小鼠肝细胞原代培养
小鼠肝细胞原代培养
实验目的：
1.了解并掌握原代细胞培养的相关原理
2.了解并掌握小鼠肝细胞原代培养的方法
实验器材：
二氧化碳培养箱、光学显微镜、无菌操作台、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿、烧杯、镊子、酒精棉、离心管、电动移液器、移液管、细胞计数板、幼鼠、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、0.125％胰蛋白酶（含0.1%胶原酶）、D-Hanks或者PBS等。
原代培养是从供体中取得组织或细胞后在体外进行的首次培养。原代培养不仅是建立各种细胞系的第一步，也是从事组织或细胞培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。原代培养的组织或者细胞的生物学特性没有发生很大变化，仍具有二倍体遗传物质，最接近和反映体内生长特性，很适合作药物测试、基因表达测试、细胞分化等实验研究。
原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种成分组成，比较复杂，即使同一类型细胞如成纤维样细胞或上皮样细胞，细胞间也存在很大差异。如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差别也可以在细胞上反映出来。因而原代细胞的部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需要对原代培养的细胞进行短期传代后再进行（需要注意的是有些细胞在传代后可能会发生一些生物学特性的变化）。一般采用2-5代的细胞进行实验。当然特殊情况和一些终端分化细胞如神经细胞、巨噬细胞、心肌细胞除外。
原代培养的方法很多，最基本和最常用的为组织块原代培养法和离散细胞原代培养法（消化法）。
组织块原代培养：
组织块原代培养法是原代细胞培养常用的基本方法，适用于各种组织的原代培养，特别是难以消化的组织，组织块原代培养法操作程序简单，培养前不经过酶液处理，细胞损伤较小。但由于培养过程中细胞移动受到较大限制，完成原代培养所需的时间较长。
组织块培养的程序一般为：
1.组织块修整：将组织块用平衡缓冲液反复冲洗，然后在灭菌的培养
皿中剪碎至碎块的直径小于1mm3。
2.贴壁：将组织块间隔（小块之间的间隔为1cm）放在培养皿中，培
养基需要浸没组织块底部但不能使组织块浮起。
3.培养：通过生长繁殖，细胞可以从组织块边缘向四周游出，最终生
长繁殖连成片，原组织块可以完全消失。
离散细胞原代培养：
动物细胞在体内有严密的组织结构，多数组织的形态是固体结构，细胞与细胞或者细胞与细胞间质之间联系紧密，要得到大量的离散细胞就必须进行人工分离（消化培养）。也有部分组织的细胞自然状态下就是松散的，从体内取出后不用处理（如血细胞）或稍加处理（如脾细胞）就可以得到细胞悬液。细胞离散后由于每个细胞都能与支持物接触，营养供应均匀，因此适应快、增殖快、建系快。
通常的离散细胞原代培养步骤为：取材、剪切、消化、接种。
原代培养的细胞往往在制备时含有很多细胞种类，这就需要对分离的细胞进行纯化，细胞纯化分为悬浮细胞纯化和贴壁细胞纯化。
悬浮细胞纯化多使用密度梯度离心法和表面抗原法（需要固化的抗体，如各种细胞分离柱）。
贴壁细胞纯化通常是细胞贴壁法（依据贴壁的快慢）和酶消化法（依据贴壁的细胞对消化酶的敏感程度不同）。
肝脏是由肝细胞组成，肝细胞极小，肉眼看不到，必须通过显微镜才能看到。人肝约有25亿个肝细胞，50个肝细胞组成一个肝小叶，因此人肝的肝小叶总数约有50万个。肝细胞为多角形，直径约为20微米，有6-8个面，不同的生理条件下大小有差异，如饥饿时肝细胞体积变大。每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种。肝细胞里面含有许许多多复杂的细微结构：如肝细胞核、肝细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基氏体、微粒体及饮液泡等组成。
肝细胞具有多种功能且代谢旺盛，离体培养的大鼠肝细胞用于毒理学、药理学、生物化学及致癌作用等研究有许多优点。医学上常培养肝细胞作为理想的体外模型,在肝病研究、护肝药物的研发等诸多方面发挥着日益重要的作用。但肝细胞在体外增殖能力差，原代培养难以成功，故在一定程度上限制了肝细胞培养的广泛开展。制备离体肝细胞常用的方法有非酶分离细胞法、离体肝脏酶消化分离法以及在体肝脏酶灌注法。
实验步骤：
1.在玻璃培养皿中装满冰后倒置成冰台，同时取3个60mm培养皿，加入2毫升
预冷的PBS，标记上1、2、3（1号和2号培养皿需要放在冰台上使用）。
2.将麻醉过的小鼠平放在解剖台上，用乙醇擦洗其胸部及腹部。在小鼠的肋骨
下沿胸骨方向剪一口，摘除小鼠的肝脏并转移到1号培养血中（注意一定不要弄破内脏，以免带来严重污染，解剖工具必须泡在75%乙醇中，用过即洗），剔除心脏上的结缔组织和血块后转入2号培养皿。
3.彻底清洗肝脏后转入3号培养皿（用注射器冲洗肝脏内部至肝脏呈灰白色）。
4.用解剖剪把肝脏切碎成1mm3大小后把含有组织块的溶液转入15毫升离心管。
5.静置静置待组织沉淀后弃上清，加入5毫升胰蛋白酶，37℃孵育5分钟后加入
几滴胎牛血清终止消化。
6.用注射器的橡胶头轻轻研磨组织块成糊状，把含有组织的溶液用200目的尼龙
筛网过滤到新的离心管中。
7.1000转离心5分钟，缓慢吸去上清，用DMEM重悬后，1000转离心5分钟，尽
量消除残留的胰酶（操作在细胞间的超净工作台中进行）。
8.加入含20%胎牛血清的完全培养基重悬沉淀后，把肝细胞铺到培养皿中，于
37℃、5%CO2条件下培养，24小时首次换液，以后每2天换液（操作在细胞间的超净工作台中进行）。
肝细胞接种培养4小时即可看到有部分细胞贴壁，24小时后细胞已基本贴壁，这时可以换液除去血细胞，3天左右培养瓶中出现成群的新生细胞集落并向周围生长。
肝细胞刚接种时有两种形状：一种体积较小胞浆颗粒较多；一种体积较大胞浆透明。两种细胞均为圆形或椭圆形，培养5天时，细胞贴壁牢固，体积明显增大，伸展生长成上皮样并相互连接融合成片。一般为了帮助细胞贴附可以在培养器皿上先涂上一层胶原或者一些促贴附成份（如Matrix等）
小白鼠的解剖示意图
解剖时切勿打开腹腔，剪破消化道和内脏会带来严重污染
