姓名李亚明系年级2011级临八组别同组者刘通王晓杰吴慧潇
科目细胞生物学实验题目小鼠肝细胞线粒体染色学号201117230189 【实验目的】
1、掌握细胞器活体荧光标记技术。
2、观察和了解活细胞内线粒体等的形态与分布特点。
【实验原理】
对细胞的结构及功能的研究历来是细胞生物学的主要内容。活体染色是指使生活有机体的细胞或组织着色但对其又无毒害作用的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的的生命活动。根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染和体外活染两类。体内活染是将胶体状的染料溶液注入动植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，使这些特殊结构易于识别。体外活染又称超活染色，它是将活的动植物的分离出部分细胞或组织小块，用染料溶液浸染。染料被选择性的固定在活细胞的某种结构上面显色。随着细胞生物学的实验研究技术发展，对细胞的研究正经历着从简单到复杂，静态到动态，从单维度到多维度的发展。其中，细胞器的活体荧光标记技术是现代细胞生物学研究常用的重要试验技术。这种技术可以从分子水平上动态的研究活细胞中的各种生理活动，极大地增强了人们对细胞的认识能力。这种技术能够用来分析细胞的信号转导、物质运输、能量代谢和膜电位的变化等。现在。已经有许多细胞器的特异的商业化荧光染料。
本节课所需的线粒体特异活体染色剂是詹纳斯绿B（Janus green B）。由于线粒体内细胞色素氧化酶系的作用，是该染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色。
【实验材料】
人口腔黏膜上皮细胞、小鼠干细胞、Ringer液、0.02%詹纳斯绿B水溶液
【实验步骤】
1、人口腔黏膜上皮细胞线粒体的活体染色与观察
（1）取干净的的载玻片，滴加两滴0.02%詹纳斯绿B染液。
（2）用干净的牙签在自己的口腔粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物放放入载玻片上的染液中，染色10~15敏，盖上盖玻片，用吸水纸吸去周围溢出的染液，
在于光学显微镜下观察。
2、小白鼠肝细胞线粒体的活体染色与观察
（1）用脊椎脱臼法处死小鼠，至于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝边缘较薄的肝组织块（0.5cm2 ），放入小烧杯中。用习惯吸取Ringer液，反复浸泡冲洗肝脏，洗去
血液。
（2）在干净的凹面载玻片的凹穴中，滴加0.02%詹纳斯绿B染液，再将肝组织块移入染液，注意不可将组织块完全淹没，要是组织块上半部分露在染液外，易于染色。
当组织块边缘被染成蓝绿色即可（20~30min）
（3）吸去染液，滴加Ringer液，用剪刀将组织块染色部分剪碎，使细胞或细胞群散出，然后，用吸管吸取分理出的细胞悬液，滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片进行观察。（4）在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜下观察，可见许多被染成蓝绿色的线粒体，注意其形态和分布状况。
姓名李亚明系年级2011级临八组别同组者刘通王晓杰吴慧潇
科目细胞生物学实验题目小鼠肝细胞线粒体染色学号201117230189
【实验结果】
实验过程中对小鼠肝脏组织进行了25min至40min的染色。使用剪子剪碎染色后组织后仍存有部分肉眼可见的粒状细胞团，稍沉淀后去上层细胞悬液进行镜检得到染色结果。结果显示，细胞悬液中主要含有两种细胞，小鼠肝细胞（体积较大，视野下呈圆形，内容物清晰）和红细胞（体积小，视野下呈圆形或饼形，内容物不明显），后者数量较前者多。这是由于肝脏具有重要的储血功能，而前期对肝脏的处理并不能彻底除去其中的血细胞成分。
对肝细胞的观察：可看到肝细胞与红细胞的显著不同在于其中有被染成蓝绿色至深灰色的粒状细胞器，判断即为线粒体。难以准确计数每个肝细胞内线粒体的数量，但可以分辨大约有5至10个密集染色团块。部分细胞未能被染色。
姓名李亚明系年级2011级临八组别同组者刘通王晓杰吴慧潇
科目细胞生物学实验题目小鼠肝细胞线粒体染色学号201117230189
视野中尚出现了部分细胞碎片等杂质。
【实验结果分析】
姓名李亚明系年级2011级临八组别同组者刘通王晓杰吴慧潇
科目细胞生物学实验题目小鼠肝细胞线粒体染色学号201117230189 实验的预期目的基本达成，能够观察到较清晰的被染色肝细胞和内部线粒体。存在以下几点不足：
1.染色不如预期效果鲜明，蓝绿色区域较少而模糊，部分细胞可能由于染色程度不适宜而导致未着色或着色过深。应该严格控制染色时间，或采取分染色时长进行观察的手段。
2.视野中存在细胞碎片等杂质。
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 【实验题目】 小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 【实验目的】 1、掌握线粒体的超活染色原理及方法。 2、观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。 【实验材料与用品】 1. 试剂：0.02%的詹纳绿B染液、Ringer试剂 2. 器具：解剖盘、镊子、剪刀、双凹片、小烧杯、载玻片、盖玻片、胶头滴管、显微镜等 3. 材料：小鼠 【实验原理】 I.线粒体 线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包裹的细胞器，直径在0.5-10微米左右；线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷的主要场所，为细胞的活动提供了能量，有“细胞动力工厂”之称。 线粒体在代谢活动旺盛的细胞，如肌肉细胞，肝细胞，神经细胞等中大量存在；线粒体的数量差异巨大，如在肝脏细胞中有1000-2000个线粒体，而有些细胞只有一个线粒体，如酵母菌细胞的大型分支线粒体，大多数哺乳动物成熟红细胞不具有线粒体。 线粒体分布方向与微管一致，通常分布在细胞功能旺盛的区域：如在肾脏细胞中靠近微血管，呈平行或栅状排列；在肠表皮细胞中呈两极分布，集中在顶端和基端，在精子中分布在鞭毛中区。
