毕业论文 题目：三种肺炎支原体检测法的临床应用分析 地市: 学校: 准考证号: 考生姓名: 王莹 指导老师: 二〇一八年八月十四日
三种肺炎支原体检测法的临床应用分析 摘要 目的探讨肺炎支原体（MP）咽拭子快速液体培养法、咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清MP被动凝集法（MP-Ab）等方法在儿童MP感染诊断治疗过程中的敏感性方法采用3MP检测法对362例临床拟诊呼吸道（非细菌性）感染的患儿的咽拭子和血清标本进行配对研究，每患儿取咽拭子做快速培养和PCR，同时取血清做MP-Ab检测，对3种方法的检测结果与临床诊断治疗病例进行回顾性分析。结果回顾临床病例诊断MP感染患儿152例。MP快速培养法检出阳性78例，阳性率为51.3%，病程为（4.5±2.6）天；PCR法检测出阳性103例，阳性率为67.8%，病程为（6.2±3.5）天；MP-Ab法检测出阳性127例，阳性率83.5%，病程（8.1±4.5）天。结论 3种MP检测法的敏感性与病程有相关性，临床医生应根据患儿病程选取检测方法，以提高阳性检出率和敏感性。 关键词肺炎支原体，快速培养法，咽拭子聚合酶链反应，血清抗体，配对研究
目录 前言 (4) 第一章文献综述 (5) §1.1 肺炎支原体的定义 (5) §1.2 肺炎支原体的发病机制 (5) §1.3 肺炎支原体的分类 (5) §1.4 肺炎支原体的临床表现 (5) §1.5 肺炎支原体的临床诊断 (5) §1.6 肺炎支原体的实验室检查 (6) 第二章材料和方法 (7) §2.1 样本 (7) §2.2方法概述 (7) §2.3临床诊断MP感染的诊断标准 (7) §2.4实验方法 (7) §2.5统计学方法 .................................................................... .. (8) 第三章结果 (9) 第四章讨论 (10) 结论 (11) 参考文献 (11) 附录 (12) 错误！未定义书签。
支原体肺炎患儿D—二聚体检测及临床意义 目的探讨支原体肺炎血浆D二聚体水平变化及临床意义。方法回顾分析湖南省人医院儿童呼吸病区2012年1月～12月收治的肺炎支原体肺炎患儿，根据临床症状、病程、影像学特点分为普通肺炎支原体肺炎组50例，难治性支原体肺炎组35例。于住院第1 d抽取静脉血行D二聚体检测，难治组恢复期再次抽血检测。普通肺炎组与健康对照组比较，普通肺炎组与难治组比较，难治组急性期与恢复期比较，并对结果进行分析。结果普通肺炎组与健康对照组D二聚体水平差异无统计学意义（P>0.05），难治性支原体肺炎组急性期D二聚体水平显著高于普通肺炎组（P＜0.01），难治性支原体肺炎组急性期与恢复期D二聚体水平差异显著（P＜0.01）。难治性支原体肺炎病情严重程度与D二聚体水平有一定的相关性。结论通过检查D二聚体水平可早期发现诊断难治性肺炎支原体肺炎。在难治性支原体肺炎患儿的诊治过程中，监测D二聚体水平并及时干预，有利于疾病转归。 标签：肺炎支原体肺炎；D二聚体；儿童 肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）是介于细菌与病毒之间能自我复制的一种病原微生物，是社区获得性肺炎的常见病原体之一[1]。既往认为MPP临床表现较轻，部分病例呈自限性。近几年重症/难治性肺炎支原体肺炎（RMPP）病例有逐年增多的倾向[2]。早期识别發现RMPP病例实属必要。本文旨在探讨肺炎支原体肺炎患儿D二聚体水平，为早期发现RMPP提供参考依据。 D-二聚体（D-dimmer）是纤溶酶水解交联纤维蛋白降解后形成的特异性降解产物，是体内高凝状态和纤溶亢进的分子标记物之一。研究证实，感染的程度不同，可伴有不同程度和范围的凝血系统的激活，D-二聚体水平有不同的变化。本研究拟在通过检测、对比分析湖南省人医院儿童医学中心呼吸病区2012年1月～12月收治的支原体肺炎患儿的血浆D-二聚体水平，揭示难治性支原体肺炎组与肺炎组之间的血浆D-二聚体水平差异性，从而为难治性支原体肺炎严重程度判定和临床治疗提供另一条思路，现分析报告如下。 1资料与方法 1.1一般资料资料来源于湖南省人医院儿童呼吸病区2012年1月～12月收治的肺炎支原体肺炎患儿。根据临床症状、病程、影像学特点分组。RMPP组：35例，男16例，女19例，年龄1～3岁5例，4～6岁19例，7～14岁11例，平均年龄（5.32±1.65）岁。MPP组：同期住院诊断MPP50例，男23例，女27例，年龄1～3岁9例，4～6岁23例，7～14岁18例，平均年龄（4.59±1.41）岁。健康对照组：儿童保健科体检儿童20例，男12例，女8例，平均年龄（3.87±1.18）岁。 1.2 MPP诊断标准参照《诸福棠实用儿科学》第7版[3]；起病4 w内双份血清支原体抗体的滴度升高有4 倍以上[4]；鼻咽部和口咽部的标本荧光定时定