小鼠肝细胞原代培养
实验作业：
1.为什么在消化组织块时加入胶原酶？
2.200目的滤网作用是什么？
3.为什么用注射器冲洗肝脏内部至肝脏呈灰白色？
4.如果分离的肝细胞贴壁不牢，需要怎样来帮助肝细胞贴壁？
【嘉美生物】肝是生物转化和蛋白质合成的主要器官，也是药物毒性作用发挥的主要场所。因此许多的体外测试都选用肝细胞来研究药物间的相互作用和其他一些生化过程。 嘉美生物用于培养原代细胞的组织采集于各大医院（包括协和医院、301医院、北三医院等），采集根据美国IRB 和HIPAA批准的方案进行。这些原代细胞均来自新鲜组织，并采用公司专利的技术来优化目的细胞生长条件，降低杂细胞（如脂肪细胞、纤维细胞等）的污染。分离的细胞经过短暂培养、传代，然后迅速冻存。这些保持分化状态的细胞可以用于评估体外药物模型系统和调节特定基因的遗传功能。 嘉美生物原代肝细胞产品均经过严格的QA/QC检测，可以直接用于药物优化和筛选、基因克隆、表达图谱分析以及各种分子生物学和药物学实验的研究。 凭借着先进的技术设备和资深的专业经验，嘉美生物能为您提供高品质的原代细胞产品和特殊的定制服务： 1、各种新鲜原代肝细胞 嘉美生物除提供多种人、小鼠、大鼠、猴等新鲜肝细胞产品外，嘉美生物还可以为您提供特定动物、特定组织、特定年龄的新鲜肝细胞定制服务。 2、各种原代细胞提取物 嘉美生物除提供的人、小鼠、大鼠、猴等四大类的肝微粒体、肝S9、CYP450酶和其他亚细胞提取物外，嘉美生物还可以为您提供专业的原代细胞提取物定制服务。 嘉美生物可以同时提供高质量的原代细胞产品和专业的个性化定制服务，为您的研究提供最新鲜优质的实验材料，提供其他原代细胞相关专业服务（原代肝细胞靶药分析服务、原代细胞靶药优化服务和原代细胞药物筛选等）。嘉美生物能完美整合各类原代细胞类服务，是原代细胞分离，原代细胞提供，原代细胞实验课题服务中的佼佼者。
World Journal of Cancer Research 世界肿瘤研究, 2015, 5, 15-20 Published Online January 2015 in Hans. https://www.doczj.com/doc/e67816764.html,/journal/wjcr https://www.doczj.com/doc/e67816764.html,/10.12677/wjcr.2015.51003 Orthotropic Transplantation to Establish H22 Hepatocellular Carcinoma Model in Mice Chen Han1,2, Hengxiao Wang1,2*, Zhaoxia Wang3 1Department of Immunity, Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan 2School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan 3Department of Pathology, Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan Email: *wanghengxiao@https://www.doczj.com/doc/e67816764.html, Received: Nov. 24th, 2014; revised: Dec. 22nd, 2014; accepted: Dec. 30th, 2014 Copyright ? 2015 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.doczj.com/doc/e67816764.html,/licenses/by/4.0/ Abstract Objective: To establish a liver orthotropic transplantation tumor model with H22 cells, for the further development of the related experimental study. Methods: A certain number of H22 cells were directly injected in the left lobe of the liver in C57BL/6 mice, establishing a transplanted tu-mor model of hepatocellular carcinoma in situ. Results: After 7 days of surgery, the liver surface appeared irregular size nodules, nodules increased with the prolongation of time increases, the late abdominal organs appeared invasion, adhesion, ascites was increased. Histopathological ex-amination of liver tumor tissues and adjacent tissues of cancer showed that liver orthotropic transplantation tumor formation rate was 100%, no spontaneous regression. Conclusions: Ortho-tropic injection of H22 cell established orthotropic transplantation tumor formation in the liver, and the tumor formation time was relatively short, tumor formation processes associated with organ metastasis and ascites. This model was reasonable to simulate the pathological and physio-logical body of liver cancer in human, and could satisfy the requirement of research on liver can-cer. Keywords Hepatocellular Carcinoma, Orthotropic Transplantation, Experimental Animal Models 原位移植法建立肝脏H22肝癌细胞 移植瘤小鼠模型 韩琛1,2，王恒孝1,2*，王朝霞3 *通讯作者。