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 II.超活染色实验原理 超活染色也称活体染色，是指对生命有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法；超活染色的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞死亡。应用活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理病理状态。 活体染色根据染色剂的性质和染色方法不同分为：体内活染（注入、固定、堆积）、体外活染（分离、浸染、固定） 1）体内活染：是以胶体状的染料溶液注入动植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的作用。 2）体外活染：又称超活染色，它是由活的动植物分离出的细胞或组织小块，以染料溶液浸染，燃料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。 活体染色之所以能固定，堆积在细胞内某些特殊部分，主要是染料的“电化学”特性起到重要作用；碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染液的胶粒表面带阴离子，被染的部分本身也是具有阳离子或阴离子，这样它们彼此之间就发生了吸引作用，从而使样品着色。不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料。 活体染色剂的选择原则： 1、对细胞无毒性或毒性极小的染剂 2、具有电化学特性 3、配成稀淡的溶液来使用 4、具有专一性（特异性） 5、一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。 本实验采用的活体染色剂---詹纳斯绿B 詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性的对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态--蓝绿色）；而线
小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察-实验报告
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 【实验题目】 小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 【实验目的】 1、掌握线粒体的超活染色原理及方法。 2、观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。 【实验材料与用品】 1. 试剂：0.02%的詹纳绿B染液、Ringer试剂 2. 器具：解剖盘、镊子、剪刀、双凹片、小烧杯、载玻片、盖玻片、胶头滴管、显微镜等 3. 材料：小鼠 【实验原理】 I.线粒体 线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包裹的细胞器，直径在0.5-10微米左右；线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷的主要场所，为细胞的活动提供了能量，有“细胞动力工厂”之称。 线粒体在代谢活动旺盛的细胞，如肌肉细胞，肝细胞，神经细胞等中大量存在；线粒体的数量差异巨大，如在肝脏细胞中有1000-2000个线粒体，而有些细胞只有一个线粒体，如酵母菌细胞的大型分支线粒体，大多数哺乳动物成熟红细胞不具有线粒体。 线粒体分布方向与微管一致，通常分布在细胞功能旺盛的区域：如在肾脏细胞中靠近微血管，呈平行或栅状排列；在肠表皮细胞中呈两极分布，集中在顶端和基端，在精子中分布在鞭毛中区。
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 II.超活染色实验原理 超活染色也称活体染色，是指对生命有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法；超活染色的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞死亡。应用活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理病理状态。 活体染色根据染色剂的性质和染色方法不同分为：体内活染（注入、固定、堆积）、体外活染（分离、浸染、固定） 1）体内活染：是以胶体状的染料溶液注入动植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的作用。 2）体外活染：又称超活染色，它是由活的动植物分离出的细胞或组织小块，以染料溶液浸染，燃料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。 活体染色之所以能固定，堆积在细胞内某些特殊部分，主要是染料的“电化学”特性起到 重要作用；碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染液的胶粒表面带阴离子，被染的部分本身也是具有阳离子或阴离子，这样它们彼此之间就发生了吸引作用，从而使样品着色。不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料。 活体染色剂的选择原则： 1、对细胞无毒性或毒性极小的染剂 2、具有电化学特性 3、配成稀淡的溶液来使用 4、具有专一性（特异性） 5、一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。 本实验采用的活体染色剂---詹纳斯绿B 詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性的对线粒体进行超活染色，这是由于线粒
