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Invitrogen中国测序通用引物序列

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Invitrogen中国测序通用引物序列
引物名称 序列(5'-3')
M13R CAG GAA ACA GCT ATG ACC
M13F TGT AAA ACG ACG GCC AGT
M13F(-47) CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC
M13R(-48) AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA
M13(-96) CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG
SP6 ATT TAG GTG ACA CTA TAG
T7 TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG
T7 terminator TGC TAG TTA TTG CTC AGC GG
T3 ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA
pGEX-4T-5' GGG CTG GCA AGC CAC GTT TGG TG
pGEX-4T-3' CCG GGA GCT GCA TGT GTC AGA GG
GLp1 TGT ATC TTA TGG TAC TGT AAC TG
GLp2 CTT TAT GTT TTT GGC GTC TTC CA
RVp3 CTA GCA AAA TAG GCT GTC CC
RVp4 GAC GAT AGT CAT GCC CCG CG
pcDNA3.1R TAG AAG GCA CAG TCG AGG
PinPoint primer CGT GAC GCG GTG CAG GGC G
pCMV-F TCT AAA AGC TGC GGA ATT GT
pCMV-R TCCAAACTCATCAATGTATC
pTRC99C-F: TTG CGC CGA CAT CAT AAC
pTRC99C-R: CTGCGTTCTGATTTAATCTG
pCEP-F: AGA GCT CGT TTA GTG AAC CG
EBV-R : GTG GTT TGT CCA AAC TCA TC
pIRES2-EGFP.P5’: GTA GGC GTG TAC GGT GGG AG
pIRES2-EGFP.P3’: AAC GCA CAC CGG CCT TAT TC
3'AD: AGA TGG TGC ACG ATG CAC AG
CMV -F CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTG
S1 CAA CGT GAA AAA ATT ATT ATT CGC
S6 GTA AAT GAA TTT TCT GTA GTA GG
5`AOX1 GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC
3`AOX1 GCA AAT GGC ATT CTG ACA TCC
α-Factor TAC TAT TGC CAG CAT TGC TGC
GAL4 AD TAC CAC TAC AAT GGA TG
pACT2-R GTGCACGATGCACAGTTGAA
pB42ADF: CCA GCC TCT TGC TGA GTG GAG ATG
pB42ADR: AAG CCG ACA ACC TTG ATT GGA G
pEGFP-N-5’: TGG GAG GTC TAT ATA AGC AGA G
pEGFP-N-3’: CGT CGC CGT CCA GCT CGA CCA G
pEGFP-C-5’: CAT GGT CCT GCT GGA GTT CGT G
pEGFP-C-3' : TAT GGC TGA TTA TGA TCA GT
PBV220F: AAG AAG GGC AGC ATT CAA AG
PBV220R: CTG CGT TCT GAT TTA ATC TG
U6 ATG GAC TAT CAT ATG CTT ACC GTA
2.0rev primer: AGG CGA TTA AGT TGG GTA
3.0rev: GAG TTA GCT CAC TCA TTA GGC
S.tag GAA CGC CAG CAC ATG GAC
5'TriplEx2 CTC CGA GAT CTG GAC GAG C
RVP4 GAC GAT AGT CAT GCC CCG CG
RVP3 CTA GCA AAA TAG GCT GTC CC
pQE30/(32)-R GTT CTG AGG TCA TTA CTG G
pQE30/(32)-F TGA GCG GAT AAC AAT TTC AC
pEF-F TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTC
pDSRED-N1-R TGA AGC GCA TGA ACT CCT TG
pDsRED-express-C1-F TCC CAC AAC GAG GAC TAC AC
pCMV5R ATT ATA GAG GAC ACC TAG TC
pCMV5F TTC CAA AAT GTC GTA ATA AC
P5' TGC GTA CTG CGG TGA TCA AC
P3' CTG CAA GGC GAT TAA GTT GG
BAC2 ACG CAC AGA ATC TAG CGC TT
BAC1 AAC CAT CTC GCA AAT AAA TA
3'BD: TAA GAG TCA CTT TAA AAT TTG TAT AC
pTarget.F CCA GGA TTT TCC CAG TCA C
pTarget.R GGC TTT ACA CTT TAT GCT TC
T7(17base) ACA TCC ACT TTG CCT TTC TC
pYes2.R TCG GTT AGA GCG GAT GTG
GAL4 BD TCA TCG GAA GAG AGT AG
pAS2-1.R AAG AGT TAC TCA AGA ACA AGA A
pFlag-CMV-F: GGT AGG CGT GTA CGG TGG
pFlag-CMV-R: GCA CTG GAG TGG CAA CTT
pIRES-F: CTT ACT GAC ATC CAC TTT GC
pIRES.R: CAC TGC ATT CTA GTT GTG GT
P1 CCA GGC TTT ACA CTT TAT GC
P2 GCG ATT AAG TTG GGT AAC GC
pLEXA-F CGT CAG CAG AGC TTC ACC AT
pLEXA-R TAA AAC CTA AGA GTC ACT TT
pLNCX-F AGC TCG TTT AGT GAA CCG TCA GAT CG
pLNCX-R ACC TAC AGG TGG GGT CTT TCA TTC CC
pLXSN-F CTT GAA CCT CCT CGT TCG AC
pLXSN-R GTT GCT GAC TAA TTG AGA TG
pSHUTTLE-CMV-F GGT CTA TAT AAG CAG AGG TG
pSHUTTLE-CMV-R GTG GTA TGG CTG ATT ATG ATC AG
MalE Primer GGT CGT CAG ACT GTC GAT GAA GCC