实验三小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 13生物基地 201300140059 刘洋 2015-04-06 同组者：吕赞洪俊蔡正琦 一、实验目的 1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养。 2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用。 3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法。 4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数。 二、实验原理 1.细胞培养 细胞培养指的是在无菌条件下，把动植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域(如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等)已被广泛应用。 细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。 培养细胞的条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。 2.细胞死活鉴定 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理机能和性质上主要存以下差异： ①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作 用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触
小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察-实验报告
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 【实验题目】 小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 【实验目的】 1、掌握线粒体的超活染色原理及方法。 2、观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。 【实验材料与用品】 1. 试剂：0.02%的詹纳绿B染液、Ringer试剂 2. 器具：解剖盘、镊子、剪刀、双凹片、小烧杯、载玻片、盖玻片、胶头滴管、显微镜等 3. 材料：小鼠 【实验原理】 I.线粒体 线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包裹的细胞器，直径在0.5-10微米左右；线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷的主要场所，为细胞的活动提供了能量，有“细胞动力工厂”之称。 线粒体在代谢活动旺盛的细胞，如肌肉细胞，肝细胞，神经细胞等中大量存在；线粒体的数量差异巨大，如在肝脏细胞中有1000-2000个线粒体，而有些细胞只有一个线粒体，如酵母菌细胞的大型分支线粒体，大多数哺乳动物成熟红细胞不具有线粒体。 线粒体分布方向与微管一致，通常分布在细胞功能旺盛的区域：如在肾脏细胞中靠近微血管，呈平行或栅状排列；在肠表皮细胞中呈两极分布，集中在顶端和基端，在精子中分布在鞭毛中区。
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 II.超活染色实验原理 超活染色也称活体染色，是指对生命有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法；超活染色的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞死亡。应用活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理病理状态。 活体染色根据染色剂的性质和染色方法不同分为：体内活染（注入、固定、堆积）、体外活染（分离、浸染、固定） 1）体内活染：是以胶体状的染料溶液注入动植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的作用。 2）体外活染：又称超活染色，它是由活的动植物分离出的细胞或组织小块，以染料溶液浸染，燃料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。 活体染色之所以能固定，堆积在细胞内某些特殊部分，主要是染料的“电化学”特性起到 重要作用；碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染液的胶粒表面带阴离子，被染的部分本身也是具有阳离子或阴离子，这样它们彼此之间就发生了吸引作用，从而使样品着色。不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料。 活体染色剂的选择原则： 1、对细胞无毒性或毒性极小的染剂 2、具有电化学特性 3、配成稀淡的溶液来使用 4、具有专一性（特异性） 5、一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。 本实验采用的活体染色剂---詹纳斯绿B 詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性的对线粒体进行超活染色，这是由于线粒