细胞培养室肝细胞原代培养标准操作规程 实验试剂 培养基：William’s E Medium(GiBCO 12551-032), 谷氨酰胺(GiBco 21051-024-100g)292mg/L，双抗（GiBco 15140-122 penicillin +10,000Units/mL, streptomycin +10,000μg /mL）5mL/500mL, 胰岛素(GiBCO 12585-014 4 mg/mL)8μg/mL, 地塞米松（中国药品生物制品检定所）5mg/L。 D-Hanks’液（CaCl2 0.55g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, Na2HPO4?7H2O 0.06g/L, NaHCO3 0.35g/L, 三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2-7.4, 4℃保存） 0.05%胶原酶Ⅳ溶液(（Sigma C5138-1G） D-Hanks’液溶解, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌, -20℃ 保存）) PBS预灌流溶液（NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L, KH2PO40.2g/L, Na2HPO4?7H2O 1.56g/L, EDTA 0.1mM, 三蒸水溶解, NaHCO3调pH 7.2-7.4, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存） 鼠尾胶原（GiBCO A10483-01 20mL/ 瓶）（0.05 mg/ mL）用0.02M 的醋酸稀释,临用现配） 0.02M 的醋酸：115μL的醋酸(大于99%)用水稀释至100mL 0.05 mg/ mL-200μL鼠尾胶原（5 mg/ mL）用0.02M的醋酸稀释至20 mL Overlay(0.25 mg/ mL的Matrigel（BD 356237）(用William’s E Medium稀释，视具体批号而定稀释倍数，临用现配） Hanks’液（CaCl2 0.14g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, MgCl2?6H2O 0.10g/L, MgSO4.7H2O 0.10g/L, Na2HPO4?7H2O 0.09g/L, NaHCO3 0.35g/L, D-葡萄糖 1.0 g/L，三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2附近，4℃保存） 实验仪器 CO2 恒温培养箱（日本SANYO 公司）； Sigma高速离心机； IX-51 型荧光倒置显微镜（日本尼康公司）； DHL-A电脑恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）； 液相-质谱联用分析系统（LC/MS/MS）由美国Thermo系列四元泵、在线脱气机、自动进样器、以及Thermo Finnigan LTQ线性离子阱质谱检测器，系统工作软件为XcaLibur（美国）； Sigma5310离心机； ZHWY-103B多振幅轨道式恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。 实验方法 实验准备
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法 1、组织得采集、固定与保存: 采取组织后, 方法一:4％多聚甲醛(4％ＰＦＡ)4?Ｃ固定1小时(根据组织大小与致密程度调整固定时间)或过夜 方法二:采用boｕｉn’s固定ＲT 2h(6—8dｔeｓis)or RＴ过夜(成年tesiｓ) PBS缓冲液洗三次,每次5ｍin,4?C保存于7０%乙醇中。 ２、组织得包埋、切片、展片及保存:: 固定后得样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明,５2－54?C石蜡包埋,常规切片,切片厚4—１０μm,贴于处理过得干净载玻片上,37?C烤片过夜,之后收集于载片盒中,RT密封保存。 石蜡包埋: 保存于４?Ｃ70％乙醇中得组织样品 ↓ 80％乙醇1５ｍin ↓ 95%乙醇15 miｎ ↓ 1０0%乙醇15mｉｎ? 2 ↓ 1/2乙醇１／２二甲苯15 ｍin ↓ 二甲苯透明5-１0 min ↓ 1／２二甲苯１/2石蜡３0 min
↓ 石蜡(1) 1。5hｒ ↓ 石蜡(2) 1.5－２.5hr ↓ 石蜡(3) 包埋 ↓ RT保存 3、石蜡组织切片得免疫组化方法: 密封保存于RT得组织切片 ↓ 二甲苯(1) 20 min ↓ 二甲苯(2)20ｍin ↓ 100％乙醇20ｍin ↓ 95％乙醇10 min ↓ 8０％乙醇10miｎ ↓ 通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈 ↓ 切片在ＰBS中浸泡 5 ｍin＊2 ↓ 0.4%Tritonx RＴ10 mｉn ↓ 切片在PＢS中浸泡 5 min＊3 ３％H２O2 RT １０ｍin
切片在PBS中浸泡５ｍｉn*3 0、25％胰酶RT １0min 切片在PBS中浸泡 5 min*３ Blocking bｕｆfｅr(3%BSA+5%NGS＋０、2%Ｔritｏnx—１０0 in PBS) ＲT 60mｉn 倾去blｏｃking buffｅｒ,勿洗 一抗4 C overnighｔｉn blｏckinｇbuffeｒ 取出切片复温1h,切片在PBＳ中浸泡 5 mｉn*３ 二抗iｎblocking ｂufｆer GＡR1:２00 (GＡM1:100),R Ｔ 1h 切片在PBS中浸泡５min*3 DAB显色５—１0min(５0微升A＋５0微升B＋９0０微升ＰBS+5微升3％H2Ｏ2) 如果就是增强型DＡB只要1ｍｉn即可。 切片浸入PBS终止显色,ＨE衬染1s, 玻片架放入泡沫盒,流水冲洗15mｉn,肉眼瞧到淡淡得紫色即可停止。 若颜色太深,可用0、１-０、5％盐酸乙醇分色1～2秒钟(或更久)
