则
Sf9培养要点： 温度：27-28摄氏度 pH：，sf9最适的pH6.2，随培养时间的延长，Ph值会增加 传代时间：72h（三天左右） 细胞来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。此细胞系适用于InsectSelect系统。这两株细 （以上来自invitrogen）胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。 细胞特点：规则的带有颗粒球形。贴壁紧。 标准条件的定义： 培养最低密度：0.6×106/ml（健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。活率低于90％细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验）1×106/mL将出现对数生长状态 传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。 贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。形成单层细胞可以传代培养 悬浮培养：在细胞密度达到2.0×106-2.5×106细胞/mL后将密度调整至0.7×106-1.0×106细胞/mL进行悬浮传代。确保传代细胞密度不高于4×106个/mL或保持密度高于1×106个/mL以达到对数生长状态。 Sf9悬浮培养所需要的细胞数 培养基：sf-900 ⅢSFM（添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量） 培养瓶与培养体积： 冻存：一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。细胞需达到90％活率和80-90％融合的要求（如：低代次）推荐冻存几管。当融解细胞，它将会达到最佳使用状态。
1. 用细胞计数板计数细胞。需要足够的如上表所示密度的细胞冻存2-4管。细胞可是悬浮或贴壁培养； 2. 将无菌冻存管立于冰上，做好标记； 3. 室温400-600×g离心10min。移除上清。 4. 以给定的密度在冻存液中重悬细胞； 5. 移取1mL细胞悬液置于无菌冻存管中； 6. 置于-20℃1h，然后移至-80℃24-48h； 7. 储存于液氮中。 转染的细胞：需要的是对数期的细胞＞95%发育能力，可以完成成功的转染。 载氧：对于最优生长条件和蛋白的表达，昆虫细胞要求被动的通氧。积极的通氧系统要求溶氧饱和在10%-50% Sf900II和sf900Ⅲ的区别：一般推荐Sf900II来大量表达蛋白 Sf900II含有表面活性剂（剪切力保护剂（保护细胞在转瓶中培养时不会受到剪切力伤害）） 当设计纯化多聚组氨酸标签蛋白的计划时，注意无血清培养基不能直接用于螯合树脂，因为培养基的成分会除去树脂中的镍离子。
实验记录 24/2/2014 一、细胞培养 一、培养基的配制 a. RPMI 1640 1×（with L-glutamine）类培养基组分：RPMI ，10%FBS（胎牛血清），双抗生素（penicillin，盘尼西林（青霉素），streptomycin，链霉素）； 配制方法：500 ml RPMI(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 双抗生素 b. DMEM 1×类培养基组分：DEMI，10% FBS，双抗生素； 配制方法：500 ml DMEM(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 双抗生素 二、培养细胞RNA的提取 1.从培养箱中拿出6孔板（每孔培养2 ml），吸出培养液； 2.PBS清洗；用大枪管吸取PBS加入每个培养孔中（枪头不要触碰培养板，防止交叉污染），用1 ml枪吹匀清洗（把培养板倾斜，吸溶液指最高处打出）。重复以上操作一次。 3. 每孔中加1 ml Trizol ，吸出放-80℃冰箱冷冻。 三、培养细胞DNA的提取 1.从培养箱中拿出6孔板（每孔培养2 ml），吸出培养液； 2.PBS清洗；用大枪管吸取PBS加入每个培养孔中（枪头不要触碰培养板，防止交叉污染），用1 ml枪吹匀清洗（把培养板倾斜，吸溶液至最高处打出）。重复以上操作一次。 3. 向培养板中加酶消化（时间较长，放进培养箱，看到有白色悬浮后取出），取出加DMEM类培养基； 4. 吸出至1.5 ml 离心管，3600 rpm，4 min离心； 5. 吸出上清（不要触及沉淀），加PBS 1ml清洗，3600 rpm，4 min离心； 四、常用细胞系（人） 名称细胞类型来源核型培养液 A431 上皮型表皮细胞肿瘤非整倍体（76，XX）DMEM+10%FBS HeLa 上皮样宫颈癌非整倍体（81-83，XX）MEM+NEAA 10%FBS Hep G2 上皮样肝细胞癌非整倍体（55，XY）MEM+NEAA 10%FBS MEM：极限必需培养液（Eagle）；NEAA：非必需氨基酸；DMEM：Dulbecco’s MEM改良培养液；RPMI：Roswell Park Memorial 研究所；BrdU：5-溴脱氧尿苷；APRI：腺苷磷酸核糖转移酶 实验室除snu系列与国产7721用1640培养基，其它用DMEM培养基。 五、原代培养----肝细胞 1.切除乳鼠肝脏组织放进小烧杯中，用PBS或培养液漂洗2-3次，去除血污； 2.加少量培养液，用剪子把组织剪碎，1 平方mm左右，再用吸管吹打； 3.加含10%小牛血清的1640培养液，制成均匀的细胞悬液，移入培养瓶，将组织块放在培养瓶底部，采用薄层营养液培养法，盖上瓶盖。 4.换液，只将旧的培养液吸弃，换上新的培养基。 六、传代培养 1.显微镜观察是否需要传代 细胞生长良好：上清液清亮，无悬浮物，折光性好，均质而透明，胞膜完整，胞内颗粒少，无空泡和脂滴。细胞生长不良：悬浮物多，发差增大，胞膜不完整，胞质中颗粒多，出现空泡和脂滴。