细胞培养室肝细胞原代培养标准操作规程 实验试剂 培养基：William’s E Medium(GiBCO 12551-032), 谷氨酰胺(GiBco 21051-024-100g)292mg/L，双抗（GiBco 15140-122 penicillin +10,000Units/mL, streptomycin +10,000μg /mL）5mL/500mL, 胰岛素(GiBCO 12585-014 4 mg/mL)8μg/mL, 地塞米松（中国药品生物制品检定所）5mg/L。 D-Hanks’液（CaCl2 0.55g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, Na2HPO4?7H2O 0.06g/L, NaHCO3 0.35g/L, 三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2-7.4, 4℃保存） 0.05%胶原酶Ⅳ溶液(（Sigma C5138-1G） D-Hanks’液溶解, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌, -20℃ 保存）) PBS预灌流溶液（NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L, KH2PO40.2g/L, Na2HPO4?7H2O 1.56g/L, EDTA 0.1mM, 三蒸水溶解, NaHCO3调pH 7.2-7.4, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存） 鼠尾胶原（GiBCO A10483-01 20mL/ 瓶）（0.05 mg/ mL）用0.02M 的醋酸稀释,临用现配） 0.02M 的醋酸：115μL的醋酸(大于99%)用水稀释至100mL 0.05 mg/ mL-200μL鼠尾胶原（5 mg/ mL）用0.02M的醋酸稀释至20 mL Overlay(0.25 mg/ mL的Matrigel（BD 356237）(用William’s E Medium稀释，视具体批号而定稀释倍数，临用现配） Hanks’液（CaCl2 0.14g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, MgCl2?6H2O 0.10g/L, MgSO4.7H2O 0.10g/L, Na2HPO4?7H2O 0.09g/L, NaHCO3 0.35g/L, D-葡萄糖 1.0 g/L，三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2附近，4℃保存） 实验仪器 CO2 恒温培养箱（日本SANYO 公司）； Sigma高速离心机； IX-51 型荧光倒置显微镜（日本尼康公司）； DHL-A电脑恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）； 液相-质谱联用分析系统（LC/MS/MS）由美国Thermo系列四元泵、在线脱气机、自动进样器、以及Thermo Finnigan LTQ线性离子阱质谱检测器，系统工作软件为XcaLibur（美国）； Sigma5310离心机； ZHWY-103B多振幅轨道式恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。 实验方法 实验准备
原代肝细胞培养 原代肝细胞培养 1．实验材料 灌流液：NaCl、KCl、NaH2PO4.2H2O、Na2HPO4.H2O、NaHCO3、HEPES、EDTA、Glucose （国药或阿拉丁）。 消化液：Collagenase IV（Yeasen，翊圣生物，产品货号：40510ES60，100 mg ，279￥）、CaCl2。 Percoll：Percoll（GE Healthcare，17-0891-02）我买的是分装的100ml，450￥的17-0891-01-1。麻醉剂：10%水合氯醛。 实验器材：200目细胞筛、20ml 注射器、头皮针、手术剪3把、手术镊3把（实验前灭菌），细胞培养皿2个，离心机，实验前备冰盒及水浴锅，鼠板及大头针（实验前酒精及紫外消毒）。 2. 实验前准备 1) 灌流液 Perfusion Solution NaCl KCl NaH2PO4.2H2O Na2HPO4.H2O NaHCO3 HEPES EDTA Glucose 离子）。用前37℃温育。 每只老鼠消耗15ml灌流液。 2）消化液 100× CaCl2：560mg CaCl2，加入10 ml PBS/ ddH2O，分装-20℃保存。10× CollagenaseIV：100 mgCollagenaseIV粉末溶于20 mlDMEM（无血清），0.22 uM滤膜过滤除菌，每管1.5ml分装。 消化液：13.5 mlDMEM（无血清）加入150 μl100× CaCl2（终浓度5 mM），再加入1.5 ml10× CollagenaseIV（终浓度0.5 mg/ml），于37℃温育。 每只老鼠消耗15ml消化液。 3）40%Percoll g/L 8.0 0.4 0.078 0.151 0.35 2.380 0.19 0.9 调节pH 7.2-7.4，配好后过滤除菌。（不能高压灭菌，其中含葡萄糖及HCO3- 16.2 ml 100%percoll原液，加入1.8 ml10×PBS，再加入27ml 1×PBS，得45 ml。（等渗溶液） 每只老鼠消耗5-6 ml40%Percoll。
