测序通用引物

引物选对了，测序就完美了路遥说，⼈⽣的道路虽然漫长，但紧要处常常只有⼏步，特别是当⼈年轻的时候。

同样的，科研的道路虽然漫长，但决定成就的只有⼏点，特别是做实验时是否谨慎。

影响Sanger测序结果的条件有很多，前⾯已经详细介绍过了单条带稳定的PCR产物的制备，今天为您解析另⼀个关键因素如何选择测序引物。

——如何选择测序引物测序引物不能等同于PCR扩增引物，需要满⾜以下⼏个条件：⽐较 |通⽤引物优势显测序通⽤引物⼀般是根据载体的元件（启动⼦、终⽌⼦等）选择的，例如常见的通⽤引物T7即T7启动⼦，CMV-Forward是由CMV启动⼦设计的，M13F则是根据lac Z基因得来的。

现在常说的通⽤引物还包括针对某些载体设计的载体引物，例如根据载体的绿⾊荧光蛋⽩基因设计的载体引物pEGFP-C-3。

测序公司通常会免费提供⼀些常见通⽤引物。

这些经过QC验证的引物，质量上有更好的保证。

⽤载体的通⽤引物测序，可以监测出⽬的⽚段是否成功克隆到载体中（是否为空载）。

考虑到通⽤引物的技术和成本优势，⾦唯智建议您实验中尽可能选⽤通⽤测序引物。

⼀般情况下，PCR产物（尤其是较短的PCR产物）测序结果不理想时，可以将PCR产物克隆到载体中，⽤载体的通⽤引物测序。

特别是当PCR⽚段长度⼩于200bp时，建议您优先选择克隆到载体中测序。

配对|载体、位点是关键通⽤引物只与载体相关，不受⽬的⽚段限制。

测序时，不同载体需选择不同的通⽤引物。

某个载体该选⽤什么通⽤引物，可以通过⾦唯智公司官⽹上“服务资源”中的“⾦唯智免费通⽤引物”或者登录⾦唯智在线订单系统中的“通⽤引物选择⼯具”进⾏查询。

⼏种常见载体所使⽤的通⽤引物除了载体，引物结合位点对通⽤引物的选择也有很⼤影响。

由于Sanger测序法的局限性，通常刚开始的50bp-100bp测序不太稳定，通⽤引物不能距离克隆位点太近（建议⼤于50bp），否则有可能会导致部分⽬的⽚段测不出来。

因此，T载体（pMD 18-T载体）的测序通常选择正向引物M13F（-47）和反向引物M13R（-48）⽽不建议选择M13F和M13R。

一、测序样品要求：质粒：1. 已纯化质粒大于20ul，溶于超纯水浓度大于100ng/ul；2．大质粒必须注明载体长度;3．质粒拷贝数低的样品，请提供质粒。

菌液：1. 请提供１ml以上过夜培养新鲜无污染菌液，用Ependorf管装，并注意封口，以免污染．保存时间较长的甘油菌，请重新摇菌后送样． 2．培养基和抗生素：本公司提供LB培养基和胺卞青霉素、卡那青霉素、氯霉素三种抗生素。

若您的菌株培养时有其他要求，请你提供4～5ml培养好的新鲜菌液或沉淀下来的菌体。

3．请提供质粒的名称、抗性、插入片段的长度，指定确切的通用引物。

PCR产物：1. 样品检测标准：上样3～5ul，琼脂糖电泳鉴定，为清晰可见的单一亮带。

2．不接受样品小于150bp、电泳检测有弥散的，多带的样品，非单一条带样品，建议克隆后测序。

3．未纯化的PCR产物样品，体积大于50ul，浓度大于50ng/ul；已纯化PCR产物体积为20ul，浓度大于50ng/ul，可取2ul样品电泳检测条带清晰PCR产物明亮，长片段需加浓度。

不管测序是否成功，本公司都将收取纯化费用。

4．若您自己纯化，请一定要进行Agarose凝胶电泳方式纯化回收，溶解在超纯水中（勿用TE溶解），浓度＞30 ng/ul ，同时提供PCR引物。

5．长度超过1kb，需要2个以上的测序反应才能测通的PCR样品，建议克隆后测序，否则单覆盖难以得到包括PCR引物序列在内的完整序列号。

6．引物请提供20ul，浓度大于3μM。

二、免费提供通用引物列表：T7；SP6；M13F；M13R；M13F（-47）；M13R（-48）；M13（-96）；T7TER；T3；S.TAG；A-FACTOR；PBV220F；PBV220FR；5’AOX；3’AOX；PGEX-5’；PGEX-3；PEGFP-C-5’；PEGFP-C-3’；PEGFP-N-5’；PEGFP-N-3’；PCDNA3.1F；PCDNA3.1R三、注意事项:1．客户样品编号请用数字、英文字母（大写）或下划线，不超过5个字符；E-Mail要用大写字母填写，并要求字迹规范、工整、清楚。