1.操作台基本要求： 2.随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20℃或-80℃冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。 3.细胞污染： （1）细菌污染
（2）酵母污染 （3）霉菌污染 初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。 （4）病毒污染 一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。 （5）支原体污染 唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE、PCR、免疫染色、放射自显影 4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出 5．适合贴壁的细胞和悬浮的细胞
6.基础培养基，减血清培养基，无血清培养基 7.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4； 成纤维细胞系适合轻度偏碱（pH7.4-7.7） Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长8.温度：大多数人和哺乳动物细胞系在36℃至37℃最佳 昆虫细胞在27℃为最佳 禽类细胞在38.5℃最佳 冷血动物（15℃-26℃） 9.动物细胞形态划分： ●成纤维细胞，贴附生长 ●上皮样细胞呈多角形，贴附 ●淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附 ●特殊形态： ?I型有长突触 ?Ⅱ型没有轴突 10.细胞增长模式
11.何时传代？ ●哺乳动物：生长的PH值通常表示乳酸储积，且有毒性，当PH迅速降低（） 0.1-0.2PH单位），同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。 ●昆虫细胞PH值会上升但不超过6.4 12．贴壁细胞的解离
昆虫细胞表达系统 昆虫细胞表达系统是四大表达系统（昆虫细胞、细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统）之一。昆虫细胞表达系统原理是通过转座作用将转移载体中的表达组件定点转座到能在大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体（Bacmid）上，通过抗性和蓝白斑筛选到重组穿梭质粒，提取穿梭质粒DNA转染昆虫细胞后，得到的子代病毒即为重组病毒。将病毒上清浸染昆虫细胞，获得表达的重组蛋白。 杆状病毒是一类闭合环状双链病毒，病毒粒子呈杆状，以昆虫为主要宿主。杆状病毒还是一种出芽型分泌性病毒粒子，在感染细胞后能迅速在培养细胞中水平传播而保持细胞在相当长的时间内不裂解，从而最大限度地保持了外源蛋白的稳定，昆虫细胞表达系统又被称为昆虫杆状病毒系统。昆虫细胞表达系统本身是一个蛋白裂解性系统，在杆状病毒感染昆虫细胞的过程中，杆状病毒可以编码一些蛋白酶如木瓜蛋白酶等导致蛋白的降解。因此，收集细胞后，在裂解细胞之前要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白的降解。 昆虫细胞表达系统属于真核细胞表达系统，但又不同于酵母及哺乳动物细胞表达系统，酵母表达的蛋白易纯化但也易降解，而哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白具有生物活性但成本高。细菌表达系统属于原核表达系统，操作简单、周期短收益大、表达产物稳定，但是表达基因的相对分子量有限，且不能对表达产物进行翻译后加工修饰。而昆虫细胞表达系统具有很多优点： (1)具有糖基化作用、乙酰化作用、磷酸化作用等一系列蛋白质翻译加工修饰系统； (2)正确的蛋白折叠、二硫键形成，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白，有利于表达产物形成天然的高级结构； (3)具有对重组蛋白进行定位的功能，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等；