肝癌小鼠造模实验方法 (1)肿瘤细胞悬液的制备小鼠肿瘤细胞用小鼠腹腔培养，然后抽取腹水，是 取得大量肿瘤细胞最便捷的方法。具体操作如下：将肿瘤细胞株复苏后，接种于babl/c （昆明小鼠）腹腔，培养8-10天后，接种小鼠的腹腔内长出含肿瘤细胞的腹水，选择腹水饱满的小鼠，在超净台内于无菌条件下消毒小鼠腹部，用注射器抽取淡腹水为瘤源，放入无菌容器内，加入无菌生理盐水稀释瘤液，小心摇匀，并置冰水上保存。若用多只动物做瘤源时，则应混合腹水。(腹水应为淡黄色浓稠液体，若为深黄色或红色则应弃去不用。) (2)肿瘤细胞计数取少量腹水，放置于干试管内，用生理盐水稀释100倍，用 枪头吸取少许腹水，滴于载玻片上，推片，镜下观察细胞形态：细胞为圆形，胞浆均匀，透明，折光性好，分布均匀。并于镜下进行细胞分类计数，其中肿瘤细胞数应≥95％。 (3)肿瘤细胞接种腹水用无菌生理盐水调整细胞浓度为1*107mL ，在小鼠右侧腋下(右侧腋窝 皮下？)常规接种H22瘤液0．2mL ／只(含2*106个瘤细胞)（5*106）？。全程严格无菌操作， 40min 内完成。 (4)分组与给药昆明小鼠用上法造模，造模后再将腹水瘤小鼠按体重分层，随 机分为阳性对照组(CTX)、青蒿素各剂量组(150mg ／kg 、300mg ／kg)、青蒿琥酯P0组(60mg ／kg)、青蒿琥酯ip 组(60mg ／kg)、青蒿醇提物和青蒿水提物各剂量组 (1000mg ／kg 、4000mg ／kg)和模型对照组(Model)，每组各lO 只小鼠。造模24h 后，阳性对照组(CTX)20mg ／kg 和青蒿琥酯ip 组(60mg ／kg)，腹腔注射0．2mL ／只，每天1次，连续lOd ：其它组灌胃给药，灌服溶液0．4mL ／只，每天1次，连续lOd 。模型对照组仅予等量CMC-Na 溶液，连续lOd 。平均每只小鼠每天给等量鼠料，每周换垫料2次，每日换新鲜水1次。记录各小鼠死亡的时间。 其他问题： 检测药物对肿瘤的抑制作用，给药时间怎么确定？ 1、 造模后第二天给药 2、 肿瘤长出一定体积后在给药
山东大学实验报告2011年3月30日 姓名张行润系年级 2009级生科4班学号同组者张少华 科目细胞生物学实验题目小鼠脾细胞培养实验仪器编号105 一、实验目的 了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。学习细胞计数、营养液的配制等，初步掌握无菌操作方法。 二、实验原理 (一)细胞原代培养 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 (二)细胞死活鉴定 死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。 染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括： 死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。 死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。 除此之外，还有一些细胞器的专有染料。如液泡系的专有染料中性红。中性红是一种低毒性染料，可以使活细胞液泡着红色，而细胞质和细胞核不被着色；死细胞的液泡不被着色或浅染，染料弥散于整个细胞中，细胞核和细胞质被染成红色。有时侯为了增加染色效果可以将两种染料结合使用，如甲基蓝-中性红混合染色法。 三、实验器材
原代肝细胞分离培养与方法 肝细胞的分离和培养是体外组合性生物人工肝研究的基础，但单纯机械分离法对肝细胞损伤较大，分离后的肝细胞体外培养的难度亦较大，方法复杂，成本较高 体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞. 1 非酶分离细胞法 1．1 直接分离法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，剪成小块，通过机械方法(挤压、剪碎、震荡、吹打)得到单个细胞，多与 EDTA螯合法、灌注法相结合，即先用 EDTA溶液进行充分的灌流，再剪成组织小块，然后用各种机械的方法分离得到肝细胞。该方法操作简单、流程短，不需要复杂仪器和昂贵的胶原酶。但实验操作对细胞的损伤大，尤其是造成细胞表面蛋白不可逆的机械性损伤，导致细胞的获得率和存活率较低。 1．2 组织块培养法：用麻醉剂 (乙醚、戊巴比妥纳等 )将动物麻醉或直接断头处死，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。的组织小块，充分洗涤后，以 0．5 cm的间隔接种于培养器皿中(25 m L的培养瓶中可接种 3O块 )，先加入少量的培养基，静置培养 12～ 24 h后再加入足量的培养基。该操作过程短，污染少，损伤小，细胞成活率很高而成本低。但纯度不高，且形成典型上皮细胞层所需时间较长，在细胞爬出后还需剔除组织块，易造成二次污染。可能是因为成年动物的结缔组织比新生动物的结缔组织致密，肝细胞难以迁出，故此法多用于 1～ 6 d的新生动物或动物胚胎。 2．离体肝脏酶消化分离法 2．1 胰蛋白酶、胶原酶消化法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。的组织小块，充分洗涤后，在 37℃下用胰酶或 (和)胶原酶消化，待消化物成蓬松的絮状物后加入培养基终止消化，吹打均匀后经 200目不锈钢网筛过滤后，离心、重悬即可获得肝细胞。胶原酶只消化细胞间质而对肝细胞机械性损伤较小，也能较完整地保存膜蛋白¨7]，分离效果好。肝细胞产率高、损伤小，且保持特异性功能的时间长。但胶原酶价格比较昂贵，成本高。胰蛋白酶既消化细胞问质又消化细胞本身，操作简单，价格便宜，但胰酶消化的条件极难把握而使该法未被广泛应用 L8．9_。 2．2 胰蛋白酶、胶原酶消化的组织块法：处死小鼠，无菌分离肝脏，置 D-Hanks液中，冲洗肝脏至灰白色，将肝脏剪成 1 mm。的组织块，在 37℃下用胰酶或(和)胶原酶消化后，加人培养基终止消化，自然沉降后，取下层组织块，再用培养基洗涤数次即可将肝组织块贴壁于培养瓶中，每个培养瓶放组织块 30~35块，加少许培养基。该法分离效果、纯度较单纯的组织块法好，且细胞从组织块爬出时间相对短。但消化酶的用量和时间不易控制：消化过度，形成的絮状组织块不能分离；消化不充分，酶没有发挥其作用[10~12]。 2．3 在体肝脏酶灌注法 2．3．1 Seglen灌注法：即经典的二步胶原酶灌注法。两步灌注即经门静脉以无钙缓冲液和胶原酶恒流、恒温灌注，这是目前国际上公认的方法。首先用不含 Ca 的离子螯合剂(EDTA等)移走肝组织中的 Ca ，从而打破固定细胞的细胞桥粒样结构；再用胶原酶进行蛋白分解
shRNA抑制CLIC1基因表达对小鼠肝癌细胞株Hca-F生物学行为的影响
大连医科大学 博士学位论文 shRNA抑制CLIC1基因表达对小鼠肝癌细胞株Hca-F生物学行为 的景程 姓名：李荣宽 申请学位级别：博士 专业：病理与病理生理学 指导教师：唐建武 201006
