1、淋巴细胞的来源： 人淋巴细胞的方便来源是外周血 分离的原则是收率较高、纯度较好、失活较低。 根据不同试验有相对纯度，无论采用哪种方法，应尽最大可能保持细胞应有活性。 分离的技术可由细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。 2、密度梯度离心法： 外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。 3、实验方法： 1.采血，稀释（外周血：稀释液=1：2） 2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释血=1：2） 3、20℃，1500r/min，离心30min 从上一次至下 稀释的血浆、血小板 PBMC Ficoll 红细胞、粒细胞 4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中。 5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min离心10min ，弃上清。 6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min，弃上清。 7.适量的培养基重悬细胞，计数。
分离单个核细胞纯度为95% 淋巴细胞约占90%～95% 4、淋巴细胞高纯度化 (一)红细胞的去除 一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。 (二)血小板的去除 将PBMC悬液通过离心洗涤2～3次，常可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。 在某些疾病状态下，若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法去除PBMC中混杂的血小板。 （三）单核细胞和粒细胞的去除 1．粘附去除法 原理：单核细胞和粒细胞在37℃和Ca离子存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。 优点：简便易行，对细胞损伤极少。 缺点：B细胞也有较弱的粘附能力，因此有部分B细胞丢失。 该法去除单核细胞后，大约95%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。 2．羰基铁粉吞噬法 原理：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大。 方法一：经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心后，则单核细胞沉积于管底而被去除。 方法二：用磁铁将细胞吸至管底，上层液中即含较纯的淋巴细胞。 3．苯丙氨酸甲酯去除法 原理：苯丙氨酸甲酯(PME)具有亲溶酶体性质，能渗入细胞溶酶体内被水解为游离氨基酸，导致溶酶体内因渗透压改变而破裂，释放出的酶类物质可引起细胞溶解。 用该法可溶解含溶酶体的细胞，如单核细胞、粒细胞和成纤维母细胞等，B细胞和大多数T细胞因缺乏溶酶体酶，因而不受影响。 该法去除单核细胞后，约99%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。
小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察-实验报告
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 【实验题目】 小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 【实验目的】 1、掌握线粒体的超活染色原理及方法。 2、观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。 【实验材料与用品】 1. 试剂：0.02%的詹纳绿B染液、Ringer试剂 2. 器具：解剖盘、镊子、剪刀、双凹片、小烧杯、载玻片、盖玻片、胶头滴管、显微镜等 3. 材料：小鼠 【实验原理】 I.线粒体 线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包裹的细胞器，直径在0.5-10微米左右；线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷的主要场所，为细胞的活动提供了能量，有“细胞动力工厂”之称。 线粒体在代谢活动旺盛的细胞，如肌肉细胞，肝细胞，神经细胞等中大量存在；线粒体的数量差异巨大，如在肝脏细胞中有1000-2000个线粒体，而有些细胞只有一个线粒体，如酵母菌细胞的大型分支线粒体，大多数哺乳动物成熟红细胞不具有线粒体。 线粒体分布方向与微管一致，通常分布在细胞功能旺盛的区域：如在肾脏细胞中靠近微血管，呈平行或栅状排列；在肠表皮细胞中呈两极分布，集中在顶端和基端，在精子中分布在鞭毛中区。
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 II.超活染色实验原理 超活染色也称活体染色，是指对生命有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法；超活染色的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞死亡。应用活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理病理状态。 活体染色根据染色剂的性质和染色方法不同分为：体内活染（注入、固定、堆积）、体外活染（分离、浸染、固定） 1）体内活染：是以胶体状的染料溶液注入动植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的作用。 