目录
1前言 (1)
1.1 ABCA1基因的作用及特点 (1)
1.2 ABCA1基因研究的目的和意义 (1)
1.3基因检测及定量的基本原理 (2)
1.4 PCR扩增目的基因 (2)
1.4.1 RNA的提取要求 (2)
1.4.2cDNA的合成 (2)
1.4.2.1cDNA第一链的合成条件 (2)
1.4.2.2cDNA第二链的合成 (2)
1.4.3 PCR荧光定量特点及原理 (3)
1.4.3.1 PCR技术的特点 (3)
1.4.3.2实时荧光定量PCR技术原理 (3)
1.5实时荧光定量基因检测方法的应用 (4)
1.6 ABCA1基因研究的现状及发展趋势 (4)
1.7本文研究的意义 (5)
2材料与方法 (5)
2.1试验的时间、地点 (5)
2.1.1实验时间 (5)
2.1.2实验地点 (5)
2.2实验材料与器材 (5)
2.2.1样品的选取 (5)
2.2.2主要仪器 (5)
2.2.3主要试剂 (5)
2.3主要试验方法 (6)
2.3.1 RNA的提取过程 (6)
2.3.2 cDNA的合成过程 (6)
2.3.3荧光定量过程 (6)
3结果与分析 (7)
3.1 RNA的提取的纯度分析 (7)
3.2荧光定量的分析 (7)
3.3基因相对定量的结果 (9)
3.3.1相对定量的实验结果 (9)
3.3.2相对定量的结果分析 (9)
4讨论 (10)
4.1RNA提取操作中的常见问题 (10)
4.2 cDNA合成操作中的注意事项 (10)
4.3PCR荧光定量的注意事项 (10)
5结论 (10)
参考文献 (11)
致谢 (12)
附录1相关英文文献 (13)
附录2相关英文文献翻译 (23)
摘要
本文运用RT-PCR方法从患有颈动脉粥样硬化的小鼠肝脏组织中提取总的RNA，然后合成cDNA序列，最后应用Real-time PCR法检测了服用不同时长的通心络药品的实验小鼠肝脏组织中ABCA1基因的表达情况。通过研究表明，服用通心络可以增强小鼠肝脏组织中ABCA1基因的表达水平，并且药品的服用时长与ABCA1基因的表达水平的高低成正相关，进而得知通心络治疗颈动脉粥样硬化的作用机理。小鼠肝脏组织中ABCA1基因的研究，可以为进一步探讨ABCA1基因变异有关的疾病的课题提供理论依据和基础。
关键词：ABCA1；Real-time PCR；小鼠；检测；肝脏组织
ABSTRACT
In this paper, the total RNA is extracted from liver tissue in mice with carotid atherosclerosis by RT-PCR method. Next combining the sequence of cDNA, the application of Real-time PCR was used to detect experimental mice liver tissue expression of ABCA1 gene, the mice had been taken tongxinluo drugs in different time. Studies have shown that taking Tongxinluo can enhance the expression levels of ABCA1 gene in mouse liver tissue, and the length of the drug taking time is positively correlated with the length of ABCA1 gene expression level, then learned that tongxinluo’s mechanism for the treatment of carotid artery atherosclerosis. Investigation of ABCA1 gene in mice liver tissue can provide theoretical basis and foundation for exploring the further subject of the diseases about ABCA1 gene mutation.
Key word:ABCA1; Real-time PCR; mice; determination; liver tissue
小鼠肝脏组织中ABCA1基因的检测与分析
刘芳
（天津农学院动物科学系）
1.前言
1.1ABCA1基因的作用及特点
ABCA1是到目前为止研究最多、最重要的促进胆固醇流出的细胞表面蛋白。ABCA1是ATP结合盒转运子(ABC)超家族的成员。人们证明了ABCA1基因的缺陷是Tangier病的病因,后来又发现ABCA1基因变异与家族性HDL缺乏(FHD)有密切的相关性[1]。现在已经证实ABCA1的主要功能是作用于胆固醇的逆转运(RCT)。随着对ABCA1基因的研究的不断深入,人们发现不仅在具有家族遗传病的人群中ABCA1的突变发挥作用,在普通人群中ABCA1单核苷酸多样性(SNP)也可导致ABCA1基因功能发生改变。
胆固醇的逆转运是外周组织通过血浆脂蛋白转将过多的胆固醇转运到肝脏并通过肝脏作用后排泄的过程。人们对细胞内胆固醇的流出的过程和载脂蛋白在胆固醇流出过程中的作用早有认识,但对于ABCA1在胆固醇流出中作用的重要性是在后来才发现的。由于人类ABCA1基因特殊的结构组成，以及其编码的ABCA1膜蛋白的特殊性，使得ABCA1不直接作用于胆固醇,而是转运磷脂。磷脂被转运出去后,与细胞外的apoAⅠ形成复合物,胆固醇才能扩散出去,然后盘状的磷脂apoA Ⅰ复合物将其捕获,形成前β-HDL。在卵磷脂胆固醇酯酰转移酶(LCAT)的作用下,转变成含有胆固醇酯(CE)成熟的球状HDL。由于ABCA1可以促进细胞内胆固醇和磷脂转移至HDL前体apoAⅠ ,因此ABCA1蛋白在RCT中起限速作用。ABCA1活性也是血浆HDL细胞水平的一个重要的决定因素。
1.2ABCA1基因研究的目的和意义
ABCA1基因的启动子区SNP对ABCA1的表达起着重要的控制作用。到目前为止,已经发现了90多个与疾病有关的ABCA1基因的变异或SNP位点,但是这些SNP在人群中的发生概率差异特别大，需要我们根据对ABCA1基因的结构特点以及与疾病之间的关系，建立致病机理进行差异性的研究，来解决这些疾病问题。
随着人们对ABCA1基因认识的不断深入,对于ABCA1所介导的RCT及基因多样性的研究将有助于研究人类的重大疾病——冠心病的发病机制,预测出疾病的临
床表型,并指导差异化的临床治疗方案[2]。由于目前来调节ABCA1表达的药物特别少，只有辛伐他丁，通心络少数药物,因此深入探讨ABCA1的功能及ABCA1表达的调控机制,对于未来开发和找寻对ABCA1表达有特异性作用的调控药物,起到预防、治疗高脂血症，AS，CAD等疾病，在人类健康方面具有特别重要的意义。1.3基因检测及定量的基本原理
从真核生物的组织或细胞中提取mRNA或总RNA,通过用反转录酶合成cDNA第一链,聚合酶合成cDNA第二链,PCR转化扩增, 即可获得cDNA文库,构建所得的cDNA文库可用于基因的结构、表达和调控的分析或比较cDNA和相应基因组DNA序列差异。即是利用实时定量PCR和2－△△CT法分析基因相对表达量相对定量方法比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异，从而确定基因的扩增的效果。
1.4PCR扩增目的基因
1.4.1RNA的提取要求
基因分离是研究基因结构、功能、表达与调控的必需条件，同时也是进行基因治疗的重要条件。首先是总RNA的提取，要获取正确的总RNA，提取总RNA所使用的基本材料必须选择合适。因为在总RNA中的mRNA具有其明显的组织，细胞特异性。因此，某组织，细胞材料选取不当，则不可能获得预期结果[3]。组织细胞的选择除了种类的选择之外还有细胞状态的选择。我们可以采用目的基因表达的刺激剂来促进细胞表达目的RNA，使其含量增加到期望值。此外，在各种操作中应严格防止RNA酶污染。
1.4.2 cDNA的合成
1.4.
2.1cDNA第一链的合成条件
合成cDNA第一链的方法依赖于反转录酶来催化反应。目前商品化反转录酶有禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。AMV反转录酶包含两个具有很多种酶活性的多肽亚基,这活性中包括依赖于RNA的DNA合成,依赖于DNA的DNA合成，对DNA:RNA的杂交体的RNA进行内切降解(即RNA酶H活性)。而MLV反转录酶只有单个多肽亚基,兼备有依赖于RNA与依赖于DNA的DNA合成酶活性,但是降解RNA:DNA的杂交体中的RNA的能力比较弱,且较AMV对热的稳定性的反转录酶作用差。MLV反转录酶能够合成较长的cDNA。AMV， MLV反转录酶在利用RNA 为模板合成cDNA时，其最适pH值、最适盐浓度、最适温室各不相同,因此在合成第一链时调整相应条件是非常重要。但是AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有
引物来引导DNA的合成。而与真核细胞mRNA分子3"端结合的核苷酸的oligo(dT) 是cDNA合成最常用的引物。
1.4.