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养 一、实验目的 了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。 二、常用细胞的种类 BHK-21：仓鼠肾传代细胞 PK-15：猪肾传代细胞 IBRS-2：猪肾传代细胞 Hela：人的子宫瘤细胞 Vero：非洲绿猴肾细胞 Marc-145：来源于Vero细胞 TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞 Sf9：昆虫细胞 三、材料 1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头 2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞 3、0.25%胰酶 4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM
5、伪狂犬病病毒液（PRV） 四、传代细胞培养的条件要求 1）细胞密度：2-3×105个/ml 2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3）培养温度 哺乳动物细胞一般为37℃ 昆虫细胞28-30℃ 五、常用细胞分散剂与作用原理 1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解， 导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。 2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。 3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽 酶的混合物。 六、营养液 1、人工综合营养液 氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。 2、血清 1）血清的种类 胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。 2）血清的处理
昆虫的一般形态特征教案 一、说教材 教材：高等教育出版社出版的《植物保护技术》第二版 “实验实训1.昆虫的一般形态特征”。 （一）地位和作用： 1、通过实验观察进一步认识昆虫体躯的组成及附器。 2、复习和巩固昆虫口器、触角、足、翅的构造及类型。 3、为鉴别昆虫打下坚实的基础。 （二）教学目标分析 1、知识目标 （1）认识昆虫体躯外部形态结构和特征。 （2）理解昆虫口器、触角、足、翅的各部分构造和作用。 （3）掌握昆虫的口器、触角、足、翅的基本类型。 2、能力目标 （1）学会观察昆虫的外部形态。 （2）培养学生合作学习的能力。 3、德育目标 发展学生的科学探究能力，培养学生对自然和社会的责任感。 （三）教学重难点 1、认识昆虫体躯外部形态结构和特征。 2、掌握昆虫口器、触角、足、翅的结构及类型，特别是触角类型繁多，学生不容 易掌握，则是教学难点。 二、说教法： 1、借助多媒体弥补实验过程中不容易观察到部分结构，如把昆虫的体躯放大,蜜蜂的 触角放大，蝴蝶的翅放大、蝗虫的后足放大、蝗虫的口器放大，通过感官和视觉， 把抽象变为具体，把难以理解的内容用多媒体展现出来，调动学生的直观功能，对 突破难点创造了良好的氛围，真正达到了对触角、口器、足、翅的结构的理解。 2、利用多媒体的趣味性，吸引学生的注意力。 1）、触角的类型部分，通过学生观察后回答，答对一个给一个动画笑脸，答错一 个给一个动画哭脸，体现多媒体的趣味性特点，这集中了学生的注意力，激发了学 生的学生兴趣和好奇心。培养了学生的创造性思维。 2）、对于昆虫的足、翅的类型，学生观察后，答对一个就把该类型的图片展现 出来，把无声的教学内容，变得有声有色，有静有动，带学生进入教学的情景 之中，使学生对学习内容产生极大的情趣，自然的步入积极的思维状态中。三、说学法 （１）课前准备 组织学生外出捕捉昆虫，要求学生在家附近搜集昆虫，由于学生个人的兴趣、经验、所处环境不同，学生搜集到的昆虫种类、数量不同，这就为学生提供了一 个广阔的空间，形成了开放性的学习过程。同时，这一阶段的学习具有很强的灵 活性，为本节课教学作好了充分的准备。 （２）教学实验 利用搜集到的昆虫材料，认识、辨别、分析昆虫各部分结构及分类，这就让
细胞培养基础知识 细胞培养基本条件 1、合适的细胞培养基 合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。 2、优质血清 目前，大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。 3、无菌无毒细胞培养环境 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。 4、恒定的细胞生长温度 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。 5、合适的气体环境 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。 细胞培养基种类与基本成分