附录XIIB支原体检查法 主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞法（DNA染色法）。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采用培养法检查支原体，必要时，亦可采用指示细胞法筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法 第一法培养法 推荐培养基及其处方 （1）支原体肉汤培养基 猪胃消化液 500ml 氯化钠2.5g 牛肉浸液（1:2）500ml 葡萄糖 5.0g 酵母浸粉5.0g 酚红0.02g pH值7.6±0.2。于121℃灭菌15分钟。 （2）精氨酸支原体肉汤培养基 猪胃消化液 500ml 牛肉浸液（1:2）500ml 葡萄糖 1.0g 酵母浸粉5.0g L-精氨酸2.0g 酚红0.02g 氯化钠2.5g pH值7.1±0.2。于121℃灭菌15分钟。 （3）支原体半流体培养基按（1）项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂2.5～3.0g。 （4）支原体琼脂培养基按（1）项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂13.0～15.0g。 培养基灵敏度检查（变色单位试验法）（1）菌种肺炎支原体（ATCC 15531）、口腔支原体（ATCC 23714），由国家药品检定机构分发。 （2）操作将菌种接种于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变色，盲传2代后，将培养物接种到待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10-7～10-9，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10-3～10-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基
内。每个稀释度接种3支试管，置36℃ 士1℃ 培养7～14天，观察培养基变色结果。 ( 3 )结果判定以接种后培养基管数的2 / 3以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。 液体培养基的灵敏度：肺炎支原体（ATCC 15531 )应达到10-8，口腔支原体（ATCC 23714）应达到10-4。 检查法（1）供试品如在分装后24小时以内进行支原体检查者可贮存于2～8℃ ；超过24小时应置一20℃ 以下贮存。 ( 2 )检查支原体采用支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基（或支原体琼脂培养基）。支原体半流体培养基（或琼脂培养基）在使用前应煮沸10～15分钟，冷却至56℃ 左右，然后加人灭能新生牛血清（培养基与血清体积比为8:2 )，并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。 取每支装量为10ml的支原体半流体培养墓（已冷至36℃ 士1℃ ）和支原体肉汤培养基各4支，每支培养基接种供试品0.5～1.0ml，置36℃ 士1℃ 培养21天。于接种后的第7天从4支中取2支进行次代培养，每1支培养基转种支原体半流体培养基及支原体肉汤培养基各2支，置36℃ 士l℃ 培养21天，每隔3天观察1次． ( 3 )结果判定培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。 【附注】质量检定部门应会同培养基制造部门定期抽检支原体培养基灵敏度。 第二法指示细胞培养法（DNA染色法） 将供试品接种于指示细胞（无污染的Vero细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞）中培养后，用特异荧光染料染色。如供试品污染支原体，在荧光显微镜下可见附在细胞表面的支原体DNA着色。 试剂（1）二苯甲酰胺荧光染料浓缩液称取二苯甲酰胺荧光染料5mg，加人100ml不含酚红和碳酸氢钠的Hank 's平衡盐溶液中，室温下用磁力搅拌器搅拌30～40分钟，使完全溶解，-20℃ 避光保存。 （2）二苯甲酰胺荧光染料工作液无酚红和碳酸氢钠的Hank ' s溶液100ml中加人二苯甲酰胺荧光染料浓缩液lml，混匀。 （3）固定液醋酸:甲醉（体积比1:3）混合溶液。 （4）封片液量取0.1mol / L枸橼酸溶液22.2ml、0.2mol / L磷酸氢二钠溶液27.8ml、甘油50.0ml，混匀，调pH值至5.5。 培养墓及指示细胞（1） DMEM完全培养基。 ( 2 ) DMEM无抗生素培养基。
儿童支原体RNA检测及肺炎支原体抗体的比较 发表时间：2016-05-09T11:40:39.230Z 来源：《中国医学人文》(学术版)2016年1月第2期作者：王玉琪 [导读] 比较2种检测方法的优缺点。结论：MP-RNA、MP-IgM均是诊断MP感染的有效指标，为临床诊断及治疗提供了有力的依据。 王玉琪 浙江大学医学院附属儿童医院浙江杭州 310052 【摘要】目前：通过对肺炎支原体（MP）RNA检测及抗炎支原体抗体（MP-IgM）的研究，探讨两种检测方法在临床中的应用。方法：对208例肺炎住院患儿行呼吸道分泌物MP-RNA及血清MP-IgM测定，比较2种检测方法的优缺点。结论：MP-RNA、MP-IgM均是诊断MP感染的有效指标，为临床诊断及治疗提供了有力的依据。 【关键词】肺炎支原体；抗体检测；RNA检测 肺炎支原体是（MP）是小儿呼吸道感染常见的病原体之一，可引起上呼吸道及下呼吸道感染，尤其是社区获得性肺炎（CAP）的重要病原[1]。MP的实验室检测方法有很多，血清学检测是目前MP感染的常规实验室手段[1]，利用酶联免疫吸附试验，如检测持续高滴度MP-IgM或恢复期抗体滴度较急性期4倍或4倍以上变化可诊断。近年随着分子生物学技术的发展，RNA恒温扩增实时荧光检测（SAT）技术应用于临床，为MP感染的早期诊断提供了新的检测方法。本研究对本院208例疑似肺炎支原体肺炎患儿分别采集呼吸道分泌物及血清同时检测患儿的MP RNA及MP-IgM，现将结果报告如下。 