2.2 cDNA第二链的合成
cDNA第二链的合成方法有2种，自身引导法和置换合成法。自身引导法，合成单链cDNA 的3"端能够形成一个短的发夹结构,这为第二链的合成提供了自身的引物,当第一链合成的DNA:RNA的杂交链变性后能够利用大肠杆菌的DNA聚合酶ⅠKlenow 片段或者反转录酶来合成cDNA第二链,最后用对单链有特异性的S1核酸酶来消化该环,即可进一步合成。该方法能够容易造成错误故不常使用。置换合成法，这种方法利用第一链在反转录酶的作用下产生的cDNA:mRNA的杂交链不用碱变性,而是在dNTP存在的条件下,利用RNA酶H在杂交链mRNA链上制造成切口和缺口。从而产生一系列的RNA引物,使其成为合成第二链的引物,进而在大肠杆菌的DNA聚合酶Ⅰ的作用之下合成第二链。
1.4.3 PCR荧光定量特点及原理
1.4.3.1 PCR技术的特点
PCR技术操作简便；只要把扩增反应所需的特定程序输入到DNA自动扩增仪中，把所需要的全部反应材料混合均匀，放入仪器内，反应就会按照输入的正确的程序进行。如果需要的话，还可随时加以调整。该方法省时；在基因的分离，突变体的构建，DNA的测序等方面，PCR方法均较常规方法快速得多。跟常规的克隆，培养扩增，纯化的制备等步骤比较获得测序片段更加简便，省时。灵教度高；PCR方法可用于单一的双倍体细胞、一根头发、单一精子进行DNA定型。特异性强；由于TaqDNA聚合酶的耐高温性，导致反应中引物和模板退火的步骤可以在较高的温度条件下进行，结合特异性大大增强，被扩增的目的基因也保持很高的正确程度。对原始材料质t要求低；用石蜡包埋的组织切片，几千年前的出土文物，只需要经过适当的处理，都可用PCR技术进行扩增。PCR技术应用范围广；PCR技术可用于核酸结构和功能的研究各个领域[4]。
1.4.3.2实时荧光定量PCR技术的原理
实时荧光定量PCR技术,系指在PCR反应的体系中加入荧光基团,然后利用荧光信号的积累实时监测整个PCR的进程,最后通过标准曲线对未知的模板进行定量分析的方法[5]。
实时荧光定量PCR技术工作原理是在常规PCR技术的基础上添加了荧光染料或荧光探针。而常规PCR的专门热循环仪具备可监测扩增时的荧光信号的荧光检
测模块。荧光染料具有特异性，它能够掺入DNA双链,发出荧光信号,未掺入的则不发出信号。从而使得荧光信号的增加量与PCR产物增加量成正相关。荧光探针法系指标记在探针的5′端荧光报告基团没被标记在3′端淬灭基团抑制时,报告基团的荧光信号可以被检测到。而荧光信号的强度与反应产物的量正相关,也就是说DNA链每扩增出一条,就会有一个荧光分子形成。
实时荧光定量PCR技术定量原理是PCR循环数，扩增反应的荧光强度与反应管中扩增产物的量成比例关系。由于扩增曲线有两个时期，分别是指数增长期与非指数平台期。在指数增长期, PCR产物量在每个循环大约增加一倍。随着反应的不断进行,反应体系中的成分被消耗,就会进入到平台期。为了在指数期检测到PCR产物的量，需要扩增期PCR产物量与起始量存在一定的关系,才可以在指数期的来检测PCR产物的量,最后推断模板最初的含量。设定一定的荧光信号域值。如果荧光信号被检测到超出域值,就被作为真正的信号,便可以定义域值循环数Ct(C代表循环cycle, t代表域值threshold) 。Ct值是:每个反应管中的荧光信号达到设定的域值时所要经历的循环数[6]。研究证明,各个模板的Ct值与此模板的起始拷贝数的对数存在有线性关系,即起始拷贝数越多Ct值越小。公式表示: Ct = - klogX0 + b(X0 是原始模板数)。利用已知的起始拷贝数的标准品来做标准曲线,只要获得未知的样品的Ct值,便可从标准曲线上得到此样品的起始拷贝数目。
1.5实时荧光定量基因检测方法的应用
随着基因的诊断技术不断发展与成熟,在临床中基因诊断的地位显得更为重要。实时荧光定量PCR ( real - time fluorescent quantitative polymerasechain reaction, real - time FQ - PCR)技术于1996年被美国Applied Biosystems公司推出后，由于此技术不仅实现了PCR 技术从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR技术相比较它所具有的特异性强，灵敏度高，重复性好，定量准确，自动化程度高，速度快，全封闭反应等优点使该技术很快成为科研，临床诊断的热点技术[7]。目前已得到了很广泛的应用,包括mRNA表达的研究，各种基因的定量分析，点突变的分析和等位基因的分析，单核苷酸多态性的分析，DNA甲基化的检测以及对各种传染病进行定量定性的分析。
1.6ABCA1基因研究的现状及发展趋势
到目前为止,已经发现90多个与疾病相关的ABCA1基因变异或者SNP位点,而这些SNP在人群中的发生率差异很大。于是人们从ABCA1基因位点和药物治疗方面进行了该基因的研究。在ABCA1基因位点方面，对于ABCA1基因的报道已经有R219K
型的ABCA1与HDL-C的水平的升高或者动脉粥样硬化(AS)的发生下降趋势呈正相关。通过对R219K的深入研究已经解决了很多与SNP研究方面相关的问题。也有研究表明I883M型的ABCA1可以提高HDL-C，降低TG水平，可以导致心脏事件的发生。但是对于此类研究仍有特别大的争议,因为该基因研究时需要特别大的样本的支持,因而目前对其的认识尚不成熟。在CAD患者的研究方面，有人表明R219K型ABCA1基因的多态性中,R219K等位基因和家族性的高胆固醇血症患者TG水平的降低和HDL-C水平的增高相关,有可能对家族性高胆固醇血症患者的不早发CAD起到保护作用。在Tangier病家族中，中外的研究有所差异，可能是与种族差异有关。需要我们日后进行试验来解决。在研究药物方面，他汀类降脂药物的作用机理是有效减少血浆总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇减少CAD患者的死亡率[8]。目前如何通过提高HDL-C水平来进一步减少CAD的发生是个热门的研究内容。
1.7本研究的目的和意义
ABCA1基因测定与分析是研究ABCA1基因的作用功能以及其与各种遗传疾病关联度的基础。本文运用RT-PCR方法从小鼠肝脏中提取总RNA中克隆了ABCA1基因的cDNA的序列，然后运用Real-time PCR法检测了ABCA1基因的扩增效果，从而确定患有颈动脉粥样硬化的小鼠在服用不同时长的通心络之后ABCA1基因表达水平的变化，为进一步研究与ABCA1基因有关的疾病的课题提供理论依据和基础。
2材料与方法
2.1试验的时间、地点
2.1.1实验时间
2013年10月至2014年1月
2.1.2 实验地点
动物分子育种与转基因创新中心
2.2 实验材料与器材
2.2.1 样品的选取
将患有颈动脉粥样硬化的1，2，3，4号四只小鼠作为实验样品。其中1号小鼠不做任何处理当做空白对照，2，3，4号小鼠分别服用通心络（1 g/kg.d ，1 次/d）1周，2周，4周。取其新鲜的肝脏组织，标注为1，2，3，4，每30-50mg组织在液氮中充分研磨，也可以加入1mlTotal RNAExtractor，用匀浆器匀浆处理。样品体积一般不要超过Total RNAExtractor体积的10%。
2.2.2主要仪器
一次性手套，口罩，坩埚，坩埚棒，基因枪，枪头，酒精棉，玻璃器皿，干燥烘箱，离心机，电泳仪，试管，水浴锅，定量PCR仪：LightCycler480 Software Setup(Roche 罗氏)。
2.2.3主要试剂
液氮，氯仿，异丙醇，75%乙醇，甲酰胺，焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液，蒸馏水，总RNA提取试剂盒，反转录酶，大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片，S1核酸酶，cDNA合成试剂盒，TRIzol试剂，无水乙醇，DEPC H2O, 定量PCR试剂：ABI SybrGreen PCR Master Mix （2X），UltraSYBR二步法荧光定量PCR试剂盒。
2.3 主要试验方法
2.3.1 RNA的提取过程
