降解亚硝酸盐和生物胺乳杆菌筛选及其改善鱼肉香肠品质效果

第34卷 第15期 农 业 工 程 学 报 Vol.34 No.15 304 2018年 8月 Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering Aug. 2018

降解亚硝酸盐和生物胺乳杆菌筛选及其改善鱼肉香肠品质效果 许 女，李田田，贾瑞娟，张 浩，王如福※ （山西农业大学食品科学与工程学院，太谷030801）

摘 要：为了筛选出优良亚硝酸盐和生物胺的降解植物乳杆菌，并研究在鱼肉发酵香肠中的应用。该文主要考察了19 株植物乳杆菌亚硝酸盐和生物胺的降解活性及相关基因的携带情况，从中筛选出优良菌株，并研究其对鱼肉香肠发酵过程中各种亚硝胺、生物胺、腐败微生物的抑制作用和对其他理化指标的影响。试验结果表明，L. plantarum CP3对亚硝酸盐和生物胺的降解能力最强，分别达到95%和77%，PCR结果显示此菌株中含有亚硝酸盐降解（假定蛋白（hypothetical protein，HP）、谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）、一氧化还原酶（Oxidoreductase，ORD））和生物胺降解的相关基因（multicopper oxidases，suf I），且不含生物胺生成相关基因（hdc，tdc，odc）。GC-MS测定结果显示L. plantarum CP3对发酵香肠中4种亚硝胺-二乙基亚硝胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA），二甲基亚硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA），亚硝基吗啉（N-nitrosomorpholine，NMOR）和甲基乙基亚硝胺（N-nitrosomethylamine，NMEA）的生成都具有显著的抑制作用，联合接种L.saki M4可以协同提高亚硝胺的降解能力。并且，与对照组相比，接种L. plantarum CP3+L.saki M4的鱼肉香肠，发酵48 h后腐胺、尸胺和酪胺的含量分别降低了76.83%，93.33%和88%。另外，接种乳酸菌处理组香肠中的肠杆菌、假单胞菌等腐败菌及pH值、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）和挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）的含量显著低于对照组。该研究结果体现了L. plantarum CP3作为香肠等肉制品发酵剂的良好开发应用前景。 关键词：细菌；亚硝酸盐；胺；鱼肉发酵香肠 doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.15.038 中图分类号：TS251.1；Q939.9 文献标志码：A 文章编号：1002-6819(2018)-15-0304-09

许 女，李田田，贾瑞娟，张 浩，王如福. 降解亚硝酸盐和生物胺乳杆菌筛选及其改善鱼肉香肠品质效果[J]. 农业工程学报，2018，34(15)：304－312. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.15.038 http://www.tcsae.org Xu Nü, Li Tiantian, Jia Ruijuan, Zhang Hao, Wang Rufu. Selection of nitrite and bioamine-degrading bacteria and its improvement of fish sausage quality[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2018, 34(15): 304－312. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.15.038 http://www.tcsae.org

0 引 言 肉制品中的亚硝酸盐残留、亚硝胺和生物胺的产生成为重要的食品安全问题。目前对二者控制的方法主要有[1-2]：物理方法：超高压、辐照和气调控制（抑制生物

胺产生菌的生长和氨基酸脱羧酶的活性）；化学方法：植物提取物（姜、蒜、芦荟、茶多酚等）、抑菌剂（山梨酸钾、抗坏血酸、延胡索酸酯、葡萄糖酸内酯等）；生物方法：亚硝酸盐和生物胺降解菌发酵剂（植物乳杆菌、干酪乳杆菌、短乳杆菌、嗜酸乳杆菌、长膜明串珠菌、木糖葡萄球菌、解淀粉芽孢杆菌等）。相比物理和化学方法，降解菌发酵剂具有丰富协调产品风味、提升产品生理功能、延长产品保质期、有利于产品标准化等无可比拟的优势。 肉制品中的亚硝酸盐残基与胺生成致癌物质亚硝胺。乳酸菌发酵碳水化合物生成乳酸降低pH值，pH值

收稿日期：2018-04-09 修订日期：2018-06-21 基金项目：山西省科技重大专项项目（201703D211001-06-05）；山西省应用基础研究项目 (201701D221189) 作者简介：许 女，副教授，博士。主要从事传统发酵食品技术及农产品贮藏与加工研究。Email：xunv_2004@163.com ※通讯作者：王如福，教授，博士，博士生导师，主要从事农产品贮藏与加工研究。Email：wrf558@126.com

的降低有利于降解亚硝酸盐和抑制亚硝胺的生成[3]。另外，也有报道[4]称乳酸菌具有亚硝酸盐还原酶等一系列酶

降解亚硝酸盐。Chen等[5]将清酒乳杆菌、植物乳杆菌等

混合菌种应用于中国发酵干香肠中，产品在成熟期间亚硝酸盐的残留量和挥发性盐基氮的含量均有明显降低。Sun等[6]采用戊糖乳杆菌、弯曲乳杆菌和清酒乳杆菌混合

接种于中国哈尔滨红肠发酵中，与对照组相比，发酵成熟9天后亚硝胺的含量显著降低。关于生物胺，Bovercid等[7]采用包含清酒乳杆菌、木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌的