广州大学 综合设计性实验报告 学院生命科学学院 课程细胞生物学实验 实验项目细胞培养 实验题目小鼠肝细胞的原代培养 专业生物技术 年级、班别生技142 姓名徐嘉宽 学号 1414300030 任课教师陈鲲
细胞培养 ——小鼠细胞的原代培养 摘要目的探讨体外分离和培养小鼠肾、脑、心肌细胞的方法。方法采用脱臼法处死新生小鼠，结合酶消化法和组织块法对新生小鼠肾、脑、心肌细胞进行了体外分离、培养。（用眼科剪把新生小鼠心肌细胞组织剪成小于1mm3大小的植块，然后用胰蛋白酶消化5~10min，最后将心肌组织块接种于培养瓶中进行体外培养。脑和肾直接进行组织块培养。）结果比较成功地进行了原代肾、脑、心肌细胞培养，并进行了形态学观察。结论采用该方法能够实现对小鼠心肌、肾、脑细胞的体外原代培养，较好观察到心肌、脑、肾细胞的形态。 关键词原代培养小鼠细胞组织块法酶消化法 1前言 初步了解动物细胞原代培养的基本方法、原理和基本操作过程，初步掌握无菌操作方法。学习植块培养法、营养液的配置及酸碱度的调节。细胞培养是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。当前，细胞培养技术广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，已发展成为一种重要的生物技术。了解动物细胞培养的技术的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，并对原代培养有一个基本概念。结合酶消化法和组织块法通过无菌操作培养新生小鼠细胞。 2实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），用植块培养法或酶解法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要是细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 3实验用品 3.1器材 解剖剪、镊1套；眼科剪7把、眼科镊6把；吸管直、弯头各7支，2 ml刻度吸管5支；吸管胶头：小18个、大6个；细胞培养瓶5个；青霉素瓶及瓶塞：6个（其中一个用于分装胰酶液）；培养皿(用于解剖取材)：大、小各1套。烧杯：5～10ml 2个、100 ml 1个。用于无菌操作：解剖镊1把，广口瓶大、小各1个（装消毒棉球），医用棉花、纱布，有盖白瓷盘1个、消毒盒3个、牛皮纸、棉绳。小培养皿(装盖玻片)1个。
实验四线粒体的活体染色 实验目的： 1.掌握线粒体的活体染色原理及方法。 2.熟悉在耳缘静脉用空气栓塞法处死兔子的方法。 3.了解光学显微镜和电子显微镜下线粒体基本形态结构。 实验原理： 线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿B（Janus green B）是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。 不同细胞中线粒体的形态和数目不同。在电子显微镜下，线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。 线粒体脊的数目与分布方式是多种多样的。一般与线粒体长轴垂直排列，但也可见到与线粒体长轴平行排列的脊。脊的横切面呈囊状或管状。脊的数量与细胞呼吸机能的强度有很大关系。 实验用品： 一、材料和标本兔子一只、线粒体的电镜照片。 二、器材和仪器普通光学显微镜、手术器材一套、解剖盘、腊盘、小平皿、载片、盖片、吸水纸、20ml注射器、吸管。 三、试剂l／300詹纳斯绿B染液、0.9%Ringer氏液(哺乳类用)。 实验内容和方法： 一、兔肝细胞线粒体的活体染色 （一）方法 1.用空气栓塞法处死兔子（见图4-1），置于解剖盘内，迅速打开腹腔，取兔肝边缘较薄的肝组织一小块（约2～3mm3大小）。 2.放入盛有Ringer氏液的平皿内洗去血液(用镊子轻压)，再用吸管吸去Ringer 氏液。 3.在平皿内滴加1／300詹纳斯绿B（Janus green B）染液，，让组织块上表面露在染液外面，使细胞内线粒体的酶系可进行充分的氧化，这样才有利于保持染料的氧化状态，使线粒体着色。当组织块边缘染成蓝色时即可，一般需要染色30分钟。染色期间翻动组织块几次，使其各表面均有机会接触空气和染液。 4. 染色后，将组织块移到载片上，用镊子将组织块拉碎，去除大组织块，就会
【实验题目】小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 【实验目的】 1、掌握线粒体的超活染色原理及方法。 2、观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。 【实验材料与用品】 1.试剂：%的詹纳绿B染液、Ringer试剂 2.器具：解剖盘、镊子、剪刀、双凹片、小烧杯、载玻片、盖玻片、胶头滴管、显微镜等 3.材料：小鼠 【实验原理】 I.线粒体 线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包裹的细胞器，直径在微米左右；线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷的主要场所，为细胞的活动提供了能量，有“细胞动力工厂”之称。 线粒体在代谢活动旺盛的细胞，如肌肉细胞，肝细胞，神经细胞等中大量存在；线粒体的数量差异巨大，如在肝脏细胞中有1000-2000个线粒体，而有些细胞只有一个线粒体，如酵母菌细胞的大型分支线粒体，大多数哺乳动物成熟红细胞不具有线粒体。 线粒体分布方向与微管一致，通常分布在细胞功能旺盛的区域：如在肾脏细胞中靠近微血管，呈平行或栅状排列；在肠表皮细胞中呈两极分布，集中在顶端和基端，在精子中分布在鞭毛中区。 II.超活染色实验原理 超活染色也称活体染色，是指对生命有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法；超活染色的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞死亡。应用活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理病理状态。