此过程是在总RNA提取试剂盒的基础上进行的，分别取小鼠1，2，3，4新鲜组织，置于-20度预冷的无菌无RNA酶的研钵中，迅速倒入液氮降温，并同时快速将组织研磨成粉末状；接着向研磨好的组织中加入1MLTRIZOL待其溶解后，迅速移至1.5ML离心管；进行离心，条件是4℃12000rpm下运行10min，取上清；紧接着加入0.5ml异丙醇，混匀，冰上静置20-30min。再在4℃12000rpm下离心10min，弃上清；加入1ml 75%乙醇，洗涤沉淀。4℃，7500rpm的条件下离心5min，弃上清；室温放置晾干或超净台中吹干5min左右，加入适量的Rnase-free H2O溶解，充分溶解RNA。可将所得到的RNA溶液置于-70°C保存或用于后续试验。
2.3.2 cDNA的合成过程
cDNA的合成需要两步，第一步为cDNA第一链合成即在0.2ml PCR管中加入如下试剂：分别取5μl的上述提取的1，2，3，4的total RNA；1μl的Random Primer p(dN)6（0.2μg/μl）；5μl的 Rnase-free ddH2O（cDNA合成试剂盒中的物品）。在70°C温浴5min后冰浴10s，接着离心时加入下列试剂：4.0 μl的5*Reaction Buffer；2.0 μl 的dNTP Mix（10mmol/L）；1.0 μl 的 Rnase inhibitor（20U/μl）；
2.0 μl 的 AMV Reverse Transcriptase（10U/μl）；20.0 μl 的 Total volume （cDNA合成试剂盒中的物品）。再在37°C温浴5min；42°C温浴60min；70°C温浴10min。终止反应；收集cDNA在-20℃保存，接着进行实时荧光定量PCR[7]。
2.3.3荧光定量过程
首先要应用PCR反应体系（20ul）配置反应混合液，具体试剂如下：10ul的2×UltraSYBR Mixture；1ul的Forward Primer；1ul的Reverse Primer；1ul的Template cDNA最后加RNase-Free Water到20ul。
其次进行PCR循环条件，如下表：
表1： PCR循环条件Thermal Cycler Times and Temperatures
LightCycler480 Software Setup(Roche 罗氏) Initial Steps(HOLD) Melt(40 cycles) Anneal/Extend(40 cycles)
3 min 95℃15 sec 95℃40s 60℃
资料来源：UltraSYBR二步法荧光定量PCR试剂盒说明书
最后是进行仪器的操作，将完成上述步骤后，把加好样品的孔板放在LightCycler480 Software Setup(Roche 罗氏)中进行反应。
3.结果与分析
3.1 RNA的提取的纯度分析
在进行完RNA的提取操作后需要进行其纯度的分析，以便之后实验的正常进行，电泳检测-RNA电泳结果如下图：
图1 RNA电泳图
在RNA电泳中条带比较清晰，且在28s这条电泳带比18s电泳带亮度多，说明总RNA提取纯度较高，适宜接下来cDNA的合成。
3.2 荧光定量的分析
根据引物序列（Primer Premier 5.0软件设计）以及管家基因（GAPDH）引物序列：M-Gapdh-F：5' GGTTGTCTCCTGCGACTTCA 3' 58.2
M-Gapdh-R：5' TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC 3' 58.2；扩增产物的序列大小为183bp
目的基因引物序列：
M-ABCA1-F: 5' GTTTGACGCCATCACAGAGC 3' 58.6
M-ABCA1-R: 5' CAACCTTGCCAACTTCCTTTT 3' 58.9；扩增产物的序列大小为95bp
进行适当的实验步骤的优化和改进后，通过Primer Premier 5.0软件设计得到了如下曲线：
图2 内参基因GAPDH扩增曲线
图3 目的基因ABCA1扩增曲线
在PCR扩增中，横坐标是循环数，纵坐标是反应过程中实时荧光强度绘制的曲线。该扩增曲线具有良好的指标，跟内参基因扩增曲线相比较，其曲线拐点清楚，扩增曲线整体的平行性较好，基线平直且没有上扬现象；由于曲线斜率越大扩增的效率越高，所以曲线指数期的斜率与扩增的效率成正比；标准的基线略微下降，无明显的上扬趋势；1,2,3,4各管的扩增曲线平行性好，表明各反应管的
扩增效率相近[9]。
图4 内参基因GAPDH熔解曲线
图5 目的基因ABCA1熔解曲线
该曲线的原理是对PCR产物进行加热，随着温度的升高，双链扩增产物被逐渐的解链，导致PCR荧光强度下降，到达一定温度时，会使得大量的产物解链，荧光性急剧的下降。参照内参基因的曲线发现，目的基因的荧光信号在不同的温度发生不同的变化，但是其曲线走势基本上吻合，说明2,3,4的基因与对照组1基因的特异性相同。
3.3 基因相对定量的结果
3.3.1 基因相对定量的实验结果
由于我们将同样患有颈动脉粥样硬化的四只小鼠，1号小鼠不作任何处理当做对照，2，3,4号小鼠分别服用1周，2周，4周的通心络。故可以采用相对定量
来检测2,3,4号小鼠与1号小鼠ABCA1基因表达水平的差异性
[10]。得到如下结果：
表2 ABCA1基因相对定量结果
图6 ABCA1基因相对表达量
由上图可知服用通心络的患有颈动脉粥样硬化的小鼠，其ABCA1基因相对表达量均有所上升，且与服用通心络的时间成正相关。
3.3.2 基因相对定量的结果分析
相对定量方法是可以用来进行已知基因表达的组织与未知表达基因的组织进行表达性差异的分析方法。经将内标基因进行均一化处理后，通过计算之后，目标基因表达差异的样本相对于已知样本的倍数来表示。对于已知的参照样，△△CT=0，而2-（△△CT ） =1[11]。所以根据原理，已知样本的变化倍数为1。而对于那些未知的样本，相对于对照组基因表达的倍数为2－△△CT[12]。由上表可知2相对于1来说基本上没有差异，3对于1来说有不明显的差异而4对于1就有显著一点的差异。说明同样患有颈动脉粥样硬化的小鼠在服用通心络之后，ABCA1基因的表达水平都有所上调。而且可以得知服用通心络时间越长的小鼠，ABCA1基因的表达水平就越高。
4 讨论
在结果中出现小鼠肝脏组织1,2,3,4之间的ABCA1基因表达水平存在差异，导致差异的存在可能是由如下几方面产生的。
4.1 实验操作中的常见问题
四个样品可能有裂解处理不彻底，RNA 没有被完全的释放出来，或者是得到
样本
ABCA1 GAPDH ?Ct ??Ct 2 -(??Ct) 1
26.76 18.5 8.26 0 1 2
26.13 17.95 8.18 -0.08 1.05702 3
26.97 19.34 7.63 -0.63 1.54756 4 26.81 19.47 7.34 -0.92
1.89212
的RNA沉淀没有被完全的溶解；溶液或离心管没有经过RNase去除处理，使得RNase 的污染导致RNA被降解；这几个样品中含有组织溶剂或碱性溶液，导致水相减少或是pH值升高，使得RNA样品中存在有DNA的污染；RNA样品中存在蛋白和多糖污染均会导致提取的RNA不符合标准，影响到之后的检测；cDNA合成时酶发生了降解；使用试剂盒的药品未按照规定操作来进行，如UltraSYBR二步法荧光定量PCR 试剂盒的反复冷冻。这样均会使得样品和产品性能降低，影响实验效果[13]。
4.2 通心络对小鼠的作用效果的原因
通心络这种药物具有益气活血、通络止血的功效以及能够稀释粘稠的血液、维护血管的正常功能的作用[14]。研究表明通心络对治疗动脉僵硬化的作用机理是因为在其的干预下血脂下降，ABCA1基因的表达水平上调来实现的。本实验的结果符合这个原理，在服用有通心络的患有颈动脉粥样硬化的小鼠比不服用通心络的患有颈动脉粥样硬化的小鼠ABCA1基因的表达水平上升。而且服用的时间越长，其表达水平上升的越大，说明通心络的作用效果会随着时间的增长而不断增强。但由于实验小鼠少，作用时间短，其上升的原因可能不单是由于有通心络而导致的，也有可能是由于小鼠自身遗传原因，患病的严重程度有关。
4.3 本研究对ABCA1基因表达检测的局限性