1资料与方法 1.1 一般资料 选择2015年6月1日~2015年12月1日在本院住院的疑似MP呼吸道感染的患儿208例，其中男性106例，女性102例，年龄1个月~13岁。根据年龄分为两组，A组（0~3岁，n=128），B组（3~12岁，n=80）。两组患者的一般资料具有可比性（P<0.05）。 1.2 仪器与试剂 杭州……………… 1.3方法 采集患静脉全血，常规分离血清后检测肺炎支原体抗体（MP-IgM），同时用灭菌棉签采集受试者咽部样本（大于1岁患儿）或痰液（小于1岁）行MP RNA检测。操作方法均严格按照试剂盒说明书进行。 1.4 肺炎支原体肺炎临床诊断标准：持续咳嗽，可伴有发热，白细胞计数正常或稍高，X线提示两肺均匀一致改变的片状阴影或大叶性肺炎改变。 1.5 统计学处理采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 208例患中，MP-IgM阳性率34.1%（71/208），MP RNA检测结果阳性共率31.2%（65/208），两者比较差异无统计学意义 （P>0.05）。 3 讨论 肺炎支原体（MP）是引起儿童呼吸道感染，尤其是社区获得性肺炎的常见病原体之一，临床表现为干咳、发热，部分患儿可出现胸腔积液、肺纤维化，肺外损害，如皮肤、胃肠道、血液系统损害、骨关节肌肉、中枢神经系统、心血管系统等[2-4]。MP感染症状可持续或迁延数周或数月，常可引起慢性咳嗽和反复呼吸道感染，还可能引起喘息。MP感染患儿临床表现常不典型，常规抗生素治疗效果欠佳，因此，早期诊断对临床治疗有着重要意义。目前，多种检测方法针对MP-IgM，具有灵敏度高，特异性强，操作简便快速的特点，已作为早期诊断MP感染的客观指标而应用于临床。本研究结果显示，208例患儿中，痰液标本或咽拭子SAT法，MP RNA阳性率34.6%，ELASA法测定MP-IgM阳性率29.3%，两者比较有统计学意义（P<0.05），这可能与血清标本留取时间有关，MP感染后约7d可在血清中检测出MP-DNA抗体，疾病早期可呈假阴性[5]。同时，在组内两种检测手段也呈现了不同结果。A组中的MP RNA的阳性率高于MP-IgM的检测 （P<0.01），这可能由于婴儿免疫系统发育不完善，当MP感染后不能产生或产生效价较低的抗体而导致漏诊，提示MP RNA方法更适于年幼儿和免疫损害患儿的MP感染的早期诊断[5]；而核酸检测受年龄影响较小，故阳性率较高。B组中，两种检测方法阳性率分别相比较无统计学意义（P>0.05），说明咽拭子MP RNA检测方法同样具有较高的敏感性，但同时需结合MP-IgM检测结果，以除外假阳性结果。综上所述，MP-IgM检测及MP RNA检测在诊断MP感染均有较高的价值，二者联合应用可提高检测的准确性，为临床诊断提供有力的依据。 参考文献： [1]Vervloet LA，Marguet C，Camargos PA．Infection byMycoplasma pneumoniae and its importance as an etiologicalagent in childhoodcommunity-acquired pneumonias[J]．Braz J Infect Dis，2007，11（5）：507—514． [2]Gaillat J，Elahault A，deBarbeyrac B，et https://www.doczj.com/doc/a51210404.html,munity epidemiology of Chlamydiaand Mycoplasma pneumoniae in LRTI in France over 29 months[J].Eur JEpidemiol，2005，20（7）：643-651. [3]Blasi F．Atypical pathogens and respiratory tract infee—tions[J]．Eur Respir J，2004，24（1）：171—181． [4]Hansbro PM，Beagley KW，Horvat JC，et a1．Role ofatypical bacterial infection of the lung in predisposition／protection ofasthma[J]．Pharnlaeol Ther，2004，101（3）：193-210． [5] Kim NH，Lee JA，Eun BW，et a1．Comparison of poly-merase chain reaction and the indirect particle agglutinationantibody test for
支原体检验法 1 培养基 1.1 检验禽源细胞和由禽胚组织或其细胞制成的活疫苗，用改良Frey 氏培养基。 1.2 检验其他种类细胞和病毒活疫苗，用支原体培养基 1.3 检验血清用无血清的支原体培养基 2 检查法 2.1 样品处理每批制品取样3-5瓶，液体制品混合后备用；冻干制品加液体培养基复原成混悬液后混合。检测血清时用血清直接接种。 2.2 疫苗的检测 2.2.1 接种于观察每个样品需同时用以下两种方法检测 2.2.2.1 液体培养基培养将疫苗混合物5.0ml接种小瓶液体培养基中，再从小瓶中去0.2ml移植接种于1小管液体培养基中，将小瓶与小管置于37℃培养，分别于接种后5日、10日、15日从培养瓶中取出0.2ml培养物移植到小管液体培养基内，每日观察培养物有无颜色变黄或变红，如果无变化，则在最后一次移植小管培养、观察后14日后停止观察。在观察期内，如果发现小瓶或任一小管内液体颜色出现明显变化，在原pH变化达0.5时，应立即移植于液体培养基和固体培养基，观察在液体培养基中是否出现恒定的pH变化，及固体上有无典型的“煎蛋”状支原体菌落。 2.2.2.2 琼脂固体平板培养在每次液体培养物移植小管培养的同时，取培养物0.1-0.2ml接种于琼脂平板，置含5%-10%二氧化碳。潮湿的