通用引物测序的原理
通用引物测序是一种用于测定DNA序列的方法，它基于DNA的复制和扩增原理。

通用引物是一段具有特定序列的短DNA片段，能够与目标DNA序列的特定区域进行互补配对。

通用引物通常用于PCR（聚合酶链式反应）或Sanger 测序等技术中。

通用引物测序的原理如下：
1. DNA提取：从样本中提取DNA，并将其纯化。

2. PCR扩增：使用通用引物对目标DNA进行扩增。

通常，每个引物配对目标DNA的两个相邻区域，使其能够扩增出完整的目标序列。

3. PCR循环：PCR反应进行多个循环，每个循环包括DNA的变性、引物的结合和扩增等步骤。

这些循环可以使目标DNA的数量指数级增加。

4. 扩增产物检测：在每个PCR循环的末尾，通过电泳等方法检测扩增产物的大小和数量。

5. 分离扩增产物：将扩增产物分离出来，通常使用凝胶电泳等技术。

6. 测序：对扩增产物进行测序，通常使用Sanger测序方法。

在测序中，通用引物作为测序反应的起始点，通过DNA聚合酶和荧光标记的核苷酸逐个加入，形成DNA序列。

7. 数据分析：通过计算机软件对测序结果进行分析和解读，得到目标DNA序列。

通用引物测序的优点是可以扩增和测序多个目标序列，适用于不同种类的样本。

同时，通用引物也可以用于筛查和鉴定特定基因或序列的存在。

16S多样性测序，到底该选啥引物？！“微生物组”（Microbiome）是指由多种微生物聚居在一起形成的生态群落，从人和动物的肠道，到植物、土壤、海洋，它们无处不在，推动着地球物质循环，影响着人体乃至整个地球生物圈的健康。

小到一个工厂的污水处理，大到温室气体排放造成气候变暖，人类面临的能源短缺、环境污染、粮食安全、疾病流行等几乎所有问题的背后，都有微生物的身影。

近年来，得益于低成本高通量基因测序技术的发展、计算和成像技术的改进，以及用于数据分析的生物信息学工具的革新等进展，高通量测序走下神坛，变得平易近人，使得更多的学科领域开始投入到微生物组学的研究中来。

对于微生物组学的研究，最常见的就是对微生物群落结构多样性的研究。

也就是通过第二代高通量测序技术（Roche454高通量测序、Illumina MiSeq高通量测序等）对16SrDNA/18S rDNA/ITS等序列进行测序，获得样品中的微生物群落组成以及相对丰度。

探讨微生物多样性对于研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用有着重要的理论和现实意义。

在高通量测序的时代，“16S测序”在各大杂志期刊、学术报告及重大会议中频繁出现，那么你真正了解16S测序吗？为什么选择16S测序？16S测序区域又该如何选择？今天，小圆要跟大家聊一下16S测序中的引物选择。

1、16S 是个啥？16S rRNA 即16Sribosomal RNA，是原核核糖体30S小亚基的组成部分。

16S中的'S'是一个沉降系数，亦即反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标，值越高，说明分子越大。

16SrRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有原核微生物的基因组中。

16S rRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长（包含约50个功能域）。

随着PCR技术的出现及核酸研究技术的不断完善，16S rRNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具。