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菌液PCR

菌液PCR

菌液PCR的经验由于课题组所需，我需要构建数量可观的真核表达载体和融合载体起初我也查到相关菌落PCR 的文献，和导师商量，导师一口回绝了他的理由和我所搜集到的理由一样：假阳性我们实验室一博士师姐需要做一个真核表达载体挑选了60个菌落，运用目的基因的上下游引物做PCR，出来条带的有有52个。

按照经验选取比较亮的14个提取质粒，酶切和PCR双鉴定结果仅有一个为阳性克隆，其余均为假阳性（假阳性主要考虑来源于未与载体结合的插入片段）只是我需要做的基因太多，最凶猛的时候我一个星期要用两个200次的TianGen 的质粒小提，累死人不偿命后来我自己对着图谱研究了一下（我所使用的是pCDNA 3.0载体、pCDNA3.1 myc his C载体和pEGFP载体）.0的MCS两端有T7和SP6如果我用T7和SP6作为引物，则1.P出大小约150bp的片段，则为MCS序列，无插入片段2,若有插入片段，则应该为目的大小+152bp如下图所示：后再改进为T7+目的基因下游引物（目的基因-R），或者目的基因上游引物（目的基因-F)+SP6因为即使用T7+SP6证明有插入但也不能确定为目的片段这样既解决了假阳性也解决了基因的特异性问题如下图：总结如下：1.PCR引物的选择（此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R或SP6+目的基因-FpCDNA3.1 myc his C（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-RpEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）仔细的阅读你的载体图，选择针对阳性重组子的特异性引物组合2. 菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中37°C 200rp m摇床摇2-4小时以上（通常赶时间的话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30个循环）3. 菌液的处理无需特殊处理菌液或取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸4. pcr体系：无特殊要求同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度5. 模板的量：1-2ul未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）6. 退火温度：55-58°C此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C或者58°C完成T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C 均可以P出目的条带7. 循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P出来8 .预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我将预变形的时间改为10-15mins，效果不错，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步以上就是学弟的一点个人经验，绝大部分经过自己的验证，如有觉得不妥的地方还请大家多多指正！再次高呼：菌液PCR在阳性克隆的筛选中异常的方便和廉价，高度推崇！！！P.S. 通过长时间的魔鬼试验进程，我现在基本可以做到用肉眼高精度的识别菌落，一般挑取的菌落90%以上均为阳性菌落，所以这篇文章暂时定位于小鸟级别的分生试验者，老鸟。

测序引物设计原则 知乎

测序引物设计原则 知乎

测序引物设计原则知乎
1.引物长度：引物长度通常在18-24个碱基对之间，不过具体长度要根据所需扩增的DNA片段长度来确定。

2. 引物序列：引物序列应该与目标DNA片段的序列互补，尽量避免引物内部的配对以及引物之间的二聚体或多聚体形成，以确保PCR反应的特异性和效率。

3. 引物的GC含量：引物的GC含量应该在40-60%之间，过低或过高的GC含量都会影响PCR反应的特异性和效率。

4. 引物的熔点：引物的熔点应该相似，以保证引物在PCR反应中同时结合到目标DNA的两端。

5. 引物的特异性：引物设计时应该避免引物与非目标DNA片段的互补，以确保PCR反应的特异性。

6. 引物的位置：引物应该选择在目标DNA序列的两端，以确保PCR反应只扩增出目标DNA片段。

7. 引物的杂交效率：引物设计时应该尽量避免引物与非目标DNA 的互补，以确保PCR反应的效率。

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一步法RT-PCR扩增PRSV海南分离物全长基因组cDNA