shRNA抑制CLIC 1基因表达对小鼠肝癌 细胞株Hca．F生物学行为的影响 博士研究生：李荣宽指导教师： 唐建武教授专业 名称：病理学与病理生理学 摘要 背景：转移潜能是恶性肿瘤最重要的生物学特征之一，也是肿瘤患者死亡率高、预后差的主要原因。对于上皮来源的恶性肿瘤，淋巴道转 移是其早期转移的主要方式，但确切机制目前仍不清楚。原发性肝癌 (primary carcinoma of the liver)是最常见恶性肿瘤之一，包括肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma，HCC)、肝内胆管上皮癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，IHCC)、肝细胞及胆管上皮细胞混合癌三种细胞类 型，其中90％以上为肝细胞癌。全世界每年新发约62．6万例HCC患者， 其中的半数以上病例发生在我国。同时，它也是恶性程度最高、致死率 最高的肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤死因第三位、我国恶性肿瘤死因第 二位。即便是经过根治性切除手术治疗，5年的复发转移率仍高达60％， 因此，揭示肝癌转移的分子机制及其关键调控环节，进而采取相应的干 预措施，将有助于减少、甚至避免病人术后发生复发转移，从而达到降 低死亡率的目的。 Hca．F和Hca．P是将小鼠肝癌细胞株H22在61 5小鼠体内反复接种和筛选后得到的一对来源于同一亲本细胞、但是淋巴道转移潜能显著 不同的小鼠肝癌腹水型细胞株。其中Hca．F具有高淋巴道转移潜能，接 种到6l 5小鼠体内后其淋巴结转移率超过70％，Hca．P是低转移潜能 的细胞株，其淋巴结转移率低于30％。通过对比研究二者的差异，可以 为我们揭示小鼠肝癌的淋巴道转移机制提供有益的参考。本课题组在前 期工作中已经应用不同的方法，对Hca．F和Hca．P这一对具有高低不通 淋巴道转移潜能的细胞株进行了一系列系统的研究。首先，利用抑制性 消减杂交技术(suppression substractive hybridization，SSH)及基因 芯片 (Genechip)高通量筛选(high throughput screen，HTS)技术得出了Hca．F 细胞和Hca．P细胞之间一系列差异表达基因，继而采用定量蛋白质组学技术建立了高低淋巴道 转移潜能小鼠肝癌细胞的荧光差异蛋白表达图
广州大学 综合设计性实验报告 学院生命科学学院 课程细胞生物学实验 实验项目细胞培养 实验题目小鼠肝细胞的原代培养 专业生物技术 年级、班别生技142 姓名徐嘉宽 学号 1414300030 任课教师陈鲲
细胞培养 ——小鼠细胞的原代培养 摘要目的探讨体外分离和培养小鼠肾、脑、心肌细胞的方法。方法采用脱臼法处死新生小鼠，结合酶消化法和组织块法对新生小鼠肾、脑、心肌细胞进行了体外分离、培养。（用眼科剪把新生小鼠心肌细胞组织剪成小于1mm3大小的植块，然后用胰蛋白酶消化5~10min，最后将心肌组织块接种于培养瓶中进行体外培养。脑和肾直接进行组织块培养。）结果比较成功地进行了原代肾、脑、心肌细胞培养，并进行了形态学观察。结论采用该方法能够实现对小鼠心肌、肾、脑细胞的体外原代培养，较好观察到心肌、脑、肾细胞的形态。 关键词原代培养小鼠细胞组织块法酶消化法 1前言 初步了解动物细胞原代培养的基本方法、原理和基本操作过程，初步掌握无菌操作方法。学习植块培养法、营养液的配置及酸碱度的调节。细胞培养是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。当前，细胞培养技术广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，已发展成为一种重要的生物技术。了解动物细胞培养的技术的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，并对原代培养有一个基本概念。结合酶消化法和组织块法通过无菌操作培养新生小鼠细胞。 2实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），用植块培养法或酶解法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要是细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 3实验用品 3.1器材 解剖剪、镊1套；眼科剪7把、眼科镊6把；吸管直、弯头各7支，2 ml刻度吸管5支；吸管胶头：小18个、大6个；细胞培养瓶5个；青霉素瓶及瓶塞：6个（其中一个用于分装胰酶液）；培养皿(用于解剖取材)：大、小各1套。烧杯：5～10ml 2个、100 ml 1个。用于无菌操作：解剖镊1把，广口瓶大、小各1个（装消毒棉球），医用棉花、纱布，有盖白瓷盘1个、消毒盒3个、牛皮纸、棉绳。小培养皿(装盖玻片)1个。
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 陈素君 200900140007 实验目的：了解原代培养的基本方法及操作过程。学习细胞消化、细胞计数、营养液的配制 及酸碱度的调节。初步掌握无菌操作方法。学会分辨死活细胞，掌握细胞计数。 实验原理：细胞培养是用无菌的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体内进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。 细胞培养的突出优点，一是便于研究各种理化因素对细胞生长发育和分化等的影响，二是细胞培养便于人们对细胞内部结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育过程的观察。因而是探索和显示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，但是不可忽略它脱离了生物机体的一些变化。细胞培养分为原代培养和传代培养。原代培养是指直接从动物体内获得的细胞组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成单个游离的细胞，在人工培养的条件下，使其不断地生长及繁殖。 