由于条件有限，我们只采用了四只患有颈动脉粥样硬化的肝脏组织进行研究，虽然本研究采取了空白对照，在实验流程方面都比较成熟，而且使用了高科技水平的仪器与产品化的试剂盒降低很多实验操作中的误差，但是试验样品数较少，说服性不太强。小鼠的患病程度也很难把握，在研究服用了不同时长的通心络之后小鼠ABCA1基因表达效果时，很难进行单因素研究，从而对实验结果产生影响。
5 结论
本文主要针对小鼠肝脏组织中ABCA1基因的RNA的提取，cDNA的合成，PCR荧光定量进行实验，通过PCR扩增曲线来确定了四只小鼠肝脏组织的ABCA1基因的扩增效果较好，通过熔解曲线的吻合程度得知其特异性特别相同，最后通过基因相对表达量的方法，得知了在通心络干预患有颈动脉粥样硬化的小鼠后ABCA1基因的表达量会增多，而且干预的时间越长作用效果越好。ABCA1基因的表达量会增多之后会调控ABCA1细胞表面蛋白的表达，减少胆固醇的流出，达到治疗小鼠疾病的效果。但由于此次试验操作的样品数量较少，实验结果有所误差，今后有待改进。
1.组织块迅速置于预冷的生理盐水中，洗去表面的血迹，将组织称量后切成较小的组织块（0.2-1.0g），放入组织匀浆器中，按组织100mg：提取试剂体积1ml的比例加入相应体积的蛋白提取试剂（需提前加入酶抑制剂）进行匀浆，至组织研磨完全。 2.超声处理（同细胞蛋白样品的制备），处理完后置冰上裂解4-5小时。 3.10000 g/min离心10min，取中层溶液，加入等体积的蛋白上样缓冲液（2X），或1/4体积蛋白上样缓冲液（5x）（AR1112）,置100℃水浴箱沸水浴中变性5分钟。 1、动物肝脏直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次。 2、称量约40mg研磨组织，加入200 ul预冷的组织蛋白抽提试剂，冰上孵育20分钟。 3、10,000×g 离心15分钟。 4、收集上清，进行下一步的实验。 手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。 机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。 反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。 ①吸取培养基，预冷PBS清洗细胞三次，细胞刮刮脱细胞，收集至离心管，1000rpm离心5分钟。洗涤后的细胞转移至洁净EP管，②冰上操作，配制细胞裂解液，1ml Lysis,Buffer 中加入10 μl磷酸酶抑制剂、1 μl蛋白酶抑制剂、5μl 100mM的PMSF。混匀后冰上保存数分钟待用。③在洗涤好的细胞中按照每107个细胞加入1ml细胞裂解液的比例，加入细胞裂解液。200μl移液器反复吹打，至蛋白析出。④4℃摇床，温和振摇15分钟。⑤14000rpm，4℃离心15分钟，上清即为细胞全蛋白提取物。⑥BCA法测蛋白浓度。蛋白分装后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融。提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。 细胞提取步骤 1. 冰上操作，向细胞沉淀中加入200ul细胞裂解液，2μl 100mM的PMSF。 2. 200μl移液器反复吹打，至溶液变得粘稠。 3. 4℃摇床，温和振摇30min。 4. 15000rpm，4℃离心15min，上清即为细胞全蛋白提取物 5. 蛋白分装后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融。
肝切片的实验报告 篇一：肝切片实验报告？ 实验九显微摄影――小鼠肝脏结构年级专业 *班 *组学号姓名αβ 500μm 1 m 2 100μm i 100μm 4 50μm 图版说明： 图1：小鼠肝脏横切部分结构，示肝小叶（a），静脉血管（b）。图2：图1（α部位）的放大，示肝小叶（c）。图3：示肝小叶（d）。图4：示静脉血管（e）。 图5：示肝细胞（f），肝细胞细胞核（g）。图6：图2（β部位)的放大，示上皮细胞（h），上皮细胞细胞核（i），肝血窦（j），中 央静脉（k），肝动脉（l），血细胞（m）。结构说明：肝脏是脊椎动物身体内以代谢功能为主的一个器官，并在身体里面扮演着氧化，储存肝 糖，解读等功能。肝脏由肝小叶组 成，肝小叶是肝脏的基本组成成分，它来执行肝脏的基本职能。而肝小叶又是由肝细胞组成，当肝细胞大量损坏时，肝小叶不能正常工作，影响肝脏 正常生理功能，而出现各种各样的症状。肝小叶成棱柱状，中央有一条中央静脉穿过，肝细 胞围绕中央静脉成放射状排列。肝细胞是一种高度分化并具有多种功能的细胞，胞质内各种细胞器丰富而发达，并
含有 糖原，脂滴等内涵物。细胞器和内涵物的含量与分布常因细胞的功能状况或饮食变化而变动。 一般肝细胞里线粒体含量都比较多，遍布于胞质内，为肝细胞的功能活动不断提供能量。肝细胞核大而圆，居中央，染色质丰富色浅，核膜清楚，核仁1至数个。部分肝细胞（约 25%）有双核，有的肝细胞的核体积较大，为多倍体核。肝血窦位于肝板之间，互相吻合成网状管道。血窦腔大而不规则，血液从肝小叶的周边 经肝血窦流向中央，汇聚到中央静脉。 5 50μm篇二：实验报告(一) 实验名称：实验性空气栓塞实验时间：成绩：实验目的：了解空气栓塞对机体的影响实验材料：家兔，20ml注射器及针头，解剖刀，剪，镊子，面盒，浸有二甲苯的棉球若 干 等实验方法（简要说明）： 1. 先观察家兔的一般状况：活动状态、呼吸频率、嘴唇颜色及瞳孔大小等。 2. 用浸有二甲苯的棉球涂擦一侧耳廓，使局部血管扩张，便于穿刺注射。 3. 用注射器经耳缘静脉注入空气10～15ml，记录时间，
小鼠肝脏过氧化物酶制备与测定
摘要目的分离纯化过氧化氢酶，测定其相关性质。方法采用匀浆、盐析、透析、层析等方法分离纯化过氧化氢酶，采用Lorry 法测定蛋白含量，SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子质量，双倒数法测定酶的米氏常数。结论相对分子质量为60.25kD，以过氧化氢为底物时酶的Km值为0.133mol/L，酶层析后的比活为0.686IU/mg。 关键词小鼠过氧化氢酶纯化米氏常数SDS-PAGE 前言过氧化氢酶(Hydrogen Peroxidase)又名触酶(Catalase，CAT),是一种广泛存在于生物组织的氧化还原酶[1]。过氧化氢酶是一种四聚体血晶素酶, 由四个相同四面体排列的亚基组成,每一个亚基相对分子质量约60000，每一个分子都包含有四个高铁血红素基团,分子量在240000左右[2]。 在人体内以肝和肾脏所含过氧化氢酶活性最高, 结缔组织活性最弱,其它组织如红细胞、脾、小肠、肌肉等均含有过氧化氢酶。过氧化氢酶在细胞内主要与线粒体及过氧化物酶体结合, 在红细胞内呈溶解状态。过氧化氢酶是一种与D－氨基酸氧化酶等一系列需氧脱氢酶相偶联的酶, 具有重要的生理功能。过氧化氢酶能将细胞代谢所产生的毒性物质迅速加以清除, 从而起到和谷胱肽过氧化酶共同保护琉基酶、膜蛋白和解毒的作用。近年来, 过氧化氢酶的活性测定被作为与肿瘤和抗衰老有关的酶学指标而受到关注。[3] 近年来，过氧化氢酶活性的测定被作为与肿瘤和抗衰老有关，蛋白质的分离纯化方法是生命科学领域关注的热点之一。[4] 1实验器材 1.1实验动物 昆明小鼠6只，雌雄不限，由河北医科大学动物实验中心提供。 1.2主要仪器 5200型紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司），UV-5200 冷冻离心机(湖南相依实验仪器开发有限公司)，BCD-185冰箱（青岛海尔公司），微量移液器，40W匀浆器（江苏国华仪器厂），电泳仪（北京六一） 2实验方法