测序引物设计原则测序引物是在DNA或RNA测序实验中使用的一段短链核酸片段，用于在PCR扩增过程中特异性地诱导DNA复制。

引物的设计的好坏直接影响到测序实验的结果准确性和可重复性。

以下是一些常用的测序引物设计原则：1.特异性：测序引物应具有足够的特异性，能够只扩增目标DNA或RNA序列而不引发其他杂交事件。

多个引物对不同的目标序列进行扩增，可以提高特异性。

2.不形成二聚体或高级结构：测序引物不应该形成二聚体或高级结构，以免影响PCR反应的效率。

引物之间的二聚体或高级结构可以通过计算引物的熔解温度和引物之间的相互作用来预测。

3.熔解温度适中：测序引物的熔解温度应该适中，既不能太高也不能太低。

如果熔解温度太高，引物与模板DNA的结合将变得较弱，如果熔解温度太低，引物会与非特异性DNA序列结合。

通常，引物的熔解温度应在50-60摄氏度之间。

4.没有引物互相互补：在一个反应中使用的引物不能互相互补。

因为在引物互相互补的情况下，在PCR反应过程中会发生非特异性扩增，从而导致结果的偏差。

5.引物长度适中：测序引物的长度应该适中，通常在18-30个碱基对之间。

太短的引物可能会导致非特异性扩增，而太长的引物则可能会导致特异性较差。

6.避免引物与引物序列的互补性：引物序列本身也应避免与其他引物序列的互补性。

当引物与自身或其他引物形成互补结构时，会干扰PCR反应，降低扩增效率。

7.避免引物与其他非特异性DNA序列的互补性：除了引物之间互补性的避免外，引物也应避免与其他非特异性DNA序列（如非目标DNA序列中的重复序列）的互补性。

这样可减少非特异性扩增的发生。

8.引物设计要考虑GC含量和碱基组合的均匀性：引物的GC含量和碱基组合的均匀性也会影响PCR反应的效率。

通常，引物的GC含量应在40-60%之间，并且应尽量避免连续的GC或AT序列。

9.引物设计要考虑DNA二级结构：DNA二级结构可以影响引物与模板DNA的结合和扩增效果。

常用载体测序引物列表 载体名称 正向引物 反向引物pACT T7 T3pACT2 GAL4 AD(5’AD) 3'AD/pACT2-R PACYCDUET-1(MCSII) DuetUP2 T7TERpAD/pl-DEST CMV-FpAD-Track pAD-Track-F 无pAS2-1 5’BD M13-26/48 PB42AD PB42ADF PB42ADR PBAD PBAD-F PBAD-R pBABE pBABE5’ pBABE3’ PBACPAK8 BAC1BAC2 pBK-CMV T7/M13-20 T3/M13-26 PBS(SK/KS)/M13- M13F/T7T3/M13R pBV220 PBV220F PBV220R pBI121需根据酶切位点确认 需根据酶切位点确认 pCAMBIA 1301(1300)需根据酶切位点确认 需根据酶切位点确认 pCAMBIA 2300 需根据酶切位点确认 需根据酶切位点确认PCANTB5E S1/M13R S6pCAT3-enhancer pGL3+pcDNA3.0 pEGFP-N5/T7 SP6/BGHpcDNA3.1 pEGFP-N5/T7 BGHpcDNA4 T7/pEGFP-N5 BGHpcDNA6 T7/pEGFP-N5 BGHpcDNAII T7SP6 pCE2.1 M13FM13R pCEP4 pCMV5R/PCEP-F pEGFP-N5/EBV-R pCF-T M13FM13R pCIT7（17Base ） pCMV5R pCI-neo T7（17Base ） T3pCMS-EGFP T7T3 pCMV-3Tag-4A T3 /pFlag-CMV-F T7pCMV5 pCMV5F pCMV5R pCMV5-Flag pCMV5FpCMV5R pCMV-MYC/NUC pCMV5FpCMV5R PCMV-HA pCMV5FpCMV5R pCMV-SportSP6/M13RpCMV-Tag T3T7 pCMV-TNT T7/SP6pCMV5R pCR2.1-TOPO M13F/T7M13R pCR3.1 T7BGH pCS2 SP6T7PDNR-LIB M13F M13RpDonar M13F M13R pDONR201 pDONR-F pDONR-R pDONR221 M13F M13RpDrive T7 SP6 pDRIveR T7 SP6pDsRED1-C1 pDsRED-C1-F pECFP-C-3 pDsRed1-N1 pEGFP-N-5 RFP-NrevpDsRed-Monomer-N1 pEGFP-N-5 pDsRed1-NpDsRED2-C1 pDsRED-ex-C1-F pEGFP-N-3’pEGFP-N-5 pDsRed1-N pDSRED2-N1pDSRED-N1 pEGFP-N-5’ PDSRED-N-R pEASY-BLUNT M13F/T7 M13RTerpEASY-E1 T7 T7pEASY-T1 M13F/T7 M13RpEASY-T3 M13F/T7 M13R/SP6 pECFP-C pEGFP-C-5’ pECFP-C-3' pECFP-N1 pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’pEF/myc/ER pEF-F pCDNA3.1R pEGFP-C pEGFP-C-5’ pEGFP-C-3' pEGFP-N pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’ pENTR/D-TOPO M13F M13RTerpET-*(His) T7 T7pET22(a,b,c) T7 T7TerTerpET28,30,24,49 T7 T7TerpET32(a,b,c) T7/S.tag T7pET-42a (-b, -c)(+) Stag T7 TerpET50 T7/s.tag T7TERpET44 T7/s.tag T7Ter pEYFP-N1 pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’ PETBlue M13-20 PETBlueDOWN PETDUET-1(MCSI) PBRrevBam DuetDOMN1PETDUET-1(MCSII) DuetUP2 T7TERpEYFP-C1 pEGFP-C-5’ pEGFP-C-3' pEYFP-N1 pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’ pFastBac pFastBac-F pFastBac-R pFastBac HT_A,B,C pFastBac-PH pECFP-C-3 pFastBac1 pFastBac-PH pECFP-C-3 pFastBac Dual (MCSI) pFastBac-PH pECFP-C-3 pFLAG-CMV CMV30/pFLAG-CMV-F CMV-24/pFLAG-CMV-Rp3xFlag-CMV-7.1 CMV-F/CMV24 CMV30pGAD424 5’AD 3'ADpGADGH 5’AD 3'ADpGADT7-Rec 5’AD/T7 3'ADpGAPZa-A/B/C a-FACTOR 3'AOXforward 3'AOXpGAPZ-A/B/C pGAPpGBKT7 T7 3'BDpGEM-T(-Easy) M13F/T7 SP6/M13RpGEX-(*)T pGEX-5’ pGEX-3’pGL2 pCMV5R PGL3-Pgl3-BASIC pGL3+ PGL3-pGL3-Enhancer pGL3+ PGL3-PinPoint TM PinPoint Primer SP6pIRES PIRES-F/T7 T3/PIRES-RpIRES2-EGFP pIRES2-EGFP.P5’ pIRES2-EGFP.P3’ pLenti6/v5-Dest pEGFP-N-5’PLEXA PLEXA-F PLEXA-R PLNCX PLNCX-F PLNCX-R pLXSN pLXSN-F pLXSN-RPjc1-tac T7pJet.1.21.Blunt T7primer M13F(-47) pMAL-c2E MalEP3/PMAL-C2X-R pMAL-C2x P5/PMAL-C2X-Fprimer M13F(-47) pMAL-p2X MalEPMD18-T M13R(-48) M13F(-47) PMD19-T M13F(-47) M13R(-48) pMIR-report M13FPPC86 PPC86-F PPC86-R3’AOXpPIC9K 5’AOX/a-factor3'AOX pPICZa 5'AOX/PPICZa-FpPROEXHTA M13R(-48)pQE30or40 pQE30+ pQE30- pRECEIVER CMV-FpRSET T7 T7TER PRSFDUET-1(MCSI) DuetUP1 DuetDOWN1 PRSFDUET-1(MCSII) DuetUP2 T7TERpShuttle-CMV pShuttle-CMV-F pShuttle-CMV-R PSILENCE-1.0-U6 T7 T3pSilencer3.1-H1 hygro M13F(-47) 3.0revpSILENCEV2.0-U6 T7 2.0revpSK01-T M13F M13RpSK-CMV T7 T3Psos H1PSP64/65 SP6pSP72 T7 SP6T7/M13RpSport1 SP6/M13F(-47)pSTBlue-1 T7 SP6pSUPER T7 T3pT7Blue(R) T7 M13F(-47)pTA2 M13F/T7 T3/M13R/T7 M13RpT-Adv M13FpTARGET TM pTarget-F/T7 arget-RPTHIOHISA,B,C TRX-FORWARD TRX-REVERSEpTO-T7 T7 T7TERPBV220-/PTRC99C-R pTRC99a-c PQE30+/PTRC99C-FpTriPLEx2 PT5/5'TriplEx2 T7pTz57r/t M13+ M13-pTWIN-1 T7 T7TERpUC18(19)/118(119) M13F(-47) M13R(-48)M13F(-47)/M13F pUC57 M13R(-48)/M13RpUCm-T M13F/T7 M13RpVAX1 T7 BGHT3/M13R/M13R(-48) pWSK29 T7/M13F/M13F(-47)pXT7 T7 SP6pYES2 T7 pYes2.R。