细胞培养基的种类很多，按其来源分为合成培养基和天然培养基（目前使用的培养基绝大部分是合成培养基），按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基两类。干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌，液体培养基由专业商家提供，用户可直接使用，非常方便。 1、合成培养基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质： 氨基酸 氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应臵于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺。 碳水化合物 碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。 无机盐 培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg ～320
实用哺乳动物细胞培养手册 细胞培养基本概念 细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可以是细胞群。 细胞培养目的与用途 1、科学研究：药物研究开发与基础研究 药物研究与开发 (1) 新药筛选：如化学合成药物药效研究、中药有效成分筛选与鉴定等。 (2) 疫苗研究与开发：如病毒性疫苗的研究与开发（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。 (3) 基因工程药物研究与开发：如干扰素研究与开发，细胞生长因子研究与开发等。 (4) 细胞工程药物研究与开发：生物活性多肽研究与开发，人参皂甙、紫杉醇等生物活性成分研究与开发。 (5) 单克隆抗体制备：包括诊断用单克隆抗体，治疗用单克隆抗体。 基础研究 (1) 药物作用机理 (2) 基因功能 (3) 疾病发生机理 2、生物制药 (1) 疫苗生产：如病毒性疫苗（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。 (2) 基因工程药物生产：如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素、粒细胞生长因子、胸腺肽等 (3) 诊断用和药用单克隆抗体生产 (4) 细胞工程药物生产：生物细胞内的一些生物活性多肽，生物活性物质等 细胞培养基本条件 1、合适的细胞培养基 合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。 2、优质血清 目前，大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。 2 3、无菌无毒细胞培养环境 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。 4、恒定的细胞生长温度
实验一传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养 一、实验目的 了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。 二、常用细胞的种类 BHK-21：仓鼠肾传代细胞、PK-15：猪肾传代细胞、IBRS-2：猪肾传代细胞、Hela：人的子宫瘤细胞、Vero：非洲绿猴肾细胞、Marc-145：来源于Vero细胞、Sf9：昆虫细胞。 三、材料 1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头 2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞 3、0.25%胰酶 4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 四、传代细胞培养的条件要求 1）细胞密度：2-3×105个/ml 2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3）培养温度 哺乳动物细胞一般为37℃ 昆虫细胞28-30℃ 五、常用细胞分散剂与作用原理 1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解， 导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。 2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。 3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽 酶的混合物。 六、营养液 1、人工综合营养液 氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2、血清 1）血清的种类 胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。 2）血清的处理 无菌采集，过滤除菌。用前56℃灭活30min。 七、传代细胞系培养 1、优点：1) 可以无限的传代。 2) 不少细胞系对病毒很敏感。 