2）体外活染：又称超活染色，它是由活的动植物分离出的细胞或组织小块，以染料溶液浸染，燃料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。 活体染色之所以能固定，堆积在细胞内某些特殊部分，主要是染料的“电化学”特性起到 重要作用；碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染液的胶粒表面带阴离子，被染的部分本身也是具有阳离子或阴离子，这样它们彼此之间就发生了吸引作用，从而使样品着色。不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料。 活体染色剂的选择原则： 1、对细胞无毒性或毒性极小的染剂 2、具有电化学特性 3、配成稀淡的溶液来使用 4、具有专一性（特异性） 5、一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。 本实验采用的活体染色剂---詹纳斯绿B 詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性的对线粒体进行超活染色，这是由于线粒
肝切片的实验报告 篇一：肝切片实验报告？ 实验九显微摄影――小鼠肝脏结构年级专业 *班 *组学号姓名αβ 500μm 1 m 2 100μm i 100μm 4 50μm 图版说明： 图1：小鼠肝脏横切部分结构，示肝小叶（a），静脉血管（b）。图2：图1（α部位）的放大，示肝小叶（c）。图3：示肝小叶（d）。图4：示静脉血管（e）。 图5：示肝细胞（f），肝细胞细胞核（g）。图6：图2（β部位)的放大，示上皮细胞（h），上皮细胞细胞核（i），肝血窦（j），中 央静脉（k），肝动脉（l），血细胞（m）。结构说明：肝脏是脊椎动物身体内以代谢功能为主的一个器官，并在身体里面扮演着氧化，储存肝 糖，解读等功能。肝脏由肝小叶组 成，肝小叶是肝脏的基本组成成分，它来执行肝脏的基本职能。而肝小叶又是由肝细胞组成，当肝细胞大量损坏时，肝小叶不能正常工作，影响肝脏 正常生理功能，而出现各种各样的症状。肝小叶成棱柱状，中央有一条中央静脉穿过，肝细 胞围绕中央静脉成放射状排列。肝细胞是一种高度分化并具有多种功能的细胞，胞质内各种细胞器丰富而发达，并
含有 糖原，脂滴等内涵物。细胞器和内涵物的含量与分布常因细胞的功能状况或饮食变化而变动。 一般肝细胞里线粒体含量都比较多，遍布于胞质内，为肝细胞的功能活动不断提供能量。肝细胞核大而圆，居中央，染色质丰富色浅，核膜清楚，核仁1至数个。部分肝细胞（约 25%）有双核，有的肝细胞的核体积较大，为多倍体核。肝血窦位于肝板之间，互相吻合成网状管道。血窦腔大而不规则，血液从肝小叶的周边 经肝血窦流向中央，汇聚到中央静脉。 5 50μm篇二：实验报告(一) 实验名称：实验性空气栓塞实验时间：成绩：实验目的：了解空气栓塞对机体的影响实验材料：家兔，20ml注射器及针头，解剖刀，剪，镊子，面盒，浸有二甲苯的棉球若 干 等实验方法（简要说明）： 1. 先观察家兔的一般状况：活动状态、呼吸频率、嘴唇颜色及瞳孔大小等。 2. 用浸有二甲苯的棉球涂擦一侧耳廓，使局部血管扩张，便于穿刺注射。 3. 用注射器经耳缘静脉注入空气10～15ml，记录时间，
World Journal of Cancer Research 世界肿瘤研究, 2015, 5, 15-20 Published Online January 2015 in Hans. https://www.doczj.com/doc/5e6804454.html,/journal/wjcr https://www.doczj.com/doc/5e6804454.html,/10.12677/wjcr.2015.51003 Orthotropic Transplantation to Establish H22 Hepatocellular Carcinoma Model in Mice Chen Han1,2, Hengxiao Wang1,2*, Zhaoxia Wang3 1Department of Immunity, Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan 2School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan 3Department of Pathology, Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan Email: *wanghengxiao@https://www.doczj.com/doc/5e6804454.html, Received: Nov. 24th, 2014; revised: Dec. 22nd, 2014; accepted: Dec. 30th, 2014 Copyright ? 2015 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.doczj.com/doc/5e6804454.html,/licenses/by/4.0/ Abstract Objective: To establish a liver orthotropic transplantation tumor model with H22 cells, for the further development of the related experimental study. Methods: A certain number of H22 cells were directly injected in the left lobe of the liver in C57BL/6 mice, establishing a transplanted tu-mor model