大鼠肝脏组织病理切片的制作和HE 染色 步骤如下： （一）固定与修块 取组织块放入Bouin氏液中，组织块的直径应小于7mm。6小时左右后用双面 刀片将组织块修剪成3-5mm3大小。 （二）脱水与透明 1．75%乙醇50分钟 2．85%乙醇50分钟 3．95%乙醇（I）30分钟 4．95%乙醇（II）30分钟 5．100%乙醇（I）30分钟 6．100%乙醇（II）30分钟 7 1/2 二甲苯（乙醇与二甲苯等体积）20分钟 8．二甲苯（I）20分钟 9．二甲苯（II）10分钟（可依据透明效果而定） 若脱水不好，二甲苯溶液颜色会变混浊。在每一步骤之后，要充分滤干组织 块，一般用筒纸吸干组织块上的液体，以免影响其他液体的浓度，但也要防止组织块干燥。全过程约需要5h。 （三）浸蜡、包埋与修蜡块 1．浸蜡：将60℃恒温箱打开，使石蜡充分溶解，待脱水与透明结束后，将 组织块转入石蜡里，放置于60℃恒温箱120分钟。 2．包埋：将60℃的石蜡倒入纸盒内，然后用小镊子将各组织块按一定的顺 序排列好，使切面朝下。不同组别的同一组织包埋于一个蜡块中，以保证切片和染色条件相同。为防止倒入纸盒内的石蜡底部立刻凝固，可将纸盒置于一玻璃板上（或大培养皿内），然后将玻璃板置于80-90℃左右热水上，包埋时蜡盒底部 要放平，做蜡块的蜡要反复冻融较好。 3．修蜡块：待纸盒内蜡凝固后，用刀片将其修成梯形，组织块与蜡块边缘 之间的距离不得小于2mm。 （四）切片 在载玻片上擦少量甘油蛋白。可滴半滴甘油蛋白于载玻片上，用手指充分抹 匀，呈半干状为佳。切片厚约4-8μm，将切片在55℃左右水浴中展开，展开程度以带黄颜色的组织完全摊平为准。用涂有甘油蛋白的载玻片从水浴中捞取切片，放入37℃烘箱中过夜。每个组织块捞片2张。过夜后，将载玻片置于玻片架上，进行下面的实验。 （五）脱蜡、染色与脱水 倾斜玻片架，将玻片架和载玻片下缘的试剂用筒纸吸干，减轻对其他试剂浓 度的影响。全过程约需要60分钟。 1．脱蜡 （1）二甲苯（I）15分钟 （2）二甲苯（II）15分钟 （3）100%乙醇2分钟 （4）95%乙醇（I）1分钟 （5）95%乙醇（II）1分钟 （6）蒸馏水浸洗1分钟
全基因组重测序数据分析 1. 简介(Introduction) 通过高通量测序识别发现de novo的somatic和germ line 突变，结构变异-SNV，包括重排 突变（deletioin, duplication 以及copy number variation）以及SNP的座位；针对重排突变和SNP的功能性进行综合分析；我们将分析基因功能（包括miRNA），重组率（Recombination）情况，杂合性缺失（LOH）以及进化选择与mutation之间的关系；以及这些关系将怎样使 得在disease（cancer）genome中的mutation产生对应的易感机制和功能。我们将在基因组 学以及比较基因组学，群体遗传学综合层面上深入探索疾病基因组和癌症基因组。 实验设计与样本 （1）Case-Control 对照组设计； （2）家庭成员组设计：父母-子女组（4人、3人组或多人）； 初级数据分析 1．数据量产出：总碱基数量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads统计，测序深度分析。 2．一致性序列组装：与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。3．SNP检测及在基因组中的分布：提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。并根据参考基 因组信息对检测到的变异进行注释。 4．InDel检测及在基因组的分布: 在进行mapping的过程中，进行容gap的比对并检测可信的short InDel。在检测过程中，gap的长度为1~5个碱基。对于每个InDel的检测，至少需 要3个Paired-End序列的支持。 5．Structure Variation检测及在基因组中的分布: 能够检测到的结构变异类型主要有：插入、缺失、复制、倒位、易位等。根据测序个体序列与参考基因组序列比对分析结果，检测全基因组水平的结构变异并对检测到的变异进行注释。
基因组测序基础知识 ㈠De Novo测序也叫从头测序，是首次对一个物种的基因组进行测序，用生物信息学的分析方法对测序所得序列进行组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。 目前国际上通用的基因组De Novo测序方法有三种： 1. 用Illumina Solexa GA IIx 测序仪直接测序； 2. 用Roche GS FLX Titanium直接完成全基因组测序； 3. 用ABI 3730 或Roche GS FLX Titanium测序，搭建骨架，再用Illumina Solexa GA IIx 进行深度测序，完成基因组拼接。 采用De Novo测序有助于研究者了解未知物种的个体全基因组序列、鉴定新基因组中全部的结构和功能元件，并且将这些信息在基因组水平上进行集成和展示、可以预测新的功能基因及进行比较基因组学研究，为后续的相关研究奠定基础。 实验流程： 公司服务内容 1.基本服务：DNA样品检测；测序文库构建；高通量测序；数据基本分析（Base calling，去接头， 去污染）；序列组装达到精细图标准 2.定制服务：基因组注释及功能注释；比较基因组及分子进化分析，数据库搭建；基因组信息展 示平台搭建 1.基因组De Novo测序对DNA样品有什么要求？
(1) 对于细菌真菌，样品来源一定要单一菌落无污染，否则会严重影响测序结果的质量。基因组完整无降解(23 kb以上)， OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；每次样品制备需要10 μg样品，如果需要多次制备样品，则需要样品总量=制备样品次数*10 μg。 (2) 对于植物，样品来源要求是黑暗无菌条件下培养的黄化苗或组培样品，最好为纯合或单倍体。基因组完整无降解(23 kb以上)，OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；样品总量不小于500 μg，详细要求参见项目合同附件。 (3) 对于动物，样品来源应选用肌肉，血等脂肪含量少的部位，同一个体取样，最好为纯合。基因组完整无降解(23 kb以上)，OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；样品总量不小于500 μg，详细要求参见项目合同附件。 (4) 基因组De Novo组装完毕后需要构建BAC或Fosmid文库进行测序验证，用于BAC 或Fosmid文库构建的样品需要保证跟De Novo测序样本同一来源。 2. De Novo有几种测序方式 目前3种测序技术 Roche 454，Solexa和ABI SOLID均有单端测序和双端测序两种方式。在基因组De Novo测序过程中，Roche 454的单端测序读长可以达到400 bp，经常用于基因组骨架的组装，而Solexa和ABI SOLID双端测序可以用于组装scaffolds和填补gap。下面以solexa 为例，对单端测序(Single-read)和双端测序(Paired-end和Mate-pair)进行介绍。Single-read、Paired-end和Mate-pair主要区别在测序文库的构建方法上。 单端测序(Single-read)首先将DNA样本进行片段化处理形成200-500bp的片段，引物序列连接到DNA片段的一端，然后末端加上接头，将片段固定在flow cell上生成DNA簇，上机测序单端读取序列(图1)。 Paired-end方法是指在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点，在第一轮测序完成后，去除第一轮测序的模板链，用对读测序模块(Paired-End Module)引导互补链在原位置再生和扩增，以达到第二轮测序所用的模板量，进行第二轮互补链的合成测序(图2)。 图1 Single-read文库构建方法图2 Paired-end文库构建方法