3) 某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。 4) 生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。 2、缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。 细胞培养 步骤： ①取长满单层的细胞一瓶，掉到培养液。 ②加入2ml胰酶消化液，置于37℃培养几分钟（也可以轻轻吹打几下），直到细胞间出现空隙或细胞变圆后倒掉消化液。（目的就是让细胞脱离贴壁状态，但不掉下来） ③加入生长液，吹打几次，使细胞分散成单个细胞（两三个聚集一起这种程度就好），然后分装于3个小瓶中，在每个瓶中补充生长液至10ml。 注意：胰酶消化不能太长（此时细胞大量脱离，会造成细胞损失，后面加生长液吹打时也不容易分散成单个细胞，容易成块，培养后长得不光滑） 细胞冻存 冻存液：现在一般用二甲亚砜，也可以用甘油。 步骤： 1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液； 2. 取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。
第一章：细胞组织培养的三种类型？ 原代外植块培养：是从人或动物体内取出一小块组织，模拟体内生理环境，在保证无菌、适宜温度和营养条件下，使之生存和生长并保持其结构和功能的方法。 器官培养：指的是应用和组织培养相似的条件，培养的是器官的原基或器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。 细胞培养：是以相似的培养方法体外培养单个细胞或单一细胞群，使其在适宜条件下生长并保持细胞特性。 第二章 1.体内体外的环境不一样，细胞之间的粘附是通过什么实现的？ 细胞的黏附是通过特异的细胞表面受体与细胞外基质分子结合实现的。 在细胞铺展之前，细胞已分泌了细胞外基质蛋白和蛋白聚糖。细胞外基质先黏着到带电底面上，然后再通过特异的受体附着到基质上。 因此，细胞曾经生长过的玻璃或塑料表面更适合细胞附着，用基质成分，如纤连蛋白、胶原或其衍生物（如明胶）预处理培养器皿，有利于要求复杂培养条件的细胞附着和增殖。 主要有四类跨膜蛋白参与了细胞与细胞、细胞与底物的黏附。 不依赖Ca2+的细胞间黏附分子介导同种或异种细胞与细胞粘附 依赖Ca2+的钙黏着蛋白参与同源细胞间的相互作用 整合蛋白，介导细胞与基质之间的相互作用，是基质分子 跨膜的蛋白聚糖，能和基质成分如其他蛋白聚糖或胶原相互作用，具有稳定、活化和把生长因子转运到高亲和性受体上的作用。2.细胞外基质成分及作用？ 细胞外基质（ECM）由胶原、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、透明质酸酶、蛋白多糖及膜结合生长因子（或细胞因子）等各种成分组成。ECM能提高细胞的生存、增殖和分化能力3.概念，接触抑制：细胞在生长过程中达到相互接触时运动停止，同时细胞质膜褶皱减少，最终细胞分裂停止。 4.诱导细胞分化的条件？ 有助于诱导细胞分化的条件： 细胞密度高 细胞与细胞、细胞与基质之间作用强 培养基中存在各种分化因子 5.细胞信号传递的类型？ 体内细胞的增殖、迁移、分化、凋亡均受细胞间、细胞与基质间相互作用及营养条件和激素等信号分子的调控。 体内细胞信号传递的类型有： 自分泌：由细胞自身合成并通过与自身受体结合作用于细胞自身。 内分泌：信号分子通过体内脉管系统从一种细胞转移到另一种组织细胞中发挥作用的过程 同型（旁）分泌：某些细胞分泌的可溶性信号物质作用于同类型细胞。 异型旁分泌：同一细胞类型分泌的信号物质作用于不同的反应蛋白 旁分泌：不通过血液而直接作用于邻近细胞的方式 体内都存在这些类型的细胞信号传递方式，而在体外，在具有基本培养基的常规条件下，只有自分泌和同型分泌两种方式。 6.细胞传代分为哪三个阶段？ 原代培养期：从体内取出组织，接种培养到第一次传代阶段（初代培养） 1-4周、细胞呈活跃的移动、可见细胞分裂、形态结构和功能活动上与体内原组织相似性大、多呈二倍体核型 细胞群是异质的，细胞克隆形成率很低，即细胞独立生存性差。 传代期：初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存（10代内）。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期，即有限细胞系。 衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，细胞很难长满培养空间；