测序通用引物序列常见载体的测序引物：Primer of Vector:Vector：Primer(F)；Primer(R)pACT T7 T3pACT2 GAL4 AD pACT2-RpAS2-1 GAL4 BD pAS2-1.RpB42AD pB42ADF pB42ADRpBACPAK8 BAC1 BAC2pBK-CMV T7 T3PBS(SK/KS)/M13- M13F/T7 T3/M13RpBV220 PBV220F PBV220RpCAMBIA 1301(1300) P1 P2pCAMBIA 2300 M13R(-48) M13F(-47)PCANTB5E S1/M13R S6pCAT3-enhancer RVP3 此载体无反向引物pcDNA3.0 CMV-F/T7 SP6/BGHpcDNA3.1 T7 BGHpcDNA4 T7/CMV-F BGHpcDNA6 T7/CMV-F(J21025在T7前面）BGHpcDNAII T7 SP6pCE2.1 M13F M13RpCEP4 pCEP-F EBV-RpCF-T M13F M13RpCI T7（17Base）此载体无反向引物pCI-neo T7（17Base）T3pCMS-EGFP T7 T3pCMV-3Tag-4A T3 /PFLAG-CMV-F T7pCMV5 pCMV5F pCMV5RpCMV5-Flag pCMV5F pCMV5RpCMV-MYC/HA pCMV-F pCMV-RpCMV-Sport M13F/T7 SP6/M13RpCMV-Tag(KAN+) T3 T7pCR2.1-TOPO M13F/T7 M13RpCR3.1 T7 BGHpCS2 SP6 T7pDonar M13F M13RpDONR221 M13F M13RpDrive T7 SP6pDRIveR(KAN+) T7 SP6pDsRED1-C1 pDsRED-ex-C1-F pEGFP-N-3’(距离很近,一般不用) pDsRED2-C1(KAN+) pDsRED-ex-C1-F pEGFP-N-3’pDSRED-N1(KAN+) pEGFP-N-5’ PDSRED-N-RpECFP-C pEGFP-C-5’ pECFP-C-3′pECFP-N1 pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’pEF/myc/ER pEF-F pCDNA3.1RpEGFP-C(KAN+) pEGFP-C-5’ pEGFP-C-3′pEGFP-N(KAN+) pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’pENTR/D-TOPO(KAN+) M13F M13RpET-*(His)(KAN+) T7 T7 TerpET22(a,b,c)(AMP+) T7 T7 TerpET28,30,24,49(KAN+) T7 T7 TerpET32(a,b,c)(AMP+) T7/S.tag T7 TerpET50(amp+) T7/s.tag T7TERpET44(AMP+) T7/s.tag T7 TerpEYFP-N1 pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’pEYFP-C1 pEGFP-C-5’ pEGFP-C-3′pFLAG-CMV pFLAG-CMV -F pFLAG-CMV -R pGAD424 GAL4 AD 3′ADpGADGH GAL4 AD 3′ADpGADT7-Rec GAL4 AD/T7 3′ADpGAPZa-A a-FACTOR 3′AOXpGBKT7(Kana+) T7 3′BDpGEM-T(-Easy) M13F/T7 SP6/M13RpGEX-(*)T pGEX-4T-5’ pGEX-4T-3’pGL2 GLP1 GLP2pGL3 RVP3 GLP2(RVP4)(没有特别说明用GLP2) PinpointTM Vector Pinpoint Primer SP6pIRES PIRES-F/T7 T3/PIRES-R (J40720)pIRES2-EGFP pIRES2-EGFP.P5’ pIRES2-EGFP.P3’pLXSN pLXSN-F pLXSN-RpMAL-c2E MalE primer M13F(-47)pMAL-C2x P5’ P3’pMAL-p2X MalE primer M13F(-47)PMD18-T M13R(-48) M13F(-47)PMD19-T M13F(-47) M13R(-48)pPIC9K(AMP+、ZEO+）5’AOX/a-factor 3’AOX pPICZa 5′AOX/PPICZa-F 3′AOXpPROEXHTA M13R(-48) 无反向引物pQE30or40 pQE30-F pQE-R:pRSET T7 T7TERpSilencer3.1-H1 hygro M13F(-47) 3.0REV pSILENCEV2.0-U6 T7 2.0REVpSK01-T M13F M13RpSK-CMV(KAN+) T7 T3pSP72 T7 SP6pSport1 SP6/M13F(-47) T7/M13RpSUPER T7 T3pTA2 M13F/T7(优先使用M13F）T3/M13RpT-Adv M13F /T7 M13RpTARGET TM pTarget.F(在T7前面）/T7 pTarget.R pTO-T7 T7 T7TERpTRC99a-c pTRC99C-F pTRC99C-RpTriPLEx2 5′pTriPLEx2 T7pTWIN-1 T7 T7TER(客户确认再用）pUC18(19)/118(119) M13F(-47) M13R(-48)pUCm-T M13F/T7 M13RpVAX1 T7 BGHpWSK29 T7/M13F/M13F(-47) T3/M13R/M13R(-48)pXT7 T7 SP6pYES2 T7 pYes2.RpLEXA pLEXA-F pLEXA-RpLNCX pLNCX-F pLNCX-RpRECEIVER CMV-F 此载体无反向引物pSHUTTLE-CMV PSHUTTLE-CMV-F PSHUTTLE-CMV-R pSP64/65 SP6 此载体无反向引物pSTBlue-1 T7 SP6pT7Blue(R) T7 M13F(-47)引物名称序列(5′-3′)：M13R：CAG GAA ACA GCT ATG ACCM13F：TGT AAA ACG ACG GCC AGTM13F(-47)：CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GACM13R(-48)：AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGAM13(-96)：CCC TCA TAG TTA GCG TAA CGSP6：ATT TAG GTG ACA CTA TAGT7：TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT7 terminator：TGC TAG TTA TTG CTC AGC GGT3：ATT AAC CCT CAC TAA AGG GApGEX-4T-5′：GGG CTG GCA AGC CAC GTT TGG TG pGEX-4T-3′：CCG GGA GCT GCA TGT GTC AGA GG GLp1：TGT ATC TTA TGG TAC TGT AAC TGGLp2：CTT TAT GTT TTT GGC GTC TTC CARVp3：CTA GCA AAA TAG GCT GTC CCRVp4：GAC GAT AGT CAT GCC CCG CGpcDNA3.1R：TAG AAG GCA CAG TCG AGGPinPoint primer：CGT GAC GCG GTG CAG GGC G pCMV-F：TCT AAA AGC TGC GGA ATT GTpCMV-R：TCCAAACTCATCAATGTATCpTRC99C-F: TTG CGC CGA CAT CAT AACpTRC99C-R: CTGCGTTCTGATTTAATCTGpCEP-F: AGA GCT CGT TTA GTG AAC CGEBV-R : GTG GTT TGT CCA AAC TCA TCpIRES2-EGFP.P5’: GTA GGC GTG TAC GGT GGG AG pIRES2-EGFP.P3’: AAC GCA CAC CGG CCT TAT TC3′AD: AGA TGG TGC ACG ATG CAC AGCMV -F：CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTGS1：CAA CGT GAA AAA ATT ATT ATT CGCS6：GTA AAT GAA TTT TCT GTA GTA GG5`AOX1：GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC3`AOX1：GCA AAT GGC ATT CTG ACA TCCα-Factor：TAC TAT TGC CAG CAT TGC TGCGAL4 AD：TAC CAC TAC AAT GGA TGpACT2-R：GTGCACGATGCACAGTTGAApB42ADF：CCA GCC TCT TGC TGA GTG GAG ATGpB42ADR：AAG CCG ACA ACC TTG ATT GGA GpEGFP-N-5’：TGG GAG GTC TAT ATA AGC AGA G pEGFP-N-3’：CGT CGC CGT CCA GCT CGA CCA G pEGFP-C-5’：CAT GGT CCT GCT GGA GTT CGT G pEGFP-C-3′ ：TAT GGC TGA TTA TGA TCA GTPBV220F：AAG AAG GGC AGC ATT CAA AGPBV220R：CTG CGT TCT GAT TTA ATC TGU6：ATG GAC TAT CAT ATG CTT ACC GTA2.0rev primer：AGG CGA TTA AGT TGG GTA3.0rev：GAG TTA GCT CAC TCA TTA GGCS.tag：GAA CGC CAG CAC ATG GAC5′TriplEx2：CTC CGA GAT CTG GAC GAG CRVP4：GAC GAT AGT CAT GCC CCG CGRVP3：CTA GCA AAA TAG GCT GTC CCpQE30-R：GTT CTG AGG TCA TTA CTG GpQE30-F：TGA GCG GAT AAC AAT TTC ACpEF-F：TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTCpDSRED-N1-R：TGA AGC GCA TGA ACT CCT TG pDsRED-express-C1-F：TCC CAC AAC GAG GAC TAC AC pCMV5R：ATT ATA GAG GAC ACC TAG TCpCMV5F：TTC CAA AAT GTC GTA ATA ACP5′：TGC GTA CTG CGG TGA TCA ACP3′：CTG CAA GGC GAT TAA GTT GGBAC2：ACG CAC AGA ATC TAG CGC TTBAC1：AAC CAT CTC GCA AAT AAA TA3′BD：TAA GAG TCA CTT TAA AAT TTG TAT AC pTarget.F：CCA GGA TTT TCC CAG TCA CpTarget.R：GGC TTT ACA CTT TAT GCT TCT7(17base)：ACA TCC ACT TTG CCT TTC TCpYes2.R：TCG GTT AGA GCG GAT GTGGAL4 BD：TCA TCG GAA GAG AGT AGpAS2-1.R：AAG AGT TAC TCA AGA ACA AGA ApFlag-CMV-F: GGT AGG CGT GTA CGG TGGpFlag-CMV-R: GCA CTG GAG TGG CAA CTTpIRES-F: CTT ACT GAC ATC CAC TTT GCpIRES.R: CAC TGC ATT CTA GTT GTG GTP1：CCA GGC TTT ACA CTT TAT GCP2：GCG ATT AAG TTG GGT AAC GCpLEXA-F：CGT CAG CAG AGC TTC ACC ATpLEXA-R：TAA AAC CTA AGA GTC ACT TTpLNCX-F：AGC TCG TTT AGT GAA CCG TCA GAT CG pLNCX-R：ACC TAC AGG TGG GGT CTT TCA TTC CC pLXSN-F：CTT GAA CCT CCT CGT TCG ACpLXSN-R：GTT GCT GAC TAA TTG AGA TGpSHUTTLE-CMV-F：GGT CTA TAT AAG CAG AGG TG pSHUTTLE-CMV-R：GTG GTA TGG CTG ATT ATG ATC AG MalE Primer：GGT CGT CAG ACT GTC GAT GAA GCC。