环境、37℃下培养。此外，在液体培养基颜色出现变化，在原pH变化达到0.5时，也同时接种琼脂平板。每5-7日，在低倍显微镜下观察各琼脂平板上有无支原体菌落出现，经14日观察，仍无菌落时，停止观察。 2.2.2 对照每次检查需同时设置阳性、阴性对照，在同条件下培养观察。检测禽类疫苗时用滑液支原体作为对照，检测其他疫苗时用猪鼻支原体作为对照。 2.3 血清的检测取本血清50ml代替培养基中的马、猪血清，按附录38页培养基配方配成大瓶培养，按2.2.1.2项稀释、移植、培养，观察小管培养基的pH变化情况和琼脂平板上有无菌落。 3 结果判定 3.1 接种本物的任何一个琼脂平板上出现支原体菌落时，判定血清或者疫苗不合格。 3.2 阳性对照中至少有一个平板出现支原体菌落，而阴性对照中无支原体生长，则检验有效。 附注：上述小瓶培养基是指在100ml小瓶中盛20ml液体培养基；小管培养基是指在1.0cm*10cm中盛1.8ml培养基。小管与小瓶须用胶塞封口。
PCR法支原体测定PROTOCOL 生效日期（年-月-日） 有效期至（年-月-日） 分发部门：质量部
1.目的 规范PCR法支原体检测的操作方法。 2.范围 适用于项目研发过程样品、原液、成品及中间体的分析。 3.责任 质量分析人员熟悉并遵守该标准操作规程。 4.定义 N/A 5.设备、材料和试剂 5.1设备、材料 设备名生产商型号/货号备注PCR仪Thermo ARKTIK5020 N/A VORTEX IKA GENIUS 3 N/A 小型台式冷冻离心 机Thermo HERAEUS Fresco 21 N/A 单道移液器 (10ul,20ul,100ul) Eppendorf Research plus N/A 多功能水平电泳槽Tanon HE-120 N/A 凝胶成像系统BIORAD ChemiDoc? XRS+ System N/A 5.2试剂 试剂名称生产商货号TaKaRa PCR Mycoplasma Detection Set TaKaRa 6601 TaKaRa Ex Taq? TaKaRa RR001A Regular Agarose G-10 Biowest N/A Goldview 国产N/A
10×Loading Buffer TaKaRa 9157 DL5000 DNA Marker TaKaRa 3428A 内毒素检查用水厦门鲎试剂实验厂有限公司 6.溶液配制 6.1 50× TAE Buffer 称取242.0g Tris，37.2g Na2EDTA·2H2O于1L烧杯中，向烧杯中加入约800ml 超纯水，充分混匀，加入57.1ml冰乙酸，充分溶解，加入超纯水定容至1L，室温保存。有效期6个月。 6.2 1× TAE Buffer 量取10ml 50× TAE Buffer，加入490ml超纯水，充分混匀。有效期6个月。 7.操作步骤 用于检测支原体的样品是接种后进行3-6天细胞培养的培养上清液。如果使用常用的细胞培养基时，培养上清可直接加入到PCR反应液中，如果使用细胞悬浊液作为样品，则需要提取DNA，再进行PCR反应。如果样品中含有PCR 反应阻碍物，需要对DNA进行抽提，再添加到PCR反应液中，为了确认样品中是否含有反应阻碍物，在样品中加入Control Template进行正对照反应。 7.1 1st PCR反应 7.1.1按下表顺序配制反应混合液（50ul体系） 试剂用量（ul） 内毒素检查用水37.75~38.75 10× PCR Buffer 5 dNTP Mixture 4 MCGp F1 Primer 0.5 MCGp R1 Primer 0.5
支原体检测SOP 目的：制定支原体检验标准操作规程，确保检验操作正确。 范围：本标准适用于本公司主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞、病毒收获液、原液的支原体检验操作。 依据：《中国药典》2010年版三部通则3301支原体检测法。 一、培养法 1、检测原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。 2、适用器材：灭菌锅、试管（带盖）、10ml移液管、1ml移液管、37℃培养箱、 3、检测步骤： （1）培养基的制备：【外购培养基】 （2）检测培养基的灵敏度： 将菌种接于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变色，盲传两代后，将培养物接种至待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10-7～10-9，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10-3～10-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内。每个稀释度接种3支试管，置36℃±1℃培养7～14天，观察培养基变色结果。 结果判定以接种后培养基管数的2/3以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。 液体培养基的灵敏度：肺炎支原体（ATCC 15531株）应达到10-8，口腔支原体（ATCC 23714株）应达到10-4。 （3）培养基前处理： 检查支原体采用支原体液体培养基和支原体半流体培养基（或支原体琼脂培养基）。半流体培养基（或琼脂培养基）在使用前应煮沸10～15分钟，冷却至56℃左右，然后加入灭能小牛血清（培养基︰血清为8︰2），并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。 （4）接种培养： 取每支装量为10ml的支原体液体培养基各4支、相应的支原体半流体培养基各2支（已冷却至36℃±1℃），每支培养基接种供试品0.5～1.0ml，置36℃±1℃培养21天。于接种后的第7天从4支支原体液体培养基中各取2支进行代次培养，每支培养基分别转种至相应的支原体半流体培养基及支原体液体培养基各2支，置36℃±1℃培养21天，每隔3天观察1次。 （5）结果判定： 无生长——合格； 疑有生长——加倍量复试——无生长——合格；