要细胞能在体外长期生长，必须满足基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 台盘蓝氧化与还原型颜色不同，活细胞由于新陈代谢产生较强还原力，染色后呈无色，死细胞染色后呈蓝色。细胞计数以显微镜计数法进行，即将少量待测样品悬浊液置于特定的具有确定容积的载玻片上（计菌器），于显微镜下直接观察计数。 细胞浓度（个/ml）=4个中等方格内的细胞总数÷4×10000×稀释倍数。 实验用品： 一、器材 解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、注射器、针头、Eppendorf管。上述器具彻底清洗、消毒、烤干、包装好 倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板 二、试剂 PBS缓冲溶液、培养液、台盘蓝 三、小白鼠 实验方法： 1. 细胞的原代培养 1.1断头法处死小鼠，将血放掉洗净，在酒精中浸泡3min消毒。 1.2在超净工作台无菌操作，将小鼠背朝下放在解剖板上，用镊子提起腹部皮肤，剪开。沿 开口向两侧斜着剪开，翻起皮肤露出腹腔，即可看到白色的胃。提起胃，找到后面条状的脾，用弯头镊子取出脾，将周围的脂肪组织去除。PBS缓冲液清洗1-2次待用。 1.3在无菌培养皿内加入PBS缓冲液30滴，用L型针头吸取PBS0.2mL注入小鼠脾脏，用针 头在脾脏上戳几个小孔，顺脾脏轻轻刮，从小孔挤出分散的细胞。 1.4将培养皿倾斜，使大块组织充分沉淀，吸取分散的细胞悬液2mL，1000r/min离心5min。
一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法 1材料与方法 1.1动物 2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。 1.2试剂 D-hank's液； 消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyroli done, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)； 消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP； 基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）； 小牛血清（BS，GIBCO公司提供）； 培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。 1.3鼠肝组织块培养 1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分； 3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清， 4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。 1.4鼠肝细胞单层培养 动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。 或者： 1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分； 3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清， 4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育20 min，每隔5min振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离； 5）加入3-5mL含血清培养液以终止胰酶消化作用； 6）用100目筛网过滤，除去未消化的大组织块； 7）再次离心5min，弃上清； 8）加入无血清培养液5mL，冲散细胞，再离心一次，弃上清； 9）加入含血清培养液1-2mL（视细胞数量），血球计数板计数； 10）将细胞调整到5*105/mL左右，转移至6孔培养板中，37℃、5% CO2条件下培养。
小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验 [摘要] 目的:1.通过可移植性小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验，从感性上认识肿瘤侵袭与淋巴道转移的生物学特性，了解肿瘤动物实验模型建立的过程及意义。2.进一步了解动物尸体解剖、组织取材、染色的过程。3.强化科研思维的培养及实验技能的训练。 方法:将高转移力小鼠腹水型肝癌细胞(HCa - F)经 615 小鼠右腋中线皮下接种，定期观察右腋皮下肿瘤的生长和同侧腋窝淋巴结及腹股沟淋巴结肿大情况，并于接种后 21 天处死全部小鼠，取皮下瘤体及双侧腋窝淋巴结，腹股沟淋巴结称重并测量大小，同时观察肿瘤的形态特点，生长方式，肺、肝、肾等脏器，并将瘤体、淋巴结及脏器做切片处理以作染色和镜下观察。 结果:21 天观察，实验使用 10 只小鼠，最终存活 8只，其中形成肿块 7 只（3只形成的肿块较大），成瘤率 70%，淋巴结转移率 70%。肉眼观察，较大肿瘤 2*1.5*1.3cm，灰白色，质地较硬，从中间切开，发现肿块大部分坏死，中心部分出现腔，腔内有肿瘤坏死物质。镜下观察，坏死组织粉染，轮廓尚存。残存肿瘤组织细胞存在异型性：瘤细胞大小和形态不一致，细胞核体积增大并呈现多形性，核浆比增大。核的大小、形状和染色不一。核分裂象增多，核浆比失调，胞浆减少。结论:高转移力小鼠腹水型肝癌细胞通过淋巴道转移，无器官转移，且具有高转移力。 [关键词]HCa-F（高转移力小鼠腹水型肝癌细胞); 615小鼠; 高淋巴道转移[前言]研究背景:原发性肝癌的发生率地区差异大，在亚非国家较常