活体染色根据染色剂的性质和染色方法不同分为：体内活染（注入、固定、堆积）、体外活染（分离、浸染、固定） 1）体内活染：是以胶体状的染料溶液注入动植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的作用。 2）体外活染：又称超活染色，它是由活的动植物分离出的细胞或组织小块，以染料溶液浸染，燃料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。 活体染色之所以能固定，堆积在细胞内某些特殊部分，主要是染料的“电化学”特性起到 重要作用；碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染液的胶粒表面带阴离子，被染的部分本身也是具有阳离子或阴离子，这样它们彼此之间就发生了吸引作用，从而使样品着色。不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料。 活体染色剂的选择原则： 1、对细胞无毒性或毒性极小的染剂 2、具有电化学特性 3、配成稀淡的溶液来使用 4、具有专一性（特异性） 5、一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。 本实验采用的活体染色剂---詹纳斯绿B 詹纳斯绿B 是毒性较小的碱性染料，可专一性的对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态--蓝绿色）；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原呈无色的色基（即无色状态）。 另外，中性红也属于碱性染料，对植物液泡系的染色有专一性。 【实验步骤】 一、大体流程 剪下合适大小的肝组织小块洗净 用詹纳斯绿B 染色20-30min 取着色部分加 Ringer 溶液制成悬 液 制片，高倍镜观察 断头法处死小 白鼠取肝组织
一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法 1材料与方法 1.1动物 2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。 1.2试剂 D-hank's液； 消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyroli done, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)； 消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP； 基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）； 小牛血清（BS，GIBCO公司提供）； 培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。 1.3鼠肝组织块培养 1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分； 3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清， 4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。 1.4鼠肝细胞单层培养 动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。 或者： 1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分； 3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清， 4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育20 min，每隔5min振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离； 5）加入3-5mL含血清培养液以终止胰酶消化作用； 6）用100目筛网过滤，除去未消化的大组织块； 7）再次离心5min，弃上清； 8）加入无血清培养液5mL，冲散细胞，再离心一次，弃上清； 9）加入含血清培养液1-2mL（视细胞数量），血球计数板计数； 10）将细胞调整到5*105/mL左右，转移至6孔培养板中，37℃、5% CO2条件下培养。
细胞生物学实验六小鼠肝细胞线粒体的超活染色 13生物基地 201300140059 刘洋 2015-05-11 同组者：吕赞孙佳孟何娟 一、实验目的 1．掌握线粒体的超活染色原理及方法。 2．观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。 二、实验原理 线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿B（Janus green B）是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。 不同细胞中线粒体的形态和数目不同。在电子显微镜下，线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。 线粒体的细胞色素氧化酶能使詹纳新绿染料始终保持在氧化状态而呈蓝色，周围细胞内的染料却被还原成无色的色基，在进行细胞的体外染色时，至少要使材料在詹纳斯绿染料中染色15min后再盖上盖玻片，以使材料充分氧化。 活体染色是指用燃料标记生活有机体的细胞或组织但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示活细胞内的某些结构，同时即不影响细胞的生命活动也不会产生任何物理、化学变化导致细胞的死亡。活染技术可用来研宄生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。 活体染色之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电 化学”特性起作用。