肺炎支原体培养及药敏检测的临床意义 一、支原体 支原体：又称霉形体，为目前发现的最小的最简单的原核生物。支原体细胞中唯一可见的细胞器是核糖体（支原体是原核细胞，原核细胞的细胞器只有核糖体）。 支原体对热的抵抗力与细菌相似。对环境渗透压敏感，渗透压的突变可致细胞破裂。对重金属盐、石炭酸、来苏尔和一些表面活性剂较细菌敏感，但对醋酸铊、结晶紫和亚锑酸盐的抵抗力比细菌大。对影响壁合成的抗生素如青霉素不敏感，但红霉素、四环素、链霉素及氯霉素等作用于支原体核蛋白体的抗生素，可抑制或影响蛋白质合成，有杀灭支原体的作用。 二、肺炎支原体 肺炎支原体（M.Pneumonia），MP,是支原体的一种，是人类支原体肺炎的病原体。支原体肺炎的病理改变以间质性肺炎为主，有时并发支气管肺炎，称为原发性非典型性肺炎。主要经飞沫传染，潜伏期2～3周，发病率以青少年最高。MP感染的临床表现常无特异性，临床的实际工作中，容易与一般病毒性感冒相混淆。在临床上患儿有下列症状：（1）发热呈弛张热或不规则热。刺激性咳嗽非脓性痰，偶带血丝。（2）可有咽痛、头痛、胸痛，全身症状比体征明显。（3）肺部体征不典型而胸片炎症显著，可见云雾状大片阴影。（4）WBC正常或升高。（5）青霉素类、磺胺类抗生素治疗无效，改用或一开始用大环内酯类抗生素有效。（6）实验室MP检验有1项或1项以上阳性具备以上2个条件或以上者可初步诊断为MP感染。更多时候，临床医生为了尽快缓解患儿的症状，需根据患儿的症状、体征和病史做MP感染的诊断性治疗，但应与肺结核相互鉴别。 三、肺炎支原体的诊断方法比较及临床意义 1、PCR法 咽拭子PCR法检测质粒核酸，该法快速、敏感和特异，通过这一技术可从患儿痰中检测MP-DNA。由于此方法相当敏感，易受污染，故实验室操作时应特别小心。统计结果显示，该法的阳性率为67.76%（103/152），高于快速培养法。此法弥补了极微量的和被药物杀死的MP不能通过快速培养法检出的病例。但是此法操作复杂，对设备及标本要求比较高。
肺炎支原体两种检测方法的比对分析 目的：探讨肺炎支原体（MP）咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清间接免疫荧光法（IIFA）两种检测方法的不同。方法：将198例疑似MP感染的患儿根据年龄分为两组：A组（0～3岁，n=75）、B组（3～12岁，n=123），分别取咽拭子用PCR法测MP-DNA，取血清用IIFA法测MP-IgM，比较两种方法的阳性率。结果：MP-DNA检测阳性率为57.07%，MP-IgM检测阳性率为47.47%，两者比较差异有统计学意义（P＜0.01）。A组MP-DNA阳性率48.00%明显高于同组MP-IgM阳性率25.33%，差异有统计学意义（P＜0.01）；B组MP-DNA和MP-IgM阳性率分别为62.60%、60.98%比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：PCR与IIFA联合检测可以提高MP感染诊断的准确性。 标签：肺炎支原体；聚合酶链反应；间接免疫荧光法；肺炎支原体抗体 肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）是小儿呼吸道感染的常见病原体之一，主要通过呼吸道传染，临床表现多种多样，以呼吸道感染最为多见，并可引起全身各脏器损害[1]。MP的实验室检测方法有很多，近年来发展的咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清间接免疫荧光法（IIFA）法均具有快速、敏感性高的优点[2]。为了客观评价这两种方法的异同，本研究对198例疑似肺炎支原体肺炎患儿分别采集咽拭子和血清同时用咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清间接免疫荧光法（IIFA）检测MP，现将结果报告如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料选取本院儿科收治的疑似MP感染的急性呼吸道感染患儿198例，年龄0～12岁，根据年龄将其分为两组：A组（0～3岁，n=75）、B组（3～12岁，n=123）。两组患者一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。 1.2 仪器与试剂杭州博日line gene PCR扩增仪，ZEISS型荧光显微镜。PCR 法试剂盒由凯杰生物工程有限公司生产提供；IIFA法检测试剂盒由西班牙VIRCELL公司生产提供。 1.3 方法用灭菌棉签采集受试者咽部样本用PCR法检测MP-DNA，同时采集患儿静脉全血，常规分离血清后用IIFA 法检测MP-IgM。操作方法均严格按照说明书进行。 1.4 小儿肺炎支原体肺炎临床诊断标准持续剧烈咳嗽；全身症状比胸部体征明显；X射线所见较体征显著，胸片可见两肺均匀一致的片状阴影成似大叶性肺炎改变，肺门阴影增浓；白细胞计数正常或稍高，血沉多增快；应用大环内酯类效果好，其他抗生素如青霉素、头孢无效[3-4]。 1.5 统计学处理
