支原体检测SOP
目的：制定支原体检验标准操作规程，确保检验操作正确。
范围：本标准适用于本公司主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞、病毒收获液、原液的支原体检验操作。
依据：《中国药典》2010年版三部通则3301支原体检测法。
一、培养法
1、检测原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。
2、适用器材：灭菌锅、试管（带盖）、10ml移液管、1ml移液管、37℃培养箱、
3、检测步骤：
（1）培养基的制备：【外购培养基】
（2）检测培养基的灵敏度：
将菌种接于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变色，盲传两代后，将培养物接种至待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10-7～10-9，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10-3～10-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内。每个稀释度接种3支试管，置36℃±1℃培养7～14天，观察培养基变色结果。
结果判定以接种后培养基管数的2/3以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。
液体培养基的灵敏度：肺炎支原体（ATCC 15531株）应达到10-8，口腔支原体（ATCC 23714株）应达到10-4。
（3）培养基前处理：
检查支原体采用支原体液体培养基和支原体半流体培养基（或支原体琼脂培养基）。半流体培养基（或琼脂培养基）在使用前应煮沸10～15分钟，冷却至56℃左右，然后加入灭能小牛血清（培养基︰血清为8︰2），并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。
（4）接种培养：
取每支装量为10ml的支原体液体培养基各4支、相应的支原体半流体培养基各2支（已冷却至36℃±1℃），每支培养基接种供试品0.5～1.0ml，置36℃±1℃培养21天。于接种后的第7天从4支支原体液体培养基中各取2支进行代次培养，每支培养基分别转种至相应的支原体半流体培养基及支原体液体培养基各2支，置36℃±1℃培养21天，每隔3天观察1次。
（5）结果判定：
无生长——合格；
疑有生长——加倍量复试——无生长——合格；
二、DNA染色法
1、检测原理：利用荧光染剂（Hoechst 33258）侦测支原体污染。染剂和支原体DNA 特异性结合，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，证明细胞被支原体污染。
2、适用器材：二氧化碳培养箱、荧光显微镜、6孔培养板（含盖玻片）、灭菌锅、1ml、10ml移液管、无菌载玻片、
3、检测步骤：
（1）检测试剂的制备：
A、无菌HBSS：配制Hanks’ balanced salt solution，以0.22mm无菌过滤膜过滤灭菌。勿用高压蒸汽灭菌。
B、.Hoechst 33258 stock solution（100X）：称取5.0 mg bisbenzimide于100 ml无菌HBSS，置于棕色瓶中，室温下以电磁搅拌器搅拌30分钟至完全溶解后，以1ml分装至1.5ml小离心管中，贮存于-20℃。
C、.Hoechst 33258 working reagent：取1 ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中，室温下搅拌45分钟，置于棕色瓶中并以铝箔纸包覆，避免光照，贮存于4℃。
D、.封片液（mounting solution）：22.2 ml 0.1 0.1ml/L 枸橼酸和27.8 ml 0.2mol/L 磷酸氢二钠加入于50 ml 甘油中混合，以11mol/L NaOH调整pH至5.5（pH很重要），贮存于4℃。
E、.固定溶液（fixative）：冰醋酸与甲醇以1：3体积比例混合，使用前才配制。
（2）培养基和指示细胞：
DMEM完全培养基
DMEM无抗生素培养基
指示细胞：
.培养Vero细胞：（已证明无支原体污染的Vero细胞或其他传代细胞）Vero细胞可作长期培养或制作多个冷冻保存管，测试前解冻培养。测试前一周培养Vero细胞。
在接种测试样品前一日，以trypsin-EDTA溶液处理Vero细胞，制成细胞悬浮液，以105cells／ml培养于6孔细胞培养板中，每个孔加入0.5ml细胞悬浮液，每空再加无抗生素培养基3ml，于37℃, 5％CO2培养。隔日确定生长良好后，即可接种测试样品。
（3）供试品处理：
细胞培养物将供试品经无抗生素培养液至少传一代，然后取细胞已长满的且3天未换液的细胞培养上清液待检。
毒种悬液如该毒种对指示细胞可形成病变并影响结果判定时，应用对支原体无抑制作用的特异抗血清中和病毒后或用不产生细胞病变的另一种指示细胞进行检查。
其他供试品检查时所选用的指示细胞应为该供试品对其生长无影响的细胞。
（4）DNA染色
于制备好的指示细胞培养板中加入供试品（细胞培养上清液）2ml（毒种或其他供试品至少1ml），置5%二氧化碳孵箱36℃±1℃培养3～5天。指示细胞培养物至少传代1次，末代传代培养用含盖玻片的6孔培养板培养3～5天。
①吸除培养液，于每个孔中加入5ml 1：3混合的冰醋酸/甲醇固定液，静置10 min后，吸除固定液。重复上述之步骤，风干10分钟。②于每个孔中，加入5ml Hoechst 33258 working solution，,加盖，室温下静置30min。③吸掉Hoechst 33258染液后，以5ml无菌水洗涤3次，吸出水后，盖玻片于空气中干燥，取洁净载玻片加封片液1滴，分别将盖玻片面向下盖在封片液上制成封片。④荧光显微镜观察。观察细胞核外是否有蓝色荧光小点或是丝状点之荧光物产生。
用无抗生素培养基2ml替代供试品，同法操作，作为阴性对照。
用已知阳性的供试品标准菌株2ml替代供试品，同法操作，作为阳性对照。
（5）结果判定
阴性对照—无生长（荧光显微镜下，只观察到Vero细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。）
阳性对照—生长（在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色荧光小点或是丝状点。其形状一致，与细胞残片染成之不规则点状物不同。）
供试品—阴性—合格
供试品—阳性—重试—阳性—不合格