表4 主要使用的引物及序列序列技术在现代生物学研究中发挥着越来越重要的作用。

在进行序列分析之前，需要先选择合适的引物，以确保检测到所需的目标序列，并避免检测到不必要的杂交或引物间的相互杂交。

本文将介绍主要使用的引物及其序列。

1. 基因测序引物基因测序引物是用于测序DNA或RNA的引物。

这些引物通常包括一个DNA或RNA序列和一个与之匹配的引物序列。

常用的基因测序引物包括以下几种：- M13引物M13引物是一种通用的测序引物，用于测序单链DNA。

其序列为：5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'。

- T7和SP6引物T7和SP6引物用于测序DNA文库中的克隆DNA。

其中T7引物的序列为：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'，SP6引物的序列为：5'-ATTTAGGTGACACTATAG-3'。

- M13F和M13R引物M13F和M13R引物也用于测序单链DNA。

M13F引物的序列为：5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'，M13R引物的序列为：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'。

- T3和T7引物T3和T7引物与RNA兼容，并用于测序RNA和RNA-DNA杂交分子。

T3引物的序列为：5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGA-3'，T7引物的序列为：5'-TAATACGACTCACTATAG-3'。

2. PCR引物PCR引物是用于荧光定量PCR、数字PCR、标准PCR等技术的引物。

以下是几种常用的PCR引物：- GAPDH引物GAPDH引物用于检测人体组织中的GAPDH基因表达水平。

其序列为：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'（前引物）、5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'（后引物）。

一、测序样品要求：质粒：1. 已纯化质粒大于20ul，溶于超纯水浓度大于100ng/ul；2．大质粒必须注明载体长度;3．质粒拷贝数低的样品，请提供质粒。

菌液：1. 请提供１ml以上过夜培养新鲜无污染菌液，用Ependorf管装，并注意封口，以免污染．保存时间较长的甘油菌，请重新摇菌后送样． 2．培养基和抗生素：本公司提供LB培养基和胺卞青霉素、卡那青霉素、氯霉素三种抗生素。

若您的菌株培养时有其他要求，请你提供4～5ml培养好的新鲜菌液或沉淀下来的菌体。

3．请提供质粒的名称、抗性、插入片段的长度，指定确切的通用引物。

PCR产物：1. 样品检测标准：上样3～5ul，琼脂糖电泳鉴定，为清晰可见的单一亮带。

2．不接受样品小于150bp、电泳检测有弥散的，多带的样品，非单一条带样品，建议克隆后测序。

3．未纯化的PCR产物样品，体积大于50ul，浓度大于50ng/ul；已纯化PCR产物体积为20ul，浓度大于50ng/ul，可取2ul样品电泳检测条带清晰PCR产物明亮，长片段需加浓度。

不管测序是否成功，本公司都将收取纯化费用。

4．若您自己纯化，请一定要进行Agarose凝胶电泳方式纯化回收，溶解在超纯水中（勿用TE溶解），浓度＞30 ng/ul ，同时提供PCR引物。

5．长度超过1kb，需要2个以上的测序反应才能测通的PCR样品，建议克隆后测序，否则单覆盖难以得到包括PCR引物序列在内的完整序列号。

6．引物请提供20ul，浓度大于3μM。

二、免费提供通用引物列表：T7；SP6；M13F；M13R；M13F（-47）；M13R（-48）；M13（-96）；T7TER；T3；S.TAG；A-FACTOR；PBV220F；PBV220FR；5’AOX；3’AOX；PGEX-5’；PGEX-3；PEGFP-C-5’；PEGFP-C-3’；PEGFP-N-5’；PEGFP-N-3’；PCDNA3.1F；PCDNA3.1R三、注意事项:1．客户样品编号请用数字、英文字母（大写）或下划线，不超过5个字符；E-Mail要用大写字母填写，并要求字迹规范、工整、清楚。

通用引物
通用引物是一种在分子生物学中广泛应用的引物，用于扩增特定目标序列。

通用引物可以被设计成能够结合到多个不同物种的目标序列上，因此被称为“通用”。

以下是一些常见的通用引物：
1. 通用PCR引物：
- Forward引物：5' - GTGCCAGCMGCCGCGGTAA - 3'
- Reverse引物：5' - GGACTACHVGGGTWTCTAAT - 3'
2. 通用寡核苷酸引物（oligo-dT）：
- 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)18 - 3'
3. 通用测序引物：
- Forward引物：5' - GTGCCAGCMGCCGCGGTAA - 3'
- Reverse引物：5' - GGACTACHVGGGTWTCTAAT - 3'
这些通用引物设计得具有较高的特异性和亲和力，可以在各种不同的生物种类中扩增目标序列，例如基因组DNA、cDNA或特定的基因片段。