混合发酵剂显著降低了干发酵香肠中酪胺、尸胺和腐胺的含量。Tosukhowong等[8]报道植物乳杆菌可以显著降低

泰国发酵香肠中尸胺、腐胺、酪胺和组胺的含量。曾雪峰[9]发现接种了混合菌发酵剂的酸鱼在发酵过程中酪胺、

尸胺、腐胺的积累受到显著抑制。 综上所述，以往的研究存在以下问题：1）只是对降解能力表型进行了简单筛选，缺乏对相关降解基因分布的研究，另外，筛选出的优良目的菌株必须不含生物胺生成等相关潜在基因；2）亚硝胺和生物胺是发酵肉制品的重要食品安全问题，以往的报道中，只是进行单一的研究，并没有筛选出对二者同时具有降解作用，并且降解率高、降解种类多的优良菌株，并将其成功地应用在发酵肉制品的试验中。 本文主要考察了不同来源植物乳杆菌的亚硝酸盐和第15期 许 女等：降解亚硝酸盐和生物胺乳杆菌筛选及其改善鱼肉香肠品质效果 305

生物胺的降解活性及相关基因的分布情况，从中筛选出1株同时具有高效降解亚硝酸盐和生物胺活性的优良菌株，并将其应用在鱼肉发酵香肠中。为乳酸菌亚硝酸盐和生物胺的降解机理、基因工程育种进行初步的研究基础工作，对发酵肉制品的质量安全控制、营养功能提升都具有重要意义。

1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂 清酒乳杆菌L.saki M4（实验室前期研究筛选的优良肉品发酵剂菌株，具有较强的NaCl耐受性，产蛋白酶和细菌素的能力），植物乳杆菌，山西农业大学食品学院生物工程实验室保存。 细菌提基因组试剂盒，购自北京博迈德科技发展有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、10×聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）反应缓冲液、10×Loading Buffer，购自大连宝生物工程有限公司。二乙基亚硝胺（NDEA），二甲基亚硝胺（NDMA），甲基乙基亚硝胺（NMEA），N-亚硝基吗啉（NMOR）标准品，美国 Accustandard公司；各种生物胺标准品，美国 Sigma公司。 1.2 主要仪器与设备 Veriti PCR 扩增仪（温度精度为±0.25 ℃），美国 ABI 公司；电泳成套设备，美国 Bio-rad公司；凝胶成像系统，美国Alpha Innotech公司；台式高速冷冻离心机，美国Sigam公司；GENESYSTM5型分光光度计（波长精度为±0.5 nm），日本Spectronic公司；Trace1300气相色谱-TraceISQ质谱连用仪、戴安U3000液相色谱仪（波长精度为±0.1 nm），赛默飞世尔科技有限公司。 1.3 试验方法 1.3.1菌株降解亚硝酸盐能力的测定 参考文献[10-11]中乳酸菌降解亚硝酸盐的测定方法，并进行改良。将不同来源的植物乳杆菌菌株，于乳酸细菌培养基（deMan rogosa sharpe，MRS）中活化后，按3%接种量接种于100 mL含 0.1 mg/mL NaNO2的MRS液体培养基中，37℃培养，每隔24 h取样，采用盐酸萘乙二胺光度法于波长540 nm下测定培养液中亚硝酸盐的含量，不接菌的空白培养基吸光度为A0，样品吸光度为

AS，亚硝酸盐降解率如式 (1)：

00-100%SAAA亚硝酸钠降解率 （1）

1.3.2 菌株产亚硝酸盐还原酶的测定[12] 按照GENMED公司细菌亚硝酸盐还原酶总活性比色法定量检测试剂盒说明进行。即通过底物亚硝酸盐被催化产生氨或一氧化氮的同时，人工电子供体还原型甲基紫精氧化后呈现吸光峰值的变化，采用比色法来测定样品中亚硝酸盐还原酶总活性。 1.3.3 菌株降解生物胺能力的测定[13] 将不同来源的植物乳杆菌菌株，于MRS培养基中活化后，按3%接种量接种于200 mL MRS液体培养基中，37℃静置培养24 h，4℃、8 000 r/min离心10 min收集菌体，磷酸盐缓冲液洗涤2次后，将菌体重悬到含8种生物胺各100 mg/L的0.05 mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液中，

调整菌浓度为OD600=0.8，37℃静置培养24 h，以不接菌

的生物胺磷酸盐缓冲液作为空白对照组。8 000 r/min离心10 min收集上清液，采用Dns-Cl柱前衍生HPLC-FLD法测定上清液中各生物胺含量，计算降解率。 1.3.4 亚硝酸盐和生物胺降解及生成相关基因的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增 参考文献[12,14-15]等发表的引物序列，采用PCR方法

对亚硝酸盐还原酶疑似基因（HP、GR、ORD），生物胺生成相关基因（hdc-组氨酸脱羧酶，tdc-酪氨酸脱羧酶，odc-鸟氨酸脱羧酶）和生物胺降解基因suf I进行检测。 1.3.5 植物乳杆菌在鱼肉发酵香肠的应用 1）发酵剂制备 将L. plantarum CP3和 L.saki M4按3%接种量接种于200 mL MRS液体培养基中，37℃培养24 h，8 000 r/min离心10 min收集菌体，生理盐水洗涤后重悬，使菌体浓度达到1010 cfu/mL。