细胞说明书 一、细胞名称：HaCaT 二、货号：BNCC101683 三、生长特性：■贴壁□悬浮□半悬浮半贴壁 四、细胞生长条件： 五、组成： 六、细胞接收后的操作流程与注意事项 1. 细胞收到后建议在培养箱稳定4小时左右再依据细胞密度，换液培养或传代。 2. 如果细胞为贴壁细胞，而收到时呈悬浮或者部分悬浮的状态，请将悬浮的细胞及时离心，加15%血清的完全培养基到新的培养皿/瓶中继续培养3天；同时原培养瓶中剩下的贴壁细胞更换为15%血清的完全培养基，培养2-3天。若3天后细胞都没有出现增殖而是继续脱落死亡，请及时联系实验室，技术人员会跟进解决。 3. 贴壁细胞生长缓慢：适当提高血清浓度（最高不超过20%），或可根据该细胞生长密度，考虑胰酶消化后，转移到新的培养瓶继续培养。 4. 生长不均：贴壁细胞若出现生长不均，成岛状生长，可将细胞进行消化，重新打散细胞，加入新鲜培养基进行培养。 七、细胞常规培养传代流程（请严格遵守无菌操作） 1. 吸出原培养瓶中的培养基，PBS缓冲液润洗细胞两次，加1~2 ml 0.25% EDTA的胰酶消化（注意把握消化时间，通常控制在1~2min）。 2. 镜下观察消化情况，在细胞边缘缩小，贴壁运动时（不建议消化到细胞漂浮）去掉胰酶，加6~8ml 完全培养基，轻轻吹打细胞层，尽量把细胞层吹落、吹散。 3. 取出部分细胞悬液转移到新的培养皿/瓶中，添加适当的完全培养基，于培养箱中培养。 4. 注意培养基PH值变化情况，定期换液，待细胞密度达到70-80%时重复传代操作或者冻存。 特别注意：（如使用公共实验室或初次接触细胞培养，建议添加双抗培养） 1. 收到细胞后请尽快更换为含10% FBS的新鲜培养基，不建议使用原瓶中运输用培养基。 2. 如签收时出现培养瓶壁破裂，漏液等情况请及时拍照并联系实验室。 3. 细胞任何售后问题，均需拍照存档并及时联系客服。
https://www.doczj.com/doc/b610632220.html, sf9昆虫细胞 货号基因名称规格货期 huayueyang-531sf9昆虫细胞1ml 现货 细胞描述： Sf9昆虫细胞，可以用来包装扩增杆状病毒并表达蛋白。Sf9昆虫细胞增殖能力取决于培养技术、培养条件等综合因素。请按照正确的培养方法来复苏、传代，以此保证细胞具备良好的增殖能力，方便您的后继研究顺利进行。 质量控制： 本细胞经过严格的质量检测，不含有细菌、真菌、病毒（HIV、HBV、HCV）和支原体等。 培养条件： 27℃，PH值7.2~7.4，120–140rpm，无菌恒温培养。 用途： 本产品仅供科研使用，不可用于治疗等其他用途。 细胞相关操作： sf9细胞复苏 1.37°C水浴预热培养基； 2.从液氮中取出细胞放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）； 3.在超净台中加入5ml的培养基重悬细胞，1000rpm离心5min； 4.4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞，用血小球计数板进行细胞计数，按细胞密度3-5×105/ml接种到25ml无菌摇瓶中（带空气过滤通气孔的摇瓶）； 5.摇瓶置于27°C培养箱中的摇瓶架上，120–140rpm培养。 sf9细胞传代 1.取细胞计数(详见sf9细胞冻存)，当细胞密度达到1–3×106/ml时，可传代； 2.37°C水浴预热培养基； 3.在超净台中，加适量预热好的培养基到无菌摇瓶中，以细胞终密度为3-5×105/ml接种细胞（也可1000rpm，5min离心后弃上清，用预热好的培养基重悬并调整细胞密度为3-5×105/ml）； 4.摇瓶置于27°C培养箱中的摇瓶架上，120–140rpm培养。 注：昆虫细胞对氧的要求较高，因此，悬浮培养必须具有高表面积体积比，否则细胞的生长会受到抑制。培养基的体积不能超过摇瓶的五分之二；即100毫升的摇瓶不能超过40ml培养基，250ml摇瓶不能超过100ml培养基。
实验一昆虫外部形态 特征
一昆虫解剖镜的构造和使用 解剖镜、双目解剖镜又称体视显微镜、立体显微镜、实体显微镜等。其形式虽然多种多样，但结构基本一致现以22XB—01型解剖镜为例介绍如下。【目的】1.掌握解剖镜的基本构造和使用方法 【材料】解剖镜 【用具】 【内容和方法】 一、解剖镜的构造和功能 （一）机械部分 1．底座是全镜的最下面的部分。在底座的中央有1个可活动的圆盘，即载物盘。载物盘通常为一面为白色，一面为黑色，也有的为通明的玻璃制 成。在底座的中后部有1对压脚，用以压虫体和其它易动物体之用。 支柱是支持镜体的部件，是焦距的粗调装置，可使镜体上下移动，左右旋转。 ２．调焦装置为了避免镜身向下滑动和左右偏转，在支柱的上部和下部分别装了两个螺丝。上方的为锁紧螺丝下方的为升降螺丝。 ３．倍率盘在镜体中央，有1个两侧转动的圆盘，用以改变放大倍率之用。
双目解剖镜构造图 （二）光学部分 1. 物镜在镜体下，安装有大物镜（镜体内部还有变倍物镜）。 2．棱镜罩镜身上面为两个棱镜罩，内部为棱镜，使物象倒转，在目镜中可看到物体的正像。 3．目镜管和目镜在棱镜罩的上方，左右各有一个目镜管，用以承放目镜4．视觉圈一般是位于右边的目镜管上端。视觉圈可调节目镜的上下距离，使得观察者左右两眼都可以看到清晰物体。 5．眼罩，为了防止外来光线的干扰，多在目镜上设有眼罩，便于更好地进行观察。 6．防尘罩有些型号解剖镜带有防尘罩，使用前后均放在目镜管上端。 二、解剖镜的使用方法和注意事项