碱性燃料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子；而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们被此就发生了吸引作用。但不是任何染料都可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性 或毒性极小的染料配成稀的溶液来使用。一般以碱性染料最为常用，因为碱性染料具有溶解在类脂质的特性，易于被细胞吸收，如中性红、詹钠斯绿、次甲基蓝、 甲苯胺蓝、亮焦油紫等。其中詹钠斯绿和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最常用的染料，分别对线粒体和液泡系有特异性的染色。詹纳斯绿B这种碱性染料是活体染色中重要的材料，对线粒体的染色有专一性，可专一性地对线粒体进行活染，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原成无色的色基。 三、实验器材 1.器材： 小白鼠，解剖盘，镊子，剪刀，载玻片，盖玻片，滴管，双凹片，小烧杯，显微镜； 2.试剂： 1/500詹纳绿B染液；Ringer试剂
细胞生物学实验报告 题目：小鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 姓名：刘恋学号：201000140049 系年级：10级生科2班 一、【实验目的】 1．掌握线粒体的超活染色原理及方法。 2．观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。 二、【实验原理】 1．线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿B（Janus green B）是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。 不同细胞中线粒体的形态和数目不同。在电子显微镜下，线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。 线粒体的细胞色素氧化酶能使詹纳新绿染料始终保持在氧化状态而呈蓝色，周围细胞内的染料却被还原成无色的色基，在进行细胞的体外染色时，至少要使材料在詹纳斯绿染料中染色15min后再盖上盖玻片，以使材料充分氧化。 2．活体染色是指用燃料标记生活有机体的细胞或组织但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示活细胞内的某些结构，同时即不影响细胞的生命活动也不会产生任何物理、化学变化导致细胞的死亡。活染技术可用来研宄生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。 活体染色之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起作用。碱性燃料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子；而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们被此就发生了吸引作用。但不是任何染料都可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料配成稀的溶液来使用。一般以碱性染料最为常用，因为碱性染料具有溶解在类脂质的特性，易于被细胞吸收，如中性红、詹钠斯绿、次甲基蓝、甲苯胺蓝、亮焦油紫等。其中詹钠斯绿和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最常用的染料，分别对线粒体和液泡系有特异性的染色。詹纳斯绿B这种碱性染料是活体染色中重要的材料，对线粒体的染色有专一性，可专一性地对线粒体进行活染，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原成无色的色基。
实验三 1实验目的与原理 1.1实验目的： 观察植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布；掌握一些细胞活体染色的原理和技术。 1.2实验原理： 活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。 詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。中性红为弱碱性染料，对液泡系的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。 2实验材料与方法 2.1实验材料： 洋葱鳞茎内表皮 2.2洋葱鳞茎细胞液泡的活体染色： 撕取洋葱鳞茎内表皮→中性红溶液染色5~10min→吸去染液，滴加Ringer液→盖上载玻片，显微镜观察。 2.3洋葱鳞茎细胞线粒体的活体染色：
撕取洋葱鳞茎内表皮→詹纳斯绿B溶液染色10min→吸去染液，滴加Ringer 液→盖上载玻片，显微镜观察。 3实验结果 图1中性红染色洋葱内表皮细胞图2詹纳斯绿染色洋葱内表皮(X100) (X100) 在图1中性红染色的洋葱鳞茎内表皮细胞中可见表皮细胞中央液泡所占据被染至砖红色，细胞核被挤至旁边 图2是经詹纳斯绿B染色的洋葱鳞茎内表皮细胞，图中细胞被染成蓝色可以看见有许多蓝色颗粒状物体，这就是经染色的线粒体。
免疫荧光技术的实验方法及其分类 一、免疫标记法及其分类 1.荧光免疫法 原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min 内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。 以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。 传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2.放射免疫法 放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。 RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng/ml 水平。但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。 3.酶联免疫法(ELISA) ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb 和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg/L，线性范围达1 000ug/L。夹心ELISA 法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。