基因芯片数据处理流程与分析介绍 关键词：基因芯片数据处理 当人类基因体定序计划的重要里程碑完成之后，生命科学正式迈入了一个后基因体时代，基因芯片(microarray) 的出现让研究人员得以宏观的视野来探讨分子机转。不过分析是相当复杂的学问，正因为基因芯片成千上万的信息使得分析数据量庞大，更需要应用到生物统计与生物信息相关软件的协助。要取得一完整的数据结果，除了前端的实验设计与操作的无暇外，如何以精确的分析取得可信数据，运筹帷幄于方寸之间，更是画龙点睛的关键。 基因芯片的应用 基因芯片可以同时针对生物体内数以千计的基因进行表现量分析，对于科学研究者而言，不论是细胞的生命周期、生化调控路径、蛋白质交互作用关系等等研究，或是药物研发中对于药物作用目标基因的筛选，到临床的疾病诊断预测，都为基因芯片可以发挥功用的范畴。 基因表现图谱抓取了时间点当下所有的动态基因表现情形，将所有的探针所代表的基因与荧光强度转换成基本数据(raw data) 后，仿如尚未解密前的达文西密码，隐藏的奥秘由丝丝的线索串联绵延，有待专家抽丝剥茧，如剥洋葱般从外而内层层解析出数千数万数据下的隐晦含义。 要获得有意义的分析结果，恐怕不能如泼墨画般洒脱随兴所致。从raw data 取得后，需要一连贯的分析流程(图一)，经过许多统计方法，才能条清理明的将raw data 整理出一初步的分析数据，当处理到取得实验组除以对照组的对数值后(log2 ratio)，大约完成初步的统计工作，可进展到下一步的进阶分析阶段。
图一、整体分析流程。基本上raw data 取得后，将经过从最上到下的一连串分析流程。(1) Rosetta 软件会透过统计的model，给予不同的权重来评估数据的可信度，譬如一些实验操作的误差或是样品制备与处理上的瑕疵等，可已经过Rosetta error model 的修正而提高数据的可信值；(2) 移除重复出现的探针数据；(3) 移除flagged 数据，并以中位数对荧光强度的数据进行标准化(Normalized) 的校正；(4) Pearson correlation coefficient (得到R 值) 目的在比较技术性重复下的相似性，R 值越高表示两芯片结果越近似。当R 值超过0.975，我们才将此次的实验结果视为可信，才继续后面的分析流程；(5) 将技术性重复芯片间的数据进行平均，取得一平均之后的数据；(6) 将实验组除以对照组的荧光表现强度差异数据，取对数值(log2 ratio) 进行计算。 找寻差异表现基因 实验组与对照组比较后的数据，最重要的就是要找出显著的差异表现基因，因为这些正是条件改变后而受到调控的目标基因，透过差异表现基因的加以分析，背后所隐藏的生物意义才能如拨云见日般的被发掘出来。 一般根据以下两种条件来筛选出差异表现基因：(i) 荧光表现强度差异达2 倍变化(fold change 增加2 倍或减少2倍) 的基因。而我们通常会取对数(log2) 来做fold change 数值的转换，所以看的是log2 ≧1 或≦-1 的差异表现基因；(ii) 显著值低于0.05 (p 值< 0.05) 的基因。当这两种条件都符合的情况下所交集出来的基因群，才是显著性高且稳定的差异表现基因。
碱法提取小鼠总DNA及基因鉴定： 一、实验器材：加样枪（1ml、200ul、20ul、10ul）、枪头（大中小一套）、EP管（20ul、1.5ml、 10ml）、试管架、浮标、温度计、胶布、手套、记号笔、锥形瓶、称量匙、冰盒 二、实验试剂：A液、B液、引物、mix、双蒸水、三蒸水、琼脂糖、TBE（5x、1x、回收液）、 核苷酸染料、Marker 三、母液配置： 1.10M NaOH:NaOH 40g加双蒸水至90ml，待NaOH完全溶解冷却后定容至100ml 2.0.5M EDTA：EDTA.Na2盐18.61g, NaOH 1.5g, 加双蒸水至80ml,逐滴加入10M NaOH 至EDTA完全溶解后加双蒸水定容至100ml 3.1M TrisHCl（pH8.0）：Tris碱12.1g，加水至70ml，边搅拌边加入浓盐酸4ml，然后 边逐滴加入1M HCl边测PH值，直至PH升至8.0（+\-0.05），定容至100ml（pH=8.8 的TrisHCl中边加入浓盐酸边测PH值至PH=8.0（+\-0.05）为止） 四、实验步骤： 1.剪取鼠尾（约芝麻大小）储存于-20度冰箱（-20度冰箱，主要是防止DNA降解，4度不 行） 2.提取DNA： 1)配置工作液——20ml体系液：50ul 10M NaOH 加双蒸水至20ml 8ul 0.5M EDTA B液：800ul 1M TrisHCl（pH8.0）加双蒸水至20ml 2)加150ulA液（液体应完全浸没标本），95度水浴锅煮1.5h（将EP管插入浮标 中后用胶布缠好防止EP管在加热过程中爆开） 3)加150ulB液，混匀（上下颠倒3-5下） 4)12000r/min 4度离心5分钟（可储存于-20度冰箱） 3.PCR（冰上操作）：P1 0.5ul（P为AC3I，G为AAA） 1)配置PCR体系——15ul体系P2 0.5ul Mix 7.5ul 三蒸水4.5ul DNA 2ul 2)加2ul上述离心后的上清液至PCR体系，瞬离 3)PCR仪扩增，参数设定：预变性：94度——3min 变性：94度——30s 退火：55度——30s 30个循环 延伸：72度——24s 72度——5min 4度——∞ 4.琼脂糖凝胶电泳： 1)制胶——2%琼脂糖凝胶配方： 总体积（ml）20 30 40 50 60 120 琼脂糖（g）0.4 0.6 0.8 1 1.2 2.4 TBE 1x（ml）20 30 40 50 60 120 Tris-base 13.6g TBE 5x配方：硼酸 6.56g EDTA 0.73g
实验四 肝组织中核酸的提取和鉴定 【目的】 验证核酸的三大组成成分。熟悉组织中核酸的提取与鉴定的基本操作方法。 【原理】 动物组织细胞中的核糖核酸（RNA ）与脱氧核糖核酸（DNA ）大部分与蛋白质结合而形成核蛋白。被三氯醋酸沉淀的核蛋白，先用95%的乙醇加热去除附着在沉淀上的脂类杂质，再用1.7mol/L NaCl 溶液提取出核酸的钠盐，然后加入乙醇即可使核酸钠盐沉淀析出。 RNA 与DNA 均可被硫酸水解产生磷酸、含氮碱基(嘌呤与嘧啶)及戊糖（RNA 为核糖，DNA 为脱氧核糖）。此三类物质分别可按照下述原理鉴定。 1.磷酸 磷酸与钼酸铵试剂作用生成黄色磷钼酸，磷钼酸中的钼在有还原剂（硫酸亚铁）存在时可被还原成蓝色的钼蓝。根据此呈色反应即可鉴定磷酸的存在。 2.嘌呤碱 根据嘌呤碱能与硝酸银产生灰褐色的絮状嘌呤银化合物而鉴定。 3.戊糖 根据核糖经浓盐酸或浓硫酸作用则生成糠醛，后者能与3，5二羟甲苯缩合而形成绿色化合物而鉴定。 CHO C H C H C H CH 2OH OH OH OH O CHO O H CH 3 C O CH 3 O C H 3OH -H 2O 核糖 3，5-二羟甲苯 糠醛 绿色化合物 脱氧核糖在浓酸中生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，它和二苯胺作用生成蓝色化合物。 CHO C H C H C 2OH H H O -H 2O 浓酸脱氧核糖 蓝色化合物 CHO C H C H C H CH 2OH H OH OH ω-羟基-γ-酮基戊醛 二苯胺 【器材】 剪刀、镊子、玻棒、滤纸、试管、试管架、蒸发皿、匀浆器、离心机、沸水浴箱。 【试剂 1.生理盐水。
小鼠肝脏组织取材步骤 小鼠肝脏组织取材步骤，并列出完成此次实验所需要的试剂、仪器、材料等相关物品及实验人员安排情况。 材料：小鼠 试剂：DMEM 戊巴比妥钠 75%酒精 PBS 器械消毒液戊二醛 仪器：解剖台备皮刀弯盘组织剪眼科剪手术刀柄刀片血管钳眼科镊 培养皿无菌手套 实验人员安排：小鼠养殖管理组准备工作组实验操作组 实验步骤: 1. 取材前夜禁食，自由饮水。 2. 小鼠称重，按照50mg/kg的比例用5ml的注射器配合针头抽取戊巴比妥钠备用。 3. 正左手的小指和无名指抓住大鼠的尾巴，另外三个手指抓住大鼠的颈部，使大鼠头部向向下。这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。右手持注射器，从腹部近腿根处刺入后再腹部皮下穿行深入，动作轻柔，缓慢注射。注射完药物后，缓缓拔出针头，手指按住针口对小鼠腹部轻柔按摩，促进麻醉药物的吸收，掐小鼠尾部检测小鼠麻醉程度。 4.将小鼠四肢固定于解剖台上，暴露小鼠整个胸部和腹部，修剪去腹部毛发，75%酒精消毒。 5.沿腹侧正中线自阴茎上源由下而上剪开腹部皮肤直至剑突，向两侧钝性剥开皮肤与皮下组织，暴露腹壁浅肌层。沿白线钝性分离腹壁肌肉，剪开腹膜，暴露腹腔，将肝脏向上翻起，显露肝门，眼科剪剪除肝脏周围结缔组织和血管。 6.结扎剪断肝门管道系统，钝锐结合完整取出大鼠肝脏，放置于无菌培养皿，生理盐水冲洗，称重并记录。①切取肝左叶约1mm×1mm×1mm组织3块，3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH 7.4)或4-戊二醛固定；②左叶肝组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；③右叶肝组织称重记录分装后全部放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。 7.切取肝左叶约1mm×1mm×1mm组织3块，3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH7.4)或4-戊二醛固定；左叶肝组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；右叶肝组织称重记录分装后全部放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。