见，我国的发病率较高，属于常见的肿瘤之一。近年来，我国对肝癌的防治研究取得了明显的成绩，一些直径在1cm一下的小肝癌已被发现并及时治疗取得满意的疗效[1]。随着临床治疗经验的积累，逐渐意识到即使是小肝癌根治性切除，转移复发仍然是一个十分严峻的问题，术后 5 年复发率可高达 50% 。 存在的问题:本次试验采用的方法是将瘤细胞移植于615小鼠右腋中线皮下，观察肿瘤生长及转移状态[2]。所以移植瘤没有展现自发性肿瘤从正常组织转变成肿瘤、随后出现转移的全过程,没有了解疾病完整的自然史。 实验的意义:为了探究肝癌的实质性问题，即肿瘤本身的生物学特性，尤其是其转移的生物学特性，本次试验对肝癌转移的生物学行为进行实验性研究。即将肿瘤细胞直接接种到小鼠的皮下组织然后观察肿瘤细胞在小鼠体内的生长及转移情况。它基本上模拟了从肿瘤生长到转移瘤形成的一系列步骤，又涉及宿主的反应性，因此结果可靠，近似于临床病人的实际情况，对提高恶性肿瘤患者的生存率和预后有重要的意义[3]。 [正文] 一、材料 1、细胞系：高转移力小鼠腹水型肝癌细胞，由大连医科大学病理教研室建株并保存。 2、实验动物：近交系615小鼠，雌雄兼用，6-8周龄，体重18-22g，由大连医科大学实验动物中心提供。
细胞生物学实验报告 题目：小鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 姓名：刘恋学号：201000140049 系年级：10级生科2班 一、【实验目的】 1．掌握线粒体的超活染色原理及方法。 2．观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。 二、【实验原理】 1．线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿B（Janus green B）是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。 不同细胞中线粒体的形态和数目不同。在电子显微镜下，线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。 线粒体的细胞色素氧化酶能使詹纳新绿染料始终保持在氧化状态而呈蓝色，周围细胞内的染料却被还原成无色的色基，在进行细胞的体外染色时，至少要使材料在詹纳斯绿染料中染色15min后再盖上盖玻片，以使材料充分氧化。 2．活体染色是指用燃料标记生活有机体的细胞或组织但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示活细胞内的某些结构，同时即不影响细胞的生命活动也不会产生任何物理、化学变化导致细胞的死亡。活染技术可用来研宄生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。 活体染色之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起作用。碱性燃料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子；而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们被此就发生了吸引作用。但不是任何染料都可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料配成稀的溶液来使用。一般以碱性染料最为常用，因为碱性染料具有溶解在类脂质的特性，易于被细胞吸收，如中性红、詹钠斯绿、次甲基蓝、甲苯胺蓝、亮焦油紫等。其中詹钠斯绿和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最常用的染料，分别对线粒体和液泡系有特异性的染色。詹纳斯绿B这种碱性染料是活体染色中重要的材料，对线粒体的染色有专一性，可专一性地对线粒体进行活染，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原成无色的色基。
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 实验背景： 一、细胞培养的基本条件： 1.无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素 2.细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清 3.细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器 4.细胞保存条件：液氮罐 1.超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 2.Zeiss滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。
3.CO2培养箱： CO2培养箱设定的条件为37 ℃，5％CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： ①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90 ℃，14 h)。 ③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液 蒸发。 三、细胞培养用液的配制： 1.水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 2.平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml 3.消化液： ①胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 ②胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 ③胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是 0.25％。用滤器过滤除菌。 ④胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 ⑤用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 4.培养基： 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 ①天然培养基： 天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限，成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污