PCR法检测支原体 实验原理： 通过对支原体特定的序列设计引物，当存在支原体污染时通过PCR特异性扩增，会将目标DNA特异性的复制，然后通过琼脂糖电泳观检测，会跑出条带出现阳性结果。反之当没有支原体污染时，由于没有模板，PCR无法扩增，则琼脂糖电泳跑不出条带，出现阴性结果，为确保PCR法的精确性，故需要找到最优的PCR条件在进行检测。 实验目的： 检测培养的细胞是否有支原体污染。 实验材料： 0.5 ml EP管；PCR管；镊子；手套；口罩；EP管架；移液枪（100 ul，10 ul）及配套枪头(黄、白)；dd H2O；上下游引物（两组）；dNTPs；10 x Buffer；Easy Taq；冰盒；琼脂糖；锥形瓶（200ml）；量筒（50ml）；全套琼脂糖电泳设备（电泳槽，制胶槽，梳子，电源输出）；凝胶成像系统； PCR引物： LZY-5 Myco universal F：GGGGAATGGGTGAGTAACACG LZY-5 Myco universal R：CGGATAACGCTTGCGACCTATG 产物大小：500bp LZY-6 mycotest F ：GGGAGCAAACAGGATTAGTATCCCT LZY-6 mycotest R ：TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC 产物大小：250bp 实验步骤： 1、取样： 直接取培养细胞的培养基上清。 2、PCR（为25ul体系） 1、配制反应体系，根据检测样本数+1个阴性对照（水）+1个阳性对照，算出PCR 样本的个数，在此基础上增加几管的量，把除检测培养基外的其他组分按计算好的量加到一起，混匀后分装，最后加入检测培养基。
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PCR法检测支原体 实验原理： 通过对支原体特定的序列设计引物，当存在支原体污染时通过PCR特异性扩增，会将目标DNA特异性的复制，然后通过琼脂糖电泳观检测，会跑出条带出现阳性结果。反之当没有支原体污染时，由于没有模板，PCR无法扩增，则琼脂糖电泳跑不出条带，出现阴性结果，为确保PCR法的精确性，故需要找到最优的PCR条件在进行检测。 实验目的： 检测培养的细胞是否有支原体污染。 实验材料： 0.5 ml EP管；PCR管；镊子；手套；口罩；EP管架；移液枪（100 ul，10 ul） 及配套枪头(黄、白)；dd H2O；上下游引物（两组）；dNTPs；10 x Buffer；Easy Taq；冰盒；琼脂糖；锥形瓶（200ml）；量筒（50ml）；全套琼脂糖电泳设备（电泳槽，制胶槽，梳子，电源输出）；凝胶成像系统； PCR引物： LZY-5 Myco universal F：GGGGAATGGGTGAGTAACACG LZY-5 Myco universal R：CGGATAACGCTTGCGACCTATG 产物大小：500bp LZY-6 mycotest F ：GGGAGCAAACAGGATTAGTATCCCT LZY-6 mycotest R ：TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC 产物大小：250bp 实验步骤： 1、取样： 直接取培养细胞的培养基上清。 2、PCR（为25ul体系） 1、配制反应体系，根据检测样本数+1个阴性对照（水）+1个阳性对照，算出PCR 样本的个数，在此基础上增加几管的量，把除检测培养基外的其他组分按计算好的量加到一起，混匀后分装，最后加入检测培养基。
非典型性肺炎与支气管炎是儿童的常见病和多发病，肺炎支原体感染在儿童肺炎中占有较大比重，肺炎支原体是1~6岁儿童易感的支原体，是呼吸道感染的常见病原体，多引起急性支气管炎和间质性非典型性肺炎[2]，病程较长，易复发和交叉感染，特别是3~6岁的儿童在幼儿园期间极易交叉传播，应及早发现和治疗[3]。肺炎支原体感染的早期诊断多靠血清学检测（ELISA法）肺炎支原体抗体IgM作为诊断治疗的依据。 本检测结果显示，儿童支原体感染性别差异无统计学意义，主要是1~6岁儿童多发，4~7岁儿童阳性率高于1~3岁阳性率，可能与儿童聚集和年龄段的免疫力有关，这与国内王力等报道的发病年龄段一致。支原体感染四季均有发生，秋冬季节发病明显，可能与秋冬季节气候变化及儿童自身的免疫力弱有关，国内作者报道有些地区支原体发病明显在夏秋季节，这进一步说明，支原体发病有四季平衡的趋势，应引起临床重视。 ELISA法检测肺炎支原体抗体特异性高、敏感性强、简单、快速，可以避免非特异性抗体的干扰[4]，是临床诊断支原体肺炎的可靠检测方法。 肺炎支原体是秋冬季节易引起儿童支原体非典型肺炎的病原体，婴幼儿、青少年易感，患有老年病的体弱老年群体也容易被感染。大多引起急性支气管炎和间质性肺炎，占临床肺炎发病率的15%~20%，其感染发病率为9.6%~66.7%，感染发病率的范围较大，应引起临床重视，尤其是婴幼儿和青少年人群[1]。目前使用ELISA法检测肺炎支原体抗体，特异性高、敏感性强、检测快速，为临床早期诊断提供了有力的保障。 人体感染肺炎支原体后,能产生特异性IgM和IgG类抗体。IgM类抗体出现早，般在感染后1周出现，3～4周达高峰，以后逐渐降低。由于肺炎支原体感染的潜伏期为2～3周，当患者出现症状而就诊时，IgM抗体已达到相当高的水平，因此IgM抗体阳性可作为急性期感染的诊断指标［1］。如IgM抗体阴性，则不能否定肺炎支原体感染, 需检测IgG抗体。IgG较IgM出现晚，需动态观察，如显著升高提示近期感染，显著降低说明处于感染后期。由此提示IgG与IgM同时测定，可提高诊断率，达到指导用药、提高疗效之目的。