of hepatocellular carcinoma in situ. Results: After 7 days of surgery, the liver surface appeared irregular size nodules, nodules increased with the prolongation of time increases, the late abdominal organs appeared invasion, adhesion, ascites was increased. Histopathological ex-amination of liver tumor tissues and adjacent tissues of cancer showed that liver orthotropic transplantation tumor formation rate was 100%, no spontaneous regression. Conclusions: Ortho-tropic injection of H22 cell established orthotropic transplantation tumor formation in the liver, and the tumor formation time was relatively short, tumor formation processes associated with organ metastasis and ascites. This model was reasonable to simulate the pathological and physio-logical body of liver cancer in human, and could satisfy the requirement of research on liver can-cer. Keywords Hepatocellular Carcinoma, Orthotropic Transplantation, Experimental Animal Models 原位移植法建立肝脏H22肝癌细胞 移植瘤小鼠模型 韩琛1,2，王恒孝1,2*，王朝霞3 *通讯作者。
小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液说明书 【产品规格】200ml/Kit 【产品组成】 为方便广大用户使用，试剂内容如下： 名称 产品编号 规格200ml 200ml 200ml 200ml 1份 A B C D E 小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液样本稀释液（赠品）清洗液（赠品）2010C11192010X1118F2013TBD F 液（赠品）说明书 【实验前准备】A ．适用仪器 最大离心力可达1200g 的水平转子离心机B ．耗材 产品名称产品货号339650339651339652339653 产地15ml 离心管散装美国NUNC 15ml 离心管架装美国NUNC 美国NUNC 美国NUNC 50ml 离心管散装50ml 离心管架装无菌胶头滴管或塑料滴管【检验方法】 全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。1.首先制备组织单细胞悬液，制备方法详见“组织单细胞悬液制备技术”。 2.取一支15ml 离心管，加入与组织单细胞悬液等量的分离液（注：分离液最少不得少于 3ml ）。 3.用吸管小心吸取组织单细胞悬液加于分离液液面上，400-500g ，离心20-30min 。（注： 根据组织单细胞悬液量确定离心条件，组织单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。
4.离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色淋 巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。 5.用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中，向离心管中加入 10ml清洗液（产品编号：2010X1118），混匀细胞。 6.250g，离心10min。 7.弃上清。 8.用吸管以5ml清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。 9.250g，离心10min。 10.重复7、8、9，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。 【注意事项】 1.全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。为获得最佳的实验结果，最 好在取样2h内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效果越差。样品放置超过6h后分离效果更差甚至不能达到分离目的。 2.本实验最好不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离 心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。 3.吸取过多的淋巴细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒 细胞数量增加。 4.分离液用量大于组织单细胞悬液样本时，分离效果更佳。 5.如实验后细胞得率或活性过低，请联系上海研谨生物以获得技术支持。 【储存条件及有效期】 18-25℃保存，有效期2年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启封后置常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。 【参考值（参考范围）】 本实验淋巴细胞提取率及纯度大于80%。 下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例，用户可适当进行参考。 红细胞白细胞血小板 （4.0-10.0）×109 含量（个/L）（4.0-5.5）×1012（1.0-3.0）×1011 中性粒细胞淋巴细胞单核细胞