但是，由于不同物种的基因序列差异和变异，通用引物在不同物种中的扩增效率和特异性可能会有所差异，因此在实验设计和优化过程中需要注意选择合适的引物。

测序通用引物序列常见载体的测序引物：Primer of Vector:Vector：Primer(F)；Primer(R)pACT T7 T3pACT2 GAL4 AD pACT2-RpAS2-1 GAL4 BD pAS2-1.RpB42AD pB42ADF pB42ADRpBACPAK8 BAC1 BAC2pBK-CMV T7 T3PBS(SK/KS)/M13- M13F/T7 T3/M13RpBV220 PBV220F PBV220RpCAMBIA 1301(1300) P1 P2pCAMBIA 2300 M13R(-48) M13F(-47)PCANTB5E S1/M13R S6pCAT3-enhancer RVP3 此载体无反向引物pcDNA3.0 CMV-F/T7 SP6/BGHpcDNA3.1 T7 BGHpcDNA4 T7/CMV-F BGHpcDNA6 T7/CMV-F(J21025在T7前面）BGHpcDNAII T7 SP6pCE2.1 M13F M13RpCEP4 pCEP-F EBV-RpCF-T M13F M13RpCI T7（17Base）此载体无反向引物pCI-neo T7（17Base）T3pCMS-EGFP T7 T3pCMV-3Tag-4A T3 /PFLAG-CMV-F T7pCMV5 pCMV5F pCMV5RpCMV5-Flag pCMV5F pCMV5RpCMV-MYC/HA pCMV-F pCMV-RpCMV-Sport M13F/T7 SP6/M13RpCMV-Tag(KAN+) T3 T7pCR2.1-TOPO M13F/T7 M13RpCR3.1 T7 BGHpCS2 SP6 T7pDonar M13F M13RpDONR221 M13F M13RpDrive T7 SP6pDRIveR(KAN+) T7 SP6pDsRED1-C1 pDsRED-ex-C1-F pEGFP-N-3’(距离很近,一般不用) pDsRED2-C1(KAN+) pDsRED-ex-C1-F pEGFP-N-3’pDSRED-N1(KAN+) pEGFP-N-5’ PDSRED-N-RpECFP-C pEGFP-C-5’ pECFP-C-3′pECFP-N1 pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’pEF/myc/ER pEF-F pCDNA3.1RpEGFP-C(KAN+) pEGFP-C-5’ pEGFP-C-3′pEGFP-N(KAN+) pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’pENTR/D-TOPO(KAN+) M13F M13RpET-*(His)(KAN+) T7 T7 TerpET22(a,b,c)(AMP+) T7 T7 TerpET28,30,24,49(KAN+) T7 T7 TerpET32(a,b,c)(AMP+) T7/S.tag T7 TerpET50(amp+) T7/s.tag T7TERpET44(AMP+) T7/s.tag T7 TerpEYFP-N1 pEGFP-N-5’ pEGFP-N-3’pEYFP-C1 pEGFP-C-5’ pEGFP-C-3′pFLAG-CMV pFLAG-CMV -F pFLAG-CMV -R pGAD424 GAL4 AD 3′ADpGADGH GAL4 AD 3′ADpGADT7-Rec GAL4 AD/T7 3′ADpGAPZa-A a-FACTOR 3′AOXpGBKT7(Kana+) T7 3′BDpGEM-T(-Easy) M13F/T7 SP6/M13RpGEX-(*)T pGEX-4T-5’ pGEX-4T-3’pGL2 GLP1 GLP2pGL3 RVP3 GLP2(RVP4)(没有特别说明用GLP2) PinpointTM Vector Pinpoint Primer SP6pIRES PIRES-F/T7 T3/PIRES-R (J40720)pIRES2-EGFP pIRES2-EGFP.P5’ pIRES2-EGFP.P3’pLXSN pLXSN-F pLXSN-RpMAL-c2E MalE primer M13F(-47)pMAL-C2x P5’ P3’pMAL-p2X MalE primer M13F(-47)PMD18-T M13R(-48) M13F(-47)PMD19-T M13F(-47) M13R(-48)pPIC9K(AMP+、ZEO+）5’AOX/a-factor 3’AOX pPICZa 5′AOX/PPICZa-F 3′AOXpPROEXHTA M13R(-48) 无反向引物pQE30or40 pQE30-F pQE-R:pRSET T7 T7TERpSilencer3.1-H1 hygro M13F(-47) 3.0REV pSILENCEV2.0-U6 T7 2.0REVpSK01-T M13F M13RpSK-CMV(KAN+) T7 T3pSP72 T7 SP6pSport1 SP6/M13F(-47) T7/M13RpSUPER T7 T3pTA2 M13F/T7(优先使用M13F）T3/M13RpT-Adv M13F /T7 M13RpTARGET TM pTarget.F(在T7前面）/T7 pTarget.R pTO-T7 T7 T7TERpTRC99a-c pTRC99C-F pTRC99C-RpTriPLEx2 5′pTriPLEx2 T7pTWIN-1 T7 T7TER(客户确认再用）pUC18(19)/118(119) M13F(-47) M13R(-48)pUCm-T M13F/T7 M13RpVAX1 T7 BGHpWSK29 T7/M13F/M13F(-47) T3/M13R/M13R(-48)pXT7 T7 SP6pYES2 T7 pYes2.RpLEXA pLEXA-F pLEXA-RpLNCX pLNCX-F pLNCX-RpRECEIVER CMV-F 此载体无反向引物pSHUTTLE-CMV PSHUTTLE-CMV-F PSHUTTLE-CMV-R pSP64/65 SP6 此载体无反向引物pSTBlue-1 T7 SP6pT7Blue(R) T7 M13F(-47)引物名称序列(5′-3′)：M13R：CAG GAA ACA GCT ATG ACCM13F：TGT AAA ACG ACG GCC AGTM13F(-47)：CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GACM13R(-48)：AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA M13(-96)：CCC TCA TAG TTA GCG TAA CGSP6：ATT TAG GTG ACA CTA TAGT7：TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT7 terminator：TGC TAG TTA TTG CTC AGC GGT3：ATT AAC CCT CAC TAA AGG GApGEX-4T-5′：GGG CTG GCA AGC CAC GTT TGG TG pGEX-4T-3′：CCG GGA GCT GCA TGT GTC AGA GG GLp1：TGT ATC TTA TGG TAC TGT AAC TGGLp2：CTT TAT GTT TTT GGC GTC TTC CARVp3：CTA GCA AAA TAG GCT GTC CCRVp4：GAC GAT AGT CAT GCC CCG CGpcDNA3.1R：TAG AAG GCA CAG TCG AGGPinPoint primer：CGT GAC GCG GTG CAG GGC G pCMV-F：TCT AAA AGC TGC GGA ATT GTpCMV-R：TCCAAACTCATCAATGTATCpTRC99C-F: TTG CGC CGA CAT CAT AACpTRC99C-R: CTGCGTTCTGATTTAATCTGpCEP-F: AGA GCT CGT TTA GTG AAC CGEBV-R : GTG GTT TGT CCA AAC TCA TCpIRES2-EGFP.P5’: GTA GGC GTG TAC GGT GGG AG pIRES2-EGFP.P3’: AAC GCA CAC CGG CCT TAT TC3′AD: AGA TGG TGC ACG ATG CAC AGCMV -F：CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTGS1：CAA CGT GAA AAA ATT ATT ATT CGCS6：GTA AAT GAA TTT TCT GTA GTA GG5`AOX1：GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC3`AOX1：GCA AAT GGC ATT CTG ACA TCCα-Factor：TAC TAT TGC CAG CAT TGC TGCGAL4 AD：TAC CAC TAC AAT GGA TGpACT2-R：GTGCACGATGCACAGTTGAApB42ADF：CCA GCC TCT TGC TGA GTG GAG ATGpB42ADR：AAG CCG ACA ACC TTG ATT GGA GpEGFP-N-5’：TGG GAG GTC TAT ATA AGC AGA G pEGFP-N-3’：CGT CGC CGT CCA GCT CGA CCA G pEGFP-C-5’：CAT GGT CCT GCT GGA GTT CGT G pEGFP-C-3′ ：TAT GGC TGA TTA TGA TCA GTPBV220F：AAG AAG GGC AGC ATT CAA AGPBV220R：CTG CGT TCT GAT TTA ATC TGU6：ATG GAC TAT CAT ATG CTT ACC GTA2.0rev primer：AGG CGA TTA AGT TGG GTA3.0rev：GAG TTA GCT CAC TCA TTA GGCS.tag：GAA CGC CAG CAC ATG GAC5′TriplEx2：CTC CGA GAT CTG GAC GAG CRVP4：GAC GAT AGT CAT GCC CCG CGRVP3：CTA GCA AAA TAG GCT GTC CCpQE30-R：GTT CTG AGG TCA TTA CTG GpQE30-F：TGA GCG GAT AAC AAT TTC ACpEF-F：TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTCpDSRED-N1-R：TGA AGC GCA TGA ACT CCT TG pDsRED-express-C1-F：TCC CAC AAC GAG GAC TAC AC pCMV5R：ATT ATA GAG GAC ACC TAG TCpCMV5F：TTC CAA AAT GTC GTA ATA ACP5′：TGC GTA CTG CGG TGA TCA ACP3′：CTG CAA GGC GAT TAA GTT GGBAC2：ACG CAC AGA ATC TAG CGC TTBAC1：AAC CAT CTC GCA AAT AAA TA3′BD：TAA GAG TCA CTT TAA AAT TTG TAT AC pTarget.F：CCA GGA TTT TCC CAG TCA CpTarget.R：GGC TTT ACA CTT TAT GCT TCT7(17base)：ACA TCC ACT TTG CCT TTC TCpYes2.R：TCG GTT AGA GCG GAT GTGGAL4 BD：TCA TCG GAA GAG AGT AGpAS2-1.R：AAG AGT TAC TCA AGA ACA AGA ApFlag-CMV-F: GGT AGG CGT GTA CGG TGGpFlag-CMV-R: GCA CTG GAG TGG CAA CTTpIRES-F: CTT ACT GAC ATC CAC TTT GCpIRES.R: CAC TGC ATT CTA GTT GTG GTP1：CCA GGC TTT ACA CTT TAT GCP2：GCG ATT AAG TTG GGT AAC GCpLEXA-F：CGT CAG CAG AGC TTC ACC ATpLEXA-R：TAA AAC CTA AGA GTC ACT TTpLNCX-F：AGC TCG TTT AGT GAA CCG TCA GAT CG pLNCX-R：ACC TAC AGG TGG GGT CTT TCA TTC CC pLXSN-F：CTT GAA CCT CCT CGT TCG ACpLXSN-R：GTT GCT GAC TAA TTG AGA TGpSHUTTLE-CMV-F：GGT CTA TAT AAG CAG AGG TG pSHUTTLE-CMV-R：GTG GTA TGG CTG ATT ATG ATC AG MalE Primer：GGT CGT CAG ACT GTC GAT GAA GCC。