支原体检验方法及临床意义刘静 发表时间：2017-09-29T16:57:57.453Z 来源：《航空军医》2017年第15期作者：刘静 [导读] 说明女性的生殖道比男性生殖道更易生长支原体。另外，分解尿素支原体的感染率要比人型支原体的感染率为高。 （大兴安岭呼中区人民医院检验科 165036） 摘要：探讨支原体的检验方法及临床意义。方法抽选我院2015年5月至2017年2月患者标本146例，进行支原体检验回顾性分析。结果146例患者通过支原体检验，查出支原体感染，非特异性尿道炎患者36例，支原体尿路感染38例，间质性膀胱炎29例，局限性外阴炎16 例，脱屑性阴道炎综合征14例，妊娠合并支原体感染8例，老年人支原体肺炎5例。结论了解支原体特性、检验方法及临床意义，对支原体感染引起的疾病的防治工作具有重大意义。 关键词：支原体；检验；临床意义 支原体是细胞外生存的最小微生物，是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3～0.5um之间，呈高度多形性，有球形、 杆形、丝状，分枝状等多种态。它不同于细菌，也不同于病毒，种类繁多、分布广泛、造成的危害相当大，涉及人、动物、植物及昆虫等多个领域，给人类健康和科研工作带来不利影响。从人体分离的16种支原体中，5种对人有致病性，即肺炎支原体、解脲支原体、人型支原体，生殖支原体及发酵支脲解支原体属含脲解支原体等体、脲解支原体及人型支原体等对人有致病性[1]。 支原体检验是检查人体是否受到支原体的感染，为临床诊断与治疗支原体感染患者提供依据的一种检查方法。支原体只能粘附在呼吸 道或泌尿生殖道的上皮细胞表面的受体上，而不进入组织和血液。现抽选我院患者标本146例作为研究对象，进行回顾性分析，探讨支原体的检验方法及临床意义，阐述如下。 1一般资料 抽选我院2015年5月至2017年2月患者标本146例，进行支原体检验回顾性分析。本组中男性患者72例，女性患者54例，年龄23～63 岁，平均年龄（36.5±3.7）岁。 2致病机理 致病支原体中，肺炎支原体起肺炎，人型支原体，解脲支原体和生殖器支原体主要泌尿生殖道感染。支原体肺炎又称原发性非典型肺 炎，支原体肺炎全年均可发病，以冬季多见，可有小流行，支原体肺炎是学龄前儿童及青年人常见的一种肺炎，支原体肺炎主要通过飞沫传播，潜伏期较长，可达2～3周，支原体肺炎虽然病程较长，肺部病变较重，炎症吸收较慢，但绝大多数预后都是良好的，病原为肺炎支原体，是一种介于细菌和病毒之间的微生物，无细胞壁结构，兼性厌氧，能独立生活的最小微生物。健康人吸入患者咳嗽，打喷嚏时喷出的口，鼻分泌物而感染。病原体通常存在于呼吸道纤毛上皮之间，不侵入肺实质，通过细胞膜上的神经氨酸受体位点，吸附于宿主呼吸道上皮细胞表面，抑制纤毛活动并破坏上皮细胞。合并症亦少，生殖器支原体感染是近年新明确的一种性接触传播疾病，成人主要通过性接触传播，新生儿则由母亲生殖道分娩时感染，成人男性的感染部位在尿道黏膜，女性感染部位在宫颈，新生儿主要引起结膜炎和肺炎。3检验方法及过程 3.1分离培养法 分离培养法是支原体检测的金标方法，其检测精确度最高。这种方法是从可疑的细胞培养体系中取样，并接种到最适宜支原体生长的 琼脂平板上。如果样本中含有支原体，它们就会在这种琼脂平板上疯狂生长，最终形成明显可见的特征性菌群。分离培养法基本不会出现假阴性结果，因此被誉为支原体检验金标准。 3.2DNA检测 DNA检测需要将可疑样品与指示细胞共同培养，因此一般需要几天时间。DNA检测所用的指示细胞通常是细胞质区域较大的Vero细 胞，如果原样本中含有支原体，那么当细胞DNA被荧光染料染色时，就可以在指示细胞的核周围观察到荧光斑点或荧光颗粒。 3.3PCR法 PCR法检测支原体只需要几个小时，是最快但也是最不灵敏的支原体检测方法。该方法采用针对支原体DNA的引物用PCR检测可疑样 本，其中PCR引物通常针对支原体的16SrRNA基因。在凝胶电泳过程中，支原体DNA会显示为特异性条带，以此指示支原体的存在。PCR法可以检测大多数支原体，但谨慎起见最好同时采用另一种检测方法进行验证。 3.4酶学检测和ELISA 酶学检测是将可疑样本添加到特定底物中，在这一体系内支原体的酶可以将ADP转化为ATP，随后能利用ATP发光的luciferase酶就可以 指示支原体的存在。ELISA也能用于支原体检测，以ELISA法为基础的支原体检测一般使用针对支原体16SrRNA基因的带标记探针或抗体，来检测培养物中是否含有支原体[2]。 4结果 4.1相关疾病 146例患者通过支原体检验，查出支原体感染，非特异性尿道炎患者36例，支原体尿路感染38例，间质性膀胱炎29例，局限性外阴炎16例，脱屑性阴道炎综合征14例，妊娠合并支原体感染8例，老年人支原体肺炎5例。 4.2临床意义 （1）需要检查的人群：疑似有支原体感染的病人。 支原体阳性，见于支原体感染，可见于非淋球菌性尿道炎。 （2）异常结果尿黄、尿道口微红、尿频、尿不尽、尿道痛，烧灼感、尿滴沥。 5结论 支原体是1898年Nocard等发现的一种类似细菌但不具有细胞壁的原核微生物，能在无生命的人工培养基上生长繁殖，直径50- 300nm，能通过细菌滤器。支原体在过去曾称之为类胸膜肺炎微生物（pleuropneumonia-like organism，PPLO）。1967年正式命名为支原 体。 支原体（mycoplasma）：又称霉形体，为目前发现的最小的最简单的原核生物。基因数量为480。支原体细胞中唯一可见的细胞器是