一步法RT-PCR扩增PRSV海南分离物全长基因组cDNA

一步法RT-PCR扩增PRSV海南分离物全长基因组cDNA庹德财;沈文涛;高乐;言普;周鹏【摘要】以植物总RNA提取试剂盒提取的高纯度的总RNA为模板,使用OligodT-Adaptor和Random9引物合成了番木瓜环斑病病毒海南分离物(PRSV HN-2)的cDNA第一链,基于已报道的PRSV全长基因组序列,设计合成了一对引物,一步法RT-PCR扩增出PRSV海南分离物全长基因组cDNA.为了验证获得的全长基因组cDNA的正确性,并以扩增出的全长cDNA为模板,将PRSV全长基因组分成A、B2个大片段进行扩增,应用T载体进行克隆和测序以验证所获得的全长基因组cDNA序列的正确性.测序结果显示,该cDNA序列与国内外报道的PRSV各分离物全长核苷酸序列的相似性很高,表明本文建立的一步法RT-PCR扩增PRSV全长基因组cDNA的方法正确、可行.%To determine the complete nucleotide sequence of Papaya ringspot virus of Hainan isolate, an efficient method was developed to amplify the full-length cDNA of PRSV. Total RNA was extracted by RNAprep Pure Plant Kit from susceptible papaya leaves. The first strand synthesis using Oligo-dT and random nine primers was carried out, which catalyzed by AMV Reverse Transcriptase. The full-length cDNAof PRSV was amplified by using an optimized PCR. Both A and B segment were generated and cloned using the amplified full-length cDNA segment as the template. The sequence of the full-length of PRSV of Hainan isolate was given in this paper.【期刊名称】《热带作物学报》【年(卷),期】2011(032)007【总页数】5页(P1347-1351)【关键词】番木瓜环斑病病毒:全长基因组cDNA;克隆与测序【作者】庹德财;沈文涛;高乐;言普;周鹏【作者单位】海南大学农学院,海南海口570228;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南海口571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南海口571101;海南大学农学院,海南海口570228;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南海口571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南海口571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南海口571101【正文语种】中文【中图分类】Q78番木瓜环斑病毒（Papaya ringspotvirus，PRSV）属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus），其病毒基因组为一条单链正义RNA分子，全长约为10.3 kb[1-2]。

QPCR及QRT-PCR系列产品

QPCR及QRT-PCR系列产品

Invitrogen的ICFC系列产品促销1．QPCR及QRT-PCR系列产品Invitrogen公司专门为中国客户提供的定量PCR试剂盒，结合了 UDG 防止残余污染技术和SYBR® Green I 荧光染料（存在于SYBR® Green I荧光定量PCR试剂盒中），在美国接受了严格的质量监控，可提供极高灵敏度的目的序列定量检测，线性剂量低，反应浓度范围很大。

qPCR Supermix-- 即用型反应剂，专为高特异性、实时定量DNA扩增设计UDG-- 防止携带污染物，减少克隆片段假阳性结果ROX参考染料-- 适用ABI仪器的校正染料产品信息活动时间：即日起至2009年4月30日2．Gibco南美胎牛血清即日起凡优惠价¥1780购买Gibco胎牛血清500ml（目录号:C2027050）即可获赠送价值¥250现金抵用券。

您可以凭现金抵用券在英韦创津公司购买任何商品，此券有效期至2009年5月31日。

产品信息活动时间：即日起至2009年4月30日独特的采集方式：GIBCO采用无菌心脏穿刺的方式采血原装直送，避免污染：原产地采集、加工、检测、包装。

完善的质控：采集、处理、检测、运输等环节都有文件和证书。

3．Invitrogen TA Cloning克隆产品专门用于克隆Taq聚合酶扩增的PCR产物。

采用pCR载体，能产生80%以上的重组产物，90%以上重组产物都包含插入片段。

产品信息活动时间：即日起至2009年5月31日附：pCR载体优点及图谱：3’-T突出端可直接连接Taq扩增的PCR产物可选择T7或T7和Sp6启动子进行体外RNA转录和测序侧向EcoRⅠ位点的通用多接头位点方便了插入片段的切离可以选择卡那霉素或氨苄青霉素进行筛选非常简便的蓝/白克隆筛选具有M13正向和反向引物位点，方便测序4．GIBCO液体培养基系列产品创立近50年的历史，品质优秀，产品种类丰富；为了中国用户利益，特建立国内生产线；所有产品，从原材料到生产全部按照GIBCO质量标准进行，每批均送抵美国公司总部质检合格后，才在国内销售。