古菌通用引物测序
古菌是生活在极端环境中的微生物，与细菌和真核生物不同。

为了对古菌进行基因测序，通常需要使用古菌特有的引物进行PCR扩增。

以下是古菌通用引物的测序步骤：
1.准备样品：从极端环境中采集古菌样品，并使用适当的培养基进行培养。

或者，可以使用已分离的古菌DNA样品。

2.DNA提取：将古菌细胞从培养基中分离出来，并使用DNA提取试剂盒或
传统的酚-氯仿提取法提取DNA。

3.引物设计：根据古菌的基因组序列设计通用引物。

常用的古菌通用引物包
括16S rRNA基因的通用引物和古菌特异性引物。

4.PCR扩增：使用设计的引物和适当的PCR反应体系，在PCR仪中进行扩
增反应。

反应条件需要根据具体的引物和样品进行调整。

5.产物测序：将扩增产物送至测序公司进行测序。

测序方法可以采用传统的
Sanger测序或新一代测序技术。

6.数据分析：对测序结果进行质量控制和数据分析，包括序列拼接、物种鉴
定、基因注释等。

7.结果解释：根据数据分析结果，对古菌的种类、基因组结构和功能进行解
释和讨论。

需要注意的是，由于古菌的基因组结构和组成与细菌和真核生物存在较大差异，因此在测序和分析过程中可能需要进行一些特殊的处理和调整。

同时，由于古菌生活在极端环境中，其基因组中可能存在大量的稀有碱基和修饰碱基，这也需要在测序和分析过程中加以考虑和处理。