细胞培养室肝细胞原代培养标准操作规程 实验试剂 培养基：William’s E Medium(GiBCO 12551-032), 谷氨酰胺(GiBco 21051-024-100g)292mg/L，双抗（GiBco 15140-122 penicillin +10,000Units/mL, streptomycin +10,000μg /mL）5mL/500mL, 胰岛素(GiBCO 12585-014 4 mg/mL)8μg/mL, 地塞米松（中国药品生物制品检定所）5mg/L。 D-Hanks’液（CaCl2 0.55g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, Na2HPO4?7H2O 0.06g/L, NaHCO3 0.35g/L, 三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2-7.4, 4℃保存） 0.05%胶原酶Ⅳ溶液(（Sigma C5138-1G） D-Hanks’液溶解, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌, -20℃ 保存）) PBS预灌流溶液（NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L, KH2PO40.2g/L, Na2HPO4?7H2O 1.56g/L, EDTA 0.1mM, 三蒸水溶解, NaHCO3调pH 7.2-7.4, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存） 鼠尾胶原（GiBCO A10483-01 20mL/ 瓶）（0.05 mg/ mL）用0.02M 的醋酸稀释,临用现配） 0.02M 的醋酸：115μL的醋酸(大于99%)用水稀释至100mL 0.05 mg/ mL-200μL鼠尾胶原（5 mg/ mL）用0.02M的醋酸稀释至20 mL Overlay(0.25 mg/ mL的Matrigel（BD 356237）(用William’s E Medium稀释，视具体批号而定稀释倍数，临用现配） Hanks’液（CaCl2 0.14g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, MgCl2?6H2O 0.10g/L, MgSO4.7H2O 0.10g/L, Na2HPO4?7H2O 0.09g/L, NaHCO3 0.35g/L, D-葡萄糖 1.0 g/L，三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2附近，4℃保存） 实验仪器 CO2 恒温培养箱（日本SANYO 公司）； Sigma高速离心机； IX-51 型荧光倒置显微镜（日本尼康公司）； DHL-A电脑恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）； 液相-质谱联用分析系统（LC/MS/MS）由美国Thermo系列四元泵、在线脱气机、自动进样器、以及Thermo Finnigan LTQ线性离子阱质谱检测器，系统工作软件为XcaLibur（美国）； Sigma5310离心机； ZHWY-103B多振幅轨道式恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。 实验方法 实验准备
小鼠肝脏过氧化物酶制备与测定
摘要目的分离纯化过氧化氢酶，测定其相关性质。方法采用匀浆、盐析、透析、层析等方法分离纯化过氧化氢酶，采用Lorry 法测定蛋白含量，SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子质量，双倒数法测定酶的米氏常数。结论相对分子质量为60.25kD，以过氧化氢为底物时酶的Km值为0.133mol/L，酶层析后的比活为0.686IU/mg。 关键词小鼠过氧化氢酶纯化米氏常数SDS-PAGE 前言过氧化氢酶(Hydrogen Peroxidase)又名触酶(Catalase，CAT),是一种广泛存在于生物组织的氧化还原酶[1]。过氧化氢酶是一种四聚体血晶素酶, 由四个相同四面体排列的亚基组成,每一个亚基相对分子质量约60000，每一个分子都包含有四个高铁血红素基团,分子量在240000左右[2]。 在人体内以肝和肾脏所含过氧化氢酶活性最高, 结缔组织活性最弱,其它组织如红细胞、脾、小肠、肌肉等均含有过氧化氢酶。过氧化氢酶在细胞内主要与线粒体及过氧化物酶体结合, 在红细胞内呈溶解状态。过氧化氢酶是一种与D－氨基酸氧化酶等一系列需氧脱氢酶相偶联的酶, 具有重要的生理功能。过氧化氢酶能将细胞代谢所产生的毒性物质迅速加以清除, 从而起到和谷胱肽过氧化酶共同保护琉基酶、膜蛋白和解毒的作用。近年来, 过氧化氢酶的活性测定被作为与肿瘤和抗衰老有关的酶学指标而受到关注。[3] 近年来，过氧化氢酶活性的测定被作为与肿瘤和抗衰老有关，蛋白质的分离纯化方法是生命科学领域关注的热点之一。[4] 1实验器材 1.1实验动物 昆明小鼠6只，雌雄不限，由河北医科大学动物实验中心提供。 1.2主要仪器 5200型紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司），UV-5200 冷冻离心机(湖南相依实验仪器开发有限公司)，BCD-185冰箱（青岛海尔公司），微量移液器，40W匀浆器（江苏国华仪器厂），电泳仪（北京六一） 2实验方法