1．在取用（或者放回解剖镜）时，若需要连镜箱搬动，应将镜箱锁好，以免解剖镜零件倾出而损坏。同时镜箱的钥匙必须拔除，避免不小心将钥匙碰断在锁孔里。 2．取用解剖镜时，必须用右手握持柱，右手托住底座，小心平稳地取出或移动，严禁单手取用或移动。 3．使用前必须检查附件是否有无缺少及镜体各部有无害损坏，转动升降螺丝有无故障，若有问题立即报告，否则自己负责。 4．镜管上若有防尘罩，应取下防尘罩换上目镜，再将眼罩放在目镜的上端。注意用完后再将防尘罩放回目镜管上。 5．将所观察的物体置于玻片上或蜡盘中，再放到载物盘上，待观察。 7．拧开锁紧螺丝，先把镜体先上升到一定高度，然后锁紧镜体。 8．观察时，可先转动目镜管，使得两个目镜间的宽度适合于自己两眼间的距离。然后转动升降螺丝，使没有视觉圈的目镜成像清晰，另一目镜若不清晰，可转动视觉圈，直至两眼同时看到清晰的物像时为至。如果需要放大观察时，再转动倍率盘直到所需要的放大倍率。 9．在调节焦距时，转动升降螺丝时不能太快。在使用的过程中，若遇到故障应立即停止使用，并向老师报告。 10．使用时若发现目镜或物镜上有异物时千万不能用手、布、手绢、衣服等去擦摸，应用吸耳球吹或用擦镜纸轻轻擦拭。 11．用毕后，先将载物盘上的东西拿走，松开锁紧螺丝将镜体放下，并锁紧。取出目镜，换上防尘罩。将元件全部放回，注意不要与其它镜互换。12．用布把镜身擦干净，放入镜箱内，锁紧镜箱。
第一章细胞培养的基本原理与技术现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。第一节体外培养的概念一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。 二、体内、外细胞的差异和分化
1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。 2、分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。第二节细胞培养的一般过程一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。 二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。
细胞培养这个生物学研究最基础的技术之一，已经渗透进了科研工作的方方面面。本文将与大家分享一篇细胞培养的攻略，也是公司一位同事9年细胞培养经验的总结，涵盖了昆虫细胞蛋白表达常用到的sf9细胞与哺乳动物细胞蛋白表达系统的CHO细胞与HEK293细胞，主要介绍了细胞复苏、细胞传代、细胞冻存的具体操作 方法。 细胞复苏： 1、细胞培养条件 2、复苏流程： （1）确认水浴锅的水清洁可用，方可提前打开37度预热。 （2）确认好复苏细胞的液氮罐中具体位置，并做好复苏登记。 （3）提前做好复苏准备，预热培养基。 （4）悬浮和贴壁细胞复苏参数：
（5）将细胞快速放入37度水浴锅中迅速溶解，1.8 ml时间大概1分30秒，1 ml 大概1 min左右，需计时，期间不要老是拿起来观察，需要快速复溶，避免细胞受到损伤。 （6）贴壁细胞需离心， 1000 rpm，5 min；悬浮细胞直接加入预热的培养基中然后放入培养箱中 （7）贴壁细胞离心后去除上清，用预热的培养基重悬细胞后加入到T25方瓶，最后放入培养箱中培养。 （8）取小样计数观察，细胞活力在70%以上算正常。低于70%活力可能细胞状态不太好，需要培养和恢复。 细胞传代培养 1．悬浮细胞传代流程： （1）先将装有细胞的摇瓶从培养箱拿出，用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台；（2）打开摇瓶瓶盖，用200 ul移液器取100~200 ul细胞放入1.5 mlEP管中，瓶盖过火，拧紧，将培养瓶放回摇床； （3）将200 ul细胞混匀，取10 ul细胞加入10 ul台盼蓝，显微镜下计数。根据细胞数决定下游实验； （4）细胞需计数两次求平均值； （5）悬浮细胞生长参数
1 https://www.doczj.com/doc/b610632220.html,/cellculture 1.0 Introduction (4) 2.0 Design and Equipment for the Cell Culture Laboratory (4) 2.1 Laboratory D esign (4) 2.2 Microbiological Safety Cabinets (5) 2.3 Centrifuges (6) 2.4 Incubators (6) 2.5 Work Surfaces and Flooring (6) 2.6 Plasticware and Consumables (7) 2.7 Care and Maintenance of Laboratory Areas (7) 3.0 Safety Aspects of Cell Culture (7) 3.1 Risk Assessment (7) 3.2 Biohazards (9) 3.3 Genetically Modi? ed Organisms (9) 3.4 Disinfection (10) 3.5 Waste Disposal (11) 4.0 Sourcing of Cell Lines ............................125.0 Cell Types & Culture Characteristics .....135.1 Primary Cultures .......................................135.2 Continuous