课题-基因敲除小鼠的pcr鉴定
一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN 等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。 二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"
（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程
1、原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经 常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，- 105 - 蛋白质提取与制备Protein Extraction and Preparation 因而对提取要求更复杂一些。 原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成 本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷 冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。但在磨细时局部往往生热导致变性或pH 显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时。磨细剂的吸附也可导致损失。 ⑵物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。 Ⅰ反复冻融法 于冷藏库或干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大 部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性。 Ⅱ冷热变替法 将材料投入沸水中，于90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部 分细胞被破坏。 Ⅲ超声波法 暴露于9～10 千周声波或10～500 千周超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便 且效果也好，但一次处理量较小。应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在。处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。 Ⅳ加压破碎法 加一定气压或水压也可使细胞破碎。
大鼠肝脏脂肪组织石蜡包埋切片 本实验室现提供整体实验课题外包服务，如大鼠肝脏，脂肪组织石蜡切片，免疫组化整体实验代做，小鼠心肌细胞培养，后续Western blot,荧光定量PCR 检测等，因本实验室自己课题量也较多，所对外承接课题数量有限，如有需要的同学请在线提前预约（即将毕业研究生优先）。 制作优质大鼠各器官石蜡切片 1.1标本：大鼠各个脏器———心、肝、脾、肺、肾、大脑、脊髓、胃肠、垂体、胸腺、淋巴结、肾上腺、卵巢、睾丸、子宫、膀胱、附睾。 1.2固定液：中性甲醛溶液，固定时间为24h。 1.3取材：心脏：最大纵断面取1块，厚度为2mm肝脏：右叶纵断面取1块，厚度为2mm；脾脏：纵断面取1块，厚度为2mm肺脏：纵断面取1块，厚度为2mm；肾脏：最大面剖开取一半，包括皮质、髓质和肾盂；大脑：最大面剖开取一半；脊髓：横断面剖开取1块，厚度2~3m;胃：沿大弯侧剪开，纵切一长条，长1cm，宽2mm；肠：横断面切取一段，约2mm；垂体：全包；胸腺：全包；淋巴结：全包；肾上腺：全包；卵巢：全包；子宫：横断面剖开取一段，厚度2mm；睾丸：最大面剖开，取半；附睾：纵断面剖开取半；膀胱：剖开取半。 1.4包埋：胃肠、子宫、膀胱立埋，其余脏器平埋，蜡温为65~70℃。 1.5切片：厚度4μm，摊片水温56℃左右，选取无皱折的4片。 动物组织石蜡切片苏木素-伊红（HE）染色切片置70℃的烤箱中30min 入二甲苯脱蜡20min；入梯度乙醇100%→95%→85%→75%，自来水冲洗2min；入苏木精30min，取出自来水冲洗2min；入盐酸乙醇分化5s，自来水冲洗2min；入伊红5s，自来水冲洗2min；入梯度乙醇75%→85%→95%Ⅰ→95%Ⅱ→100%入二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ；中性树胶封片。
基因表达谱芯片的数据分析(2012-03-13 15:25:58)转载▼ 标签：杂谈分类：生物信息 摘要 基因芯片数据分析的目的就是从看似杂乱无序的数据中找出它固有的规律, 本文根据数据分析的目的, 从差异基因表达分析、聚类分析、判别分析以及其它分析等角度对芯片数据分析进行综述, 并对每一种方法的优缺点进行评述, 为正确选用基因芯片数据分析方法提供参考. 关键词: 基因芯片; 数据分析; 差异基因表达; 聚类分析; 判别分析 吴斌, 沈自尹. 基因表达谱芯片的数据分析. 世界华人消化杂志2006;14(1):68-74 https://www.doczj.com/doc/d2376603.html,/1009-3079/14/68.asp 0 引言 基因芯片数据分析就是对从基因芯片高密度杂交点阵图中提取的杂交点荧光强度信号进行的定量分析, 通过有效数据的筛选和相关基因表达谱的聚类, 最终整合杂交点的生物学信息, 发现基因的表达谱与功能可能存在的联系. 然而每次实验都产生海量数据, 如何解读芯片上成千上万个基因点的杂交信息, 将无机的信息数据与有机的生命活动联系起来, 阐释生命特征和规律以及基因的功能, 是生物信息学研究的重要课题[1]. 基因芯片的数据分析方法从机器学习的角度可分为监督分析和非监督分析, 假如分类还没有形成, 非监督分析和聚类方法是恰当的分析方法; 假如分类已经存在, 则监督分析和判别方法就比非监督分析和聚类方法更有效率。根据研究目的的不同[2,3], 我们对基因芯片数据分析方法分类如下: (1)差异基因表达分析: 基因芯片可用于监测基因在不同组织样品中的表达差异, 例如在正常细胞和肿瘤细胞中; (2)聚类分析: 分析基因或样本之间的相互关系, 使用的统计方法主要是聚类分析; (3)判别分析: 以某些在不同样品中表达差异显著的基因作为模版, 通过判别分析就可建立有效的疾病诊断方法. 1 差异基因表达分析(difference expression, DE) 对于使用参照实验设计进行的重复实验, 可以对2样本的基因表达数据进行差异基因表达分