广州大学 综合设计性实验报告 学院生命科学学院 课程细胞生物学实验 实验项目细胞培养 实验题目小鼠肝细胞的原代培养 专业生物技术 年级、班别生技142 姓名徐嘉宽 学号 1414300030 任课教师陈鲲
细胞培养 ——小鼠细胞的原代培养 摘要目的探讨体外分离和培养小鼠肾、脑、心肌细胞的方法。方法采用脱臼法处死新生小鼠，结合酶消化法和组织块法对新生小鼠肾、脑、心肌细胞进行了体外分离、培养。（用眼科剪把新生小鼠心肌细胞组织剪成小于1mm3大小的植块，然后用胰蛋白酶消化5~10min，最后将心肌组织块接种于培养瓶中进行体外培养。脑和肾直接进行组织块培养。）结果比较成功地进行了原代肾、脑、心肌细胞培养，并进行了形态学观察。结论采用该方法能够实现对小鼠心肌、肾、脑细胞的体外原代培养，较好观察到心肌、脑、肾细胞的形态。 关键词原代培养小鼠细胞组织块法酶消化法 1前言 初步了解动物细胞原代培养的基本方法、原理和基本操作过程，初步掌握无菌操作方法。学习植块培养法、营养液的配置及酸碱度的调节。细胞培养是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。当前，细胞培养技术广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，已发展成为一种重要的生物技术。了解动物细胞培养的技术的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，并对原代培养有一个基本概念。结合酶消化法和组织块法通过无菌操作培养新生小鼠细胞。 2实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），用植块培养法或酶解法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要是细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 3实验用品 3.1器材 解剖剪、镊1套；眼科剪7把、眼科镊6把；吸管直、弯头各7支，2 ml刻度吸管5支；吸管胶头：小18个、大6个；细胞培养瓶5个；青霉素瓶及瓶塞：6个（其中一个用于分装胰酶液）；培养皿(用于解剖取材)：大、小各1套。烧杯：5～10ml 2个、100 ml 1个。用于无菌操作：解剖镊1把，广口瓶大、小各1个（装消毒棉球），医用棉花、纱布，有盖白瓷盘1个、消毒盒3个、牛皮纸、棉绳。小培养皿(装盖玻片)1个。
大鼠肝脏组织病理切片的制作和HE 染色 步骤如下： （一）固定与修块 取组织块放入Bouin氏液中，组织块的直径应小于7mm。6小时左右后用双面 刀片将组织块修剪成3-5mm3大小。 （二）脱水与透明 1．75%乙醇50分钟 2．85%乙醇50分钟 3．95%乙醇（I）30分钟 4．95%乙醇（II）30分钟 5．100%乙醇（I）30分钟 6．100%乙醇（II）30分钟 7 1/2 二甲苯（乙醇与二甲苯等体积）20分钟 8．二甲苯（I）20分钟 9．二甲苯（II）10分钟（可依据透明效果而定） 若脱水不好，二甲苯溶液颜色会变混浊。在每一步骤之后，要充分滤干组织 块，一般用筒纸吸干组织块上的液体，以免影响其他液体的浓度，但也要防止组织块干燥。全过程约需要5h。 （三）浸蜡、包埋与修蜡块 1．浸蜡：将60℃恒温箱打开，使石蜡充分溶解，待脱水与透明结束后，将 组织块转入石蜡里，放置于60℃恒温箱120分钟。 2．包埋：将60℃的石蜡倒入纸盒内，然后用小镊子将各组织块按一定的顺 序排列好，使切面朝下。不同组别的同一组织包埋于一个蜡块中，以保证切片和染色条件相同。为防止倒入纸盒内的石蜡底部立刻凝固，可将纸盒置于一玻璃板上（或大培养皿内），然后将玻璃板置于80-90℃左右热水上，包埋时蜡盒底部 要放平，做蜡块的蜡要反复冻融较好。 3．修蜡块：待纸盒内蜡凝固后，用刀片将其修成梯形，组织块与蜡块边缘 之间的距离不得小于2mm。 （四）切片 在载玻片上擦少量甘油蛋白。可滴半滴甘油蛋白于载玻片上，用手指充分抹 匀，呈半干状为佳。切片厚约4-8μm，将切片在55℃左右水浴中展开，展开程度以带黄颜色的组织完全摊平为准。用涂有甘油蛋白的载玻片从水浴中捞取切片，放入37℃烘箱中过夜。每个组织块捞片2张。过夜后，将载玻片置于玻片架上，进行下面的实验。 （五）脱蜡、染色与脱水 倾斜玻片架，将玻片架和载玻片下缘的试剂用筒纸吸干，减轻对其他试剂浓 度的影响。全过程约需要60分钟。 1．脱蜡 （1）二甲苯（I）15分钟 （2）二甲苯（II）15分钟 （3）100%乙醇2分钟 （4）95%乙醇（I）1分钟 （5）95%乙醇（II）1分钟 （6）蒸馏水浸洗1分钟
小鼠淋巴细胞分离方法 一、实验用品的准备： 1.采血用品：10ml注射器10个；手套20付；15ml离心管10个；20μl枪头、200μl 枪头、1000μl枪头。摄子、剪刀各2把；加样器；70%酒精；5%碘酒； 2.取脾用品：10ml注射器10个；手术器械10套；手套20付，60mm玻璃培养皿10个； 200 目尼龙网，裁成100mm×100mm正方形10块；10mL 玻璃注射器内活塞10个； 5mL刻度吸管、15mL离心管、1640培养基；鼠淋巴细胞分离液；摄子、剪刀各10 把；70%酒精；5%碘酒；移液器、离心机；刀剪浸泡液（新洁尔灭）； 注：红色必须灭菌；蓝色可以不灭菌；绿色需特殊处理；黑色不用灭菌。 二、相关实验： （一）实验名称：分离小鼠脾脏淋巴细胞 实验目的：获得小鼠脾脏淋巴细胞，为ELISPOT实验做准备。 实验动物：BABALB/c小鼠；雌性 实验材料： 1．小鼠淋巴细胞分离液, 2．60mm玻璃培养皿 3．10mL 玻璃注射器内活塞，灭菌 4．气管切开包 5．5mL刻度吸管、15mL离心管、移液器、离心机 6．