支原体检测S O P 公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
支原体检测SOP 目的：制定支原体检验标准操作规程，确保检验操作正确。 范围：本标准适用于本公司主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞、病毒收获液、原液的支原体检验操作。 依据：《中国药典》2010年版三部通则3301支原体检测法。 一、培养法 1、检测原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。? 2、适用器材：灭菌锅、试管（带盖）、10ml移液管、1ml移液管、37℃培养箱、 3、检测步骤： （1）培养基的制备：【外购培养基】 （2）检测培养基的灵敏度： 将菌种接于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变色，盲传两代后，将培养物接种至待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10-7～10-9，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10-3～10-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内。每个稀释度接种3支试管，置36℃±1℃培养7～14天，观察培养基变色结果。 结果判定以接种后培养基管数的2/3以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。 液体培养基的灵敏度：肺炎支原体（ATCC 15531株）应达到10-8，口腔支原体（ATCC 23714株）应达到10-4。 （3）培养基前处理： 检查支原体采用支原体液体培养基和支原体半流体培养基（或支原体琼脂培养基）。半流体培养基（或琼脂培养基）在使用前应煮沸10～15分钟，冷却至56℃左右，然后加入灭能小牛血清（培养基︰血清为8︰2），并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。 （4）接种培养： 取每支装量为10ml的支原体液体培养基各4支、相应的支原体半流体培养基各2支（已冷却至36℃±1℃），每支培养基接种供试品～，置36℃±1℃培养21天。于接种后的第7天从4支支原体液体培养基中各取2支进行代次培养，每支培养基分别转种至相应的支原体半流体培养基及支原体液体培养基各2支，置36℃±1℃培养21天，每隔3天观察1次。
开展支原体检测的临床意义 一、项目开展背景和意义： 支原体是一种无细胞壁、介于独立生活和细胞内寄生生活间的最小型原核生物，体积介于细菌与病毒之间，与许多泌尿生殖道感染症、围产期感染和不育症等都有关系，是性传播疾病的病原体之一，一旦感染。可对人体造成多种伤害。其中解脲脲原体(Uu)与人型支原体(Mh)是人类泌尿道和生殖道常见寄生菌之一，是引起非淋球菌性尿道炎(NGO)的主要病原体?。 在2014年微生物年会上，川北医学院附属医院检验科一篇关于：川东北地区泌尿生殖道沙眼衣原体（CT）、淋球菌（NG）和解脲支原体（UU）的调查报告显示，3种病原体至少一种感染的感染率为46.7%，单独感染解脲支原体的阳性率为30.5%，单独感染沙眼衣原体（CT）阳性率为4.3%，单独感染淋球菌（NG）阳性率为2.2%。混合感染中解脲支原体（UU）+沙眼衣原体（CT）阳性率为 5.1%。不同来源的标本在临床科室分布中，妇产科和皮肤科分布较高，阳性率分别为63.6%和42.2%，不同年龄段中，各种类型感染患者均与20-40岁年龄段为主，临床感染趋势显示逐年升高，并且成逐年上升趋势。应该重视该人群的检测和治疗，控制该类疾病的发生。 目前医疗单位都是采用单纯液体培养法（Uu和Mh液体培养基）检测支原体，通过液体变色来完成。其原理是支原体在液体中生长有其不同于细菌的特点，因其个体微小，在增殖过程中不导致浑浊或生成沉淀，Uu分解尿素Mh分解精氨酸均生成胺，使液体培养基由酸变碱，指示剂酚红在培养基中颜色由黄变红，所
以临床上常将液体培养基在培养48h内变红且澄清者判定为支原体生长阳性。 但支原体液体培养实际上只是一种生化鉴定，不能准确判定有无支原体感染，不能做到真正地将Uu和Mh从送检的标本分离出来，其原因为液体培养是通过添加不同底物进行生化反应来间接判断，如果送检的标本菌相复杂，或因杂菌量过大，超出培养基中抑菌剂的抑菌能力，受标本中其他能够产碱病原体影响也会变色，且常易出现培养的污染，造成结果的假阳性或假阴性，尤其是假阳性，引发大量医患纠纷。而且一种液体培养基仅凭颜色不能同时判定两种以上的支原体感染，但多年来一直没有根本的解决这个问题的根本方法。 按照国内外学者的普遍观点，固体培养法是诊断支原体有无的最佳方法，尤其是固体培养基可以在低倍显微镜下直接观察到支原体特有的典型(Uu深褐色海胆状、Mh油煎蛋样)菌落，是诊断支原体的可靠依据，彻底解决了现有液体支原体培养（包括液体支原体培养及药敏）假阳性、假阴性问题。 同一个标本，固、液培养基同时接种培养（先接种固体培养基），利用固体培养具有选择性强、特异性好的优点进行确诊, 而液体培养出具药敏结果。以固体培养基上有无菌落形态为标准，出具液体培养及药敏的结果（有菌落，则药敏有效，否则反之），即符合支原体培养鉴定金标准，同时满足了临床对药敏鉴定的需求，更具有科学的临床指导意义。 二、解脲支原体（Uu）、人型支原体（Mh）固体选择分离培养基