小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型 缺血再灌注损伤，即缺血器官、组织重新获得血液供应，不仅不能使组织、器官功能恢复，反而加重了功能代谢障碍及结构破坏。对麻醉动物的肝中叶和肝左叶的门静脉和肝动脉进行阻断和再通，由于肝脏中叶和左叶血流的阻断和再通，引起肝脏中叶和左叶明显的再灌注损伤。肝脏缺血过程中由于肝细胞内ATP 迅速耗尽，导致乳酸酮体等的堆积，及线粒体氧化磷酸化功能低下，引发代谢性酸中毒，缺血过程中细胞缺氧使ATP含量下降，导致肝细胞内外Ca2 +重新分布，即Ca2 +内流，引起线粒体的损伤。再灌注过程中由于氧自由基的爆发性增多，中性粒细胞的聚集，kupffer细胞的激活，细胞凋亡及其他多种细胞因子的作用，使得肝细胞膜损伤，内皮细胞损伤及肝脏微循环障碍等导致肝脏功能代谢障碍及结构破坏。 1.实验动物 SPF级Balb/C小鼠，雄性，周龄为4w~6w，体重为20g~22g。 2.实验分组： 实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。 3.实验周期 0h、3h、6h、12h、24h、72h 4.建模方法 1 小鼠术前1 2 h禁食，自由饮水。 2 3%戊巴比妥钠80mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后将小鼠平躺在手术台上胶带固定四肢，将小鼠腹部术去毛，用碘酒和75％乙醇术区消毒。 3 取腹正中切口1cm，打开腹腔，小心分离出肝脏左、中叶之肝蒂（左、中叶肝脏供血的门静脉和肝动脉）。 4 用无创血管夹夹闭中叶和左叶的门静脉和肝动脉，使约70%的肝脏缺血，以防止发生严重肠系膜静脉淤血。0.5min后，与非阻断的右叶相比，肉眼可见阻断叶明显变白，说明阻断成功，用止血钳夹闭皮肤切口临时关闭腹腔，同时将小鼠放在37℃恒温加热垫上保温。 5 完成持续缺血60min后，重新打开腹腔，迅速取出血管夹，恢复缺血肝血流，
【篇一】基因数据分析求职简历 姓名： 一年以上工作经验|男|25岁（1991年4月16日）居住地：吉林 电话： E-mail： 最近工作［5个月］ 公司：XX有限公司 行业：制药/生物工程 职位：基因数据分析 学历 学历：本科 专业：生物信息学 学校：吉林大学 求职意向 到岗时间：一个月之内 工作性质：全职 希望行业：制药/生物工程 目标地点：吉林 期望月薪：面议/月 目标职能：基因数据分析 工作经验
2014/2—2015/7：XX有限公司［5个月］ 所属行业：制药/生物工程 研发部基因数据分析 1、内部技术支持，为研发人员/科学家提供科学相关的信息技术支持。 2、内部及外部科学软件的培训与支持。 3、科研问题的信息化解决方案，对项目进行需求分析，支持科学系统的开发工作。 2014/4—2015/1：XX有限公司［9个月］ 所属行业：制药/生物工程 开发部基因数据分析 1、分析不同血清型的肠出血性大肠杆菌（EHEC）内蛋白质的DDA和SWATH 质谱数据。 2、分析不同血清型的特异型肽段，预测未知EHEC的。血清型。 3、用R语言处理基因树数据库，由基因树上的进化信息找出可能共同进化的基因。 教育经历 2010/9—2014/6吉林大学生物信息学本科 证书 2011/12大学英语四级 语言能力 英语（良好）听说（良好），读写（良好） 自我评价 勤奋务实，刻苦钻研，善于思考，看待事情较全面。热爱跑步，爬山，阅读，热心积极向上。适应能力强，能承受压力，聪明，接受新知识快。性格开朗活泼
不内向，对生物及制药行业有热情，知识基础优秀。具备良好的逻辑思维能力，语言表达能力强，具有良好的人际沟通和团队合作能力，有一定的领导能力。 【篇二】基因数据分析求职简历 姓名： 年龄：26岁 居住地：西安 联系电话： 电子邮箱： 求职意向 到岗时间：一周以内 工作性质：全职 希望行业： 目标地点：西安 期望月薪：面议/月 目标职能： 工作经验 2012/7—至今：XX金融证券有限公司 所属行业：金融/投资/证券 研发部证券分析师 1、负责通过股市报告会、面谈等形式，营销理财服务。 2、负责分析目标板块的上市公司的基本面，列出投资原因，并给出风险提示。 3、负责宏观经济、政策走向分析及解读。
基因敲除小鼠的PCR鉴定 一、实验目的： 通过PCR扩增程序及琼脂糖凝胶电泳方法鉴定凝血因子IX基因敲除小鼠的基因型。 二、实验原理： 真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。 1.PCR原理： PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 1) 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 2) 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 3) 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 2.琼脂糖凝胶电泳原理： 在pH8.0~8.3的缓冲液中，核酸分子带负电荷，向正极移动。由于不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同，因此在自由泳动时，各种核酸分子的迁移率相似，无法分开。然而，在浓度适当的凝胶中，由于分子筛效应，使大小和构象不同的核酸迁移率出现差异，从而把它们分开。核酸在凝胶中的迁移率取决于其分子大小、高级结构、胶浓度和电场强度，与分子的碱基组成及电泳温度（4~30℃之间）无明显关系。一般说，同样构象的分子迁移率与分子量对数及胶浓度成反比，与电场强度（小于5V/cm）成正比。 三、实验操作 1.获取鼠尾组织 剪鼠尾0.5cm置于试管中，加入500ul裂解液和10ul蛋白酶K(20mg/ml)，55℃水浴过夜，至鼠尾溶解 2.提取基因组DNA 1) 试管中加入300ul饱和NaCl，充分混匀，12500rpm 离心20min
1肝组织蛋白的提取 准备物品：PBS （提前消毒，4℃过夜备用），平皿，眼科剪，小镊子，匀浆器，枪头，EP管（以上物品需高压消毒备用），冰盒（所有操作均在冰上） 1）取出肝组织块于平皿中，加入PBS漂洗，切下约黄豆大小的肝组织放入手动匀浆器中，在冰上迅速碾磨直至呈现云雾状 2）加入组织裂解液约500μL（裂解液:PMSF=100:1），冰上作用20~30min 3）吸取组织液到已高压灭菌的Ep管中，4℃离心，12000rpm×15min 4）取出EP管放在冰盒内,仔细吸取上清，取2μl的上清用于蛋白浓度的测定 5）剩余上清，按蛋白：5xbuffer=4:1的比例加入5xbuffer,煮沸10min 6）瞬时离心，放入-20℃冰箱冻存备用。 2. RNA抽提 1、取等量肝组织，液氮中磨碎； 2、加入TRIZOL Reagent lml，室温孵育5min； 3、 )b[I)k2001al氯仿剧烈振荡l 5sec，室温孵育2min； 4、 4℃，12，000rpm，离心15min； 5、吸取上层含有RNA的水相入新管，Dla入500rtl异丙醇沉淀RNA，室温孵育l 0min； 6、 4℃，12，000rpm，离心l 5min； 7、弃上清，加入lml 75％的乙醇洗涤RNA沉淀，4"C，75009，离一L,5min；
8、干燥RNA，用20tal DEPC水溶解RNA； 9、用紫外分光光度计测定RNA的含量，．20℃保存，准备做RT．PCR。 2蛋白浓度测定 1）蛋白标准液（用BSA配制）25mg/ml储存液，稀释为0.5mg/ml，稀释步骤：例：10μL 25mg/ml的蛋白标准液＋90μL PBS混合成2.5mg/ml蛋白标准液20μL 2.5mg/ml的蛋白标准液＋80μL PBS混合成0.5mg/ml蛋白标准液2）需设置八个标准孔以绘出标准曲线，采用BCA试剂盒测出蛋白浓度，标准孔设置及所加试剂量如下： 试剂添加量（μL） 蛋白标准液 3）配制BCA蛋白测定液，溶液A：溶液B=50：1先混合均匀，至完全互溶备用4）待测蛋白孔加：2μL蛋白液+18μL PBS，每孔的体积均为20μL 5）每孔加180μL配好的BCA蛋白测定液，使每孔总体积均为200μL； 6）室温避光放置两个小时或37℃放置30min； 7）用酶标仪测出每孔的吸光度，（570nm），测三次； 8）用excel工具根据标准孔的数据作散点图，并做出直线及公式。以标准孔的浓度为X轴（分别为0，0.0025，0.005，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05），以所测标准孔的吸光度为Y轴，绘制线性关系图，并取相关度（R2值）最高的公式代入计算出需测的蛋白浓度，进而计算出做Western的每孔加样量=（所需上样的蛋白量）/（蛋白浓度×100）μL。 （注：文档可能无法思考全面，请浏览后下载，供参考。可复制、编制，期待 你的好评与关注）