1640培养基 实验方法 1. 断颈处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。 2. 在超净台中小心剪开小鼠的腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏。注意无菌操作。 3. 在培养皿中放入3mL1640基础培养基，将小鼠脾脏放入培养皿中，用1ml注射器吸取小鼠淋巴细胞分离液，注入小鼠脾脏，直至完全分离。 4. 把悬有脾脏细胞的1640培养基缓慢转移到装有6 mL淋巴细胞分离液的15 mL离心管中。 5. 3000转离心15分钟。（病毒室离心机） 6.吸出淋巴细胞层，加入5mL 1640培养基洗涤一次，1500转离心10 分钟。 7.倾倒上清液，加入3-5mL5ml5%FCS1640培养基重悬，细胞计数。 8.对获得的小鼠脾脏淋巴细胞进行ELSPOT 检测。
淋巴细胞提取 一实验目的：小鼠脾淋巴细胞提取 二实验对象：B／C 小鼠 三实验器材： 1．试剂：淋巴细胞分离液、1640培养基 2．器材：无菌培养皿、200目尼龙网（裁成90mm*90mm正方形，灭菌）、10mL玻璃注射器内活塞（灭菌）、不同规格的镊子、剪刀若干（灭菌）、细胞实验常用器材（离心管、移液管、加样枪、离心机）、75%乙醇、烧杯（无菌）、大头针、超净台 四实验步骤： 1、断头处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。 2、在超净台中小心剪开小鼠腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠腹腔，用镊子摘下小鼠脾脏。注意无菌操作。 3、参考图一，在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液（使用前摇匀淋巴细胞分离液）。用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。（没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内，防止在研磨过程中液体挥发，使得密度与渗透压改变，影响分离效果） 4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μL的1640培养基。 5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示
6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。 五、注意事项： ①离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。覆盖层不必太厚，2Μl足矣。 ②如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中。否则，液体挥发，密度与渗透压都会改变，严重影响分离效果。其二，在所有的小鼠脾脏处理完后，统一再加1640覆盖层。如果加早了，两层液体会相互扩散，造成最终离心后的淋巴细胞层下移。 ③推荐使用尼龙网替代不锈钢网筛，以为尼龙网更柔软些 ④使用注射器活塞代替镊子研磨脾脏，由于镊子夹住脾脏的力度不好控制，易造成细胞死亡。
细胞生物学实验报告 题目：小鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 姓名：刘恋学号：201000140049 系年级：10级生科2班 一、【实验目的】 1．掌握线粒体的超活染色原理及方法。 2．观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。 二、【实验原理】 1．线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿B（Janus green B）是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。 不同细胞中线粒体的形态和数目不同。在电子显微镜下，线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。 线粒体的细胞色素氧化酶能使詹纳新绿染料始终保持在氧化状态而呈蓝色，周围细胞内的染料却被还原成无色的色基，在进行细胞的体外染色时，至少要使材料在詹纳斯绿染料中染色15min后再盖上盖玻片，以使材料充分氧化。 2．活体染色是指用燃料标记生活有机体的细胞或组织但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示活细胞内的某些结构，同时即不影响细胞的生命活动也不会产生任何物理、化学变化导致细胞的死亡。活染技术可用来研宄生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。 活体染色之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起作用。碱性燃料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子；而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们被此就发生了吸引作用。但不是任何染料都可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料配成稀的溶液来使用。一般以碱性染料最为常用，因为碱性染料具有溶解在类脂质的特性，易于被细胞吸收，如中性红、詹钠斯绿、次甲基蓝、甲苯胺蓝、亮焦油紫等。其中詹钠斯绿和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最常用的染料，分别对线粒体和液泡系有特异性的染色。詹纳斯绿B这种碱性染料是活体染色中重要的材料，对线粒体的染色有专一性，可专一性地对线粒体进行活染，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原成无色的色基。