Cultures ................................135.3 Culture Morphology .................................135.4 Phases of Cell Growth ..............................145.5 In Vitro Age of a Cell Culture ...................156.0 The Cell Environment . (15) 6.1 Basic Constituents of Media (16) 6.2 Inorganic Salts (17) 6.3 Buffering Systems (17) 6.4 Carbohydrates (17) 6.5 Amino Acids (17) 6.6 Vitamins (18) 6.7 Proteins and Peptides ...............................18 6.8 Fatty Acids and Lipids ...............................186.9 Trace Elements .........................................186.10 Preparation of Media ...............................186.11 Serum ......................................................19 6.12 Guidelines for Serum Use .........................196.13 Origin of Serum .......................................207.0 Cryopreservation and Storage of Cell Lines ................................................217.1 Cryopreservation ......................................217.2 Ultra-low Temperature Storage ................227.3 Inventory Control .....................................237.4 Safety Considerations ...............................238.0 Good Cell Banking Practices .................249.0 Quality Control Considerations ............269.1 Introduction .............................................269.2 Reagents and Materials ............................279.3 Provenance and Integrity of Cell Lines .................................................279.4 Avoidance of Microbial Contamination .....279.5 Environmental Monitoring ........................299.6 Aseptic Technique and Contamination Control ......................299.7 What to do in the Event of Contamination .....................................3010.0 Authentication of Cell Lines .. (31) 11.0 Alternative Cell Culture Systems .........3111.1 Cell Culture Scale-up Systems...................3111.2 Scale-up Solutions ....................................3211.3 Roller Bottle Culture .................................3211.4 Multilayer Vessels .....................................3211.5 Disposable Solutions for Suspension Cells ....3411.6 Spinner Flask Culture ...............................3411.7 Other Scale-up Options . (34) 生命科学论坛 https://www.doczj.com/doc/b610632220.html,