线粒体(Mitochondrion)的活体染色 及电镜照片观察 【实验目的】 掌握一种活体染色方法,了解光学显微镜和电子显微镜下线粒体基本形态结构。 【实验用品】 一、材料和标本兔子一只、线粒体的电镜照片。 二、器材和仪器显微镜、手术器材一套、解剖盘、小平皿、载片、盖片、吸水纸、10ml 注射器、吸管。 三、试剂 l／300詹纳斯绿B染液、Ringer氏液(哺乳类用)。 【实验内容】 一、兔肝细胞线粒体的活体染色 （一）原理 线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿 B是线垃体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。 （二）方法 用空气栓塞处死兔子，置于解剖盘内，迅速打开腹腔，取兔肝边缘较薄的肝组织一小块（2～3mm3），放入盛有Ringer氏液的平皿内洗去血液(用镊子轻压)，用吸管吸去Ringer氏液，在平皿内加1／300詹纳斯绿B染液，让组织块上表面露在染液外面，使细胞内线粒体的酶系可进行充分的氧化，这样才有利于保持染料的氧化状态，使线粒体着色。当组织块边缘染成篮色时即可，一般需要染30分钟。 染色后，将组织块移到载片上，用镊子将组织块拉碎，就会有一些细胞或细胞群从组织块脱离。 将稍大的组织块去掉，使游离的细胞或细胞群留在载片上，加一滴Ringer氏液，盖上盖片，吸去多余水分。 (三)结果 显微镜观察，肝细胞质中许多线粒体被染成蓝绿色，呈颗粒状。 二、线粒体的光镜切片观察 用詹纳斯绿B染色的兔肝细胞光镜切片，肝细胞中的线粒体呈蓝绿色的颗粒。 三．线粒体的电镜照片观察 不同细胞中线粒体的形态和数目不同。线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。 线粒体脊的数目与分布方式是多种多样的。一般与线粒体长轴垂直排列，但也可见到与线粒体长轴平行排列的脊。脊的横切面呈囊状或管状。脊的数量与细胞呼吸机能的强度有很大关系。 这有三张线粒体超薄切片的电镜照片：第一张是小鼠肾小管上皮细胞中线粒体的电镜照片，可见线粒体呈椭圆形和杆状，由双层膜包围，内膜向内突起成平板状脊，脊与线粒体长
石蜡切片免疫荧光染色方 法 Prepared on 22 November 2020
对于石蜡切片： 1、烤片：60℃ 60分钟 2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入l柠檬酸钠，(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏 水中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。（也可不用去除内源性酶）。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。PBS洗3次，每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
实验九 显微摄影――小鼠肝脏结构 年级专业 *班 *组 学号 姓名 图版说明： 图1：小鼠肝脏横切部分结构，示肝小叶（A ），静脉血管（B ）。 图2：图1（α部位）的放大，示肝小叶（C ）。 图3：示肝小叶（D ）。 图4：示静脉血管（E ）。 图5：示肝细胞（F ），肝细胞细胞核（G ）。 图6：图2（β部位)的放大，示上皮细胞（H ），上皮细胞细胞核（I ），肝血窦（J ），中央静脉（K ）， 肝动脉（L ），血细胞（M ）。 结构说明： 肝脏是脊椎动物身体内以代谢功能为主的一个器官，并在身体里面扮演着氧化，储存肝糖，解读等功能。肝脏由肝小叶组成，肝小叶是肝脏的基本组成成分，它来执行肝脏的基本职能。而肝小叶又是由肝细胞组成，当肝细胞大量损坏时，肝小叶不能正常工作，影响肝脏正常生理功能，而出现各种各样的症状。肝小叶成棱柱状，中央有一条中央静脉穿过，肝细胞围绕中央静脉成放射状排列。 肝细胞是一种高度分化并具有多种功能的细胞，胞质内各种细胞器丰富而发达，并含有糖原，脂滴等内涵物。细胞器和内涵物的含量与分布常因细胞的功能状况或饮食变化而变动。一般肝细胞里线粒体含量都比较多，遍布于胞质内，为肝细胞的功能活动不断提供能量。 肝细胞核大而圆，居中央，染色质丰富色浅，核膜清楚，核仁1至数个。部分肝细胞（约25%）有双核，有的肝细胞的核体积较大，为多倍体核。 肝血窦位于肝板之间，互相吻合成网状管道。血窦腔大而不规则，血液从肝小叶的周边经肝血窦流向中央，汇聚到中央静脉。 1 A B C 2 D 3 E 4 G F 5 50μm I 6 50μm α β 500μm 200μm 100μm 100μm
小鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 姓名：学号：实验时间：2014.11.11 1.实验目的 1. 掌握线粒体的超活染色原理及方法 2. 观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量和分布 2.实验原理 超活细胞染色也称活体染色，是指对生命有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。 超活染色的目的是显示活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。 活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理病理状态。 活体染色根据染色剂的性质和染色方法的不同，分为：体内活染（注入、固定、堆积）、体外活染（分离、浸染、固定） 体内活染是以胶体状的染料溶液注入动植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内的某些特殊结构里，达到易于识别的目的。 体外活染又称活体染色，它是由活的动植物分离出部分西部或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在某种结构上而显色。 活体染料之所以能固定，堆积在细胞内某些特殊部分，主要是染料的“电化学“特性起重要作用：碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带阴离子，被染的部分本身也具有阴离子或阳离子，这样他们彼此之间就发生了吸引作用，从而使样品着色。 不是任何染料都可作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性活毒性极小的染料。 活体染色剂选择原则： 对细胞无毒性或毒性极小的染料；具有电化学特性；配成稀淡的溶液来使用（如配成超低浓度Janus Green B1/5000）具有专一性(特异性)；一般是碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂类（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。 本实验常用活体染色剂—詹纳斯绿B 詹纳斯绿B（Janus Green B）是毒性较小的碱性染料，可专一性的对细胞活体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态—蓝绿色）而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态） 3.实验材料和用品 小白鼠、Ringer液、Janus Green B 4.实验步骤 1.用断头法处死小鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝组织，选取边缘较薄的肝组织0.5cm3,放入小烧杯中，用Ringer液，冲洗去血污。 2.在干净的凹面载玻片的凹穴中，滴加1/5000Janus Green B,再将肝组织块
对于石蜡切片： 1、烤片：60℃ 60分钟 2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入0.01mol/l柠檬酸钠，pH6.0(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏水 中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。（也可不用去除内源性酶）。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。PBS洗3次，每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 PBS洗涤3次。每次5分钟。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
1、在前一天晚上铺三明治培养基的下层胶： 100ml超纯水+114ul冰醋酸，然后到细胞房超净台用0.22um的滤膜过滤后加入1.6ml 的I型鼠尾胶原后铺板 6-well plate：1000ul 12-well plate：500ul 24-well plate：250ul 96-well plate：30ul 铺板后晃荡混匀，打开盖子置于超净台中，开紫外灯过夜，第二天吸弃上层液体，收起plate备用（若要放置长时间，则要用封口膜）； 2、在前一天确认buffer1、beffer2（未加酶）是否准备好 Buffer1：1*EBSS，0.5mM EGTA，无Ca、Mg； Buffer2：1*EBSS，0.2mg/ml 胶原酶IV，10mM HEPES（500ml；1.191g），2mM CaCl（500ml； 0.11g） 两种buffer都用NaHCO3调pH至7.3~7.5，不可低于7.3； 3、当天上午器材灭菌，两个铁饭盒，one for剪刀，小镊子，橡胶管，细线，another for三 个筛子，2把弯头镊子,1把剪刀；两个fisher瓶子装过滤后的buffer1,buffer2； 4、准备30ml的WEM（或DMEM）置于4°，盛放剥下的肝脏；预先打开37°水浴槽两个； buffer1,buffer2过滤除菌，并置于37°中预热；检查泵是否正常工作； ※灌流一只20g左右的小鼠肝脏，buffer1需100ml即够，buffer2需60ml，加0.18mg/ml 的胶原酶IV。 5、解剖腹腔与胸腔之间的部分，找到门静脉顺行插管，（橡皮管内径为4.8mm），先用buffer1灌注，调节流速为3.1rpm（约5ml/min），灌流6min。然后用buffer2，调节流速为3.1rpm，将60mlbuffer2灌完（最好控制在8min内）； 6、剪下肝脏组织放至预先放在4°冰箱的WEM中； 去细胞房预冷离心机 7、准备4-5个10cm dish，将肝脏并WEM一并倒入dish清洗一下，转入倒有DMEM的dish 中，用镊子轻轻撕去肝脏表面一层膜（撕时要抖动，以便干细胞掉下来），再将肝脏转入新dish中继续撕； 8、将dish中的细胞悬液倒入筛子中，用新dish盛接，筛下来的细胞悬液转移至50ml离心 管； 9、初步离心，50g，2min，4°，吸弃上清； 离心过程中配制梯度离心液：5ml 10*PBS + 45ml percoll + 50ml DMEM 10、加25ml梯度离心液重悬（先加2ml重悬，再补加）： 1500rpm 8min，4°，吸弃上清； 离心过程中配制PM液 11、加30ml DMEM重悬 50g，2min，4°，吸弃上清； 12、重复步骤11（可不重复）； 13、加入PM 5ml（根据细胞量来决定加多少），混匀后计数 6孔板，2ml，5*10E5个/ml 14、4h后换PM液（PM要预热） 24h后换成FM液（若铺上胶则不能预热）。 ※若铺上胶则提前半天将上胶置于4℃