小鼠肝脏组织取材步骤 小鼠肝脏组织取材步骤，并列出完成此次实验所需要的试剂、仪器、材料等相关物品及实验人员安排情况。 材料：小鼠 试剂：DMEM 戊巴比妥钠 75%酒精 PBS 器械消毒液戊二醛 仪器：解剖台备皮刀弯盘组织剪眼科剪手术刀柄刀片血管钳眼科镊 培养皿无菌手套 实验人员安排：小鼠养殖管理组准备工作组实验操作组 实验步骤: 1. 取材前夜禁食，自由饮水。 2. 小鼠称重，按照50mg/kg的比例用5ml的注射器配合针头抽取戊巴比妥钠备用。 3. 正左手的小指和无名指抓住大鼠的尾巴，另外三个手指抓住大鼠的颈部，使大鼠头部向向下。这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。右手持注射器，从腹部近腿根处刺入后再腹部皮下穿行深入，动作轻柔，缓慢注射。注射完药物后，缓缓拔出针头，手指按住针口对小鼠腹部轻柔按摩，促进麻醉药物的吸收，掐小鼠尾部检测小鼠麻醉程度。 4.将小鼠四肢固定于解剖台上，暴露小鼠整个胸部和腹部，修剪去腹部毛发，75%酒精消毒。 5.沿腹侧正中线自阴茎上源由下而上剪开腹部皮肤直至剑突，向两侧钝性剥开皮肤与皮下组织，暴露腹壁浅肌层。沿白线钝性分离腹壁肌肉，剪开腹膜，暴露腹腔，将肝脏向上翻起，显露肝门，眼科剪剪除肝脏周围结缔组织和血管。 6.结扎剪断肝门管道系统，钝锐结合完整取出大鼠肝脏，放置于无菌培养皿，生理盐水冲洗，称重并记录。①切取肝左叶约1mm×1mm×1mm组织3块，3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH 7.4)或4-戊二醛固定；②左叶肝组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；③右叶肝组织称重记录分装后全部放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。 7.切取肝左叶约1mm×1mm×1mm组织3块，3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH7.4)或4-戊二醛固定；左叶肝组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；右叶肝组织称重记录分装后全部放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。
万方数据
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医学实验肝癌动物模型的研究进展 作者：陈谦， 孙慧， 李强 作者单位：陈谦(天津医科大学附属肿瘤医院肝胆科,300060)， 孙慧,李强(300060,天津市环湖医院肿瘤科) 刊名： 中华实验外科杂志 英文刊名：CHINESE JOURNAL OF EXPERIMENTAL SURGERY 年，卷(期)：2006,23(3) 被引用次数：11次 参考文献(13条) 1.张伟俈动物模型与实验外科[期刊论文]-中华实验外科杂志 2003(4) 2.叶燕丽;周昕熙;王莲桂裸小鼠的繁殖及在肿瘤学中的应用[期刊论文]-实验动物科学与管理 2005(1) 3.Roy J;Couillard S;Gutman M A novel pure SERM achieves complete regression of the majority of human breast[外文期刊] 2003 4.Celinski SA;Fisher WE;Amaya F Somatostatin receptor gene transfer inhibits established pancreatic cancer xenografts[外文期刊] 2003(1) 5.Frydman B;Blokhin AV;Brummel S Cyclopropane-containing polyamine analogues are efficient growth inhibitors of a human prostate tumor xenograft in nude mice[外文期刊] 2003(21) 6.She Y;Lee F;Chen J The epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor ZD1839selectively potentiates radiation response of human tumors in node mice,with amarked improvement in therapeutic index[外文期刊] 2003 7.Katz MH;Takimoto S;Spivack D A novel red fluorescent protein orthotopic pancreatic cancer model for thepreclinical evaluation of chemotherapeutics[外文期刊] 2003(1) 8.Yao X;Hu JF;Daniels M A novel orthotopic tumor model to study growth factors and oncogenes in hepatocarcinogenesis[外文期刊] 2003 9.Shoji T;Konno H;Tanaka Sakaguchi T Orthotopic implantation of a colon cancer xenograft induces high expression of cyclooxygenase-2[外文期刊] 2003(2) 10.Lennder P A new liposomal contrast medium for CT of the liver.An imaging study in a rabbit tumour model[外文期刊] 1996 11.李雁;汤钊猷我国肝癌模型研究的历史和现状[期刊论文]-中华实验外科杂志 2001(5) 12.Niemann H;Kuse W Application of transgenesis in livestock for agriculture and biomedicine[外文期刊] 2003(3/4) 13.Wang BJZ Specific genetic modifications of domestic animals by gene targeting and animal cloning [外文期刊] 2003 本文读者也读过(6条) 1.彭方兴.严律南肝癌动物模型的研究进展[期刊论文]-中华实验外科杂志2000,17(5) 2.李翠云.段小娴肝癌动物模型研究进展[期刊论文]-医学研究杂志2006,35(10) 3.陈华.赵德明.CHEN Hua.ZHAO De-ming肝癌动物模型[期刊论文]-实验动物科学与管理2005,22(4) 4.胡卫.陈涛鼠移植性肝癌模型研究进展[期刊论文]-河南肿瘤学杂志2003,16(6) 5.徐静.李旭肝癌动物模型的建立[期刊论文]-实用肝脏病杂志2005,8(2)
小鼠脾脏中分离淋巴细 胞 Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】
从小鼠脾脏中分离淋巴细胞 １小鼠断颈处死，酒精浸泡５分钟，超净台内打开左侧腹部皮肤，小心分离皮下组织和腹部肌肉暴露出脾脏，提起，剪去周围结缔组织，放入有PBS的小瓶中。无菌镊子夹碎，挤压脾脏，将获得的细胞悬液移入无菌试管中。 ２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。选用适合自己分离目的细胞的离心力和时间进行离心。个人用1500转/分钟，20分钟。 ３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟，10分钟）。 ４，洗好的细胞加入１６４０培养液和２０％的血清中重悬，缓慢加入已经制备好的尼龙毛柱子中，封好，放３７度孵育一小时。一小时后取出，超净台内将柱子立起，针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号注射器做的），以HANKS液和血清先后缓慢冲洗，巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来，B细胞也相对吸附冲洗下来的不多，所以冲洗来的大多是T细胞，纯度可打到８０％到９０％，再次冲洗并且用力挤压，这样得到的就是B细胞。得到的细胞可以以１６４０加血清配制的培养液进一步培
养或做它用。但是淋巴细胞分离液得到的细胞只能算是粗分，如果实验要求高最好选用磁珠或流式分离。
淋巴细胞分离 淋巴细胞分离与计数 淋巴细胞分离 原理： 外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 tZz3a1Ui实验材料： 淋巴细胞分离液 肝素 稀释液（生理盐水） RPMI1640粉末 实验设备：1ml移液器、移液管、5ml注射器、刻度吸管、EP管、离心机、显微镜 操作流程： 1.在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。 2.无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中，（每1ml全血加 0.1ml 125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝 3.稀释（外周血：稀释液=1：2取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混匀） 4.用刻度吸管沿倾斜的管壁，把稀释血缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面（Ficoll：稀释血=1：2） 5.放入离心机1500r/min离心20min（注:缓慢加速1-4档个3分钟）
6.用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上体积的稀释液（生理盐水），1500rpm×10分钟离心，洗涤细胞。 7.重复洗涤一次，1500rpm×10分钟离心。 8.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞 9.计数细胞后再调整细胞置所需浓度. 10.取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。 单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝ 4个大方格内细胞总数 ────────── × 10４×2(稀释倍数) 4 11.分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。 注意事项: 1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞 2. Ficoll应适量，外周血应充分稀释 3.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 4.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面 5.吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染 淋巴细胞计数： 实验流程： 1.准备计数板：