关桦楠-哈尔滨商业大学-基于纳米二氧化硅脂质体反应器的乙酰胆碱酯酶生物传感器的构建研究

基于纳米二氧化硅/脂质体反应器的乙酰胆碱酯酶生物传感器的构建研究关桦楠*姜加良陈丹丹王薇王艳辛嘉英（哈尔滨商业大学食品工程学院哈尔滨150076）摘要食品中农药的残留不仅对人类健康造成了极大危害，而且还严重制约了我国经济的发展。

研发出适用于常规食品中农药残留的高效快速成套的检测技术，有着重要的社会意义与实际需求。

本文首先利用脂质体技术构建乙酰胆碱酯酶的生物反应器，并采用层层自组装技术制备（纳米二氧化硅/乙酰胆碱酯酶生物反应器）可控多层膜，用以构建新型有机磷农药残留检测电流型生物传感器。

采用扫描电子显微镜获得乙酰胆碱酯酶酶生物反应器与多层酶膜的显微结构，利用电化学分析对新型生物传感器的检测性能进行测量。

实验结果表明，乙酰胆碱酯酶酶生物反应器呈球形且平均粒径为7.3±0.85 µm；生物传感器的多层酶膜的最佳层数为6个双层；以敌敌畏作为有机磷农药模型，在0.25-1.75 μmol/L 和 2.00-10.00 μmol/L的敌敌畏浓度区间内，响应电流与抑制率呈现良好的线性关系，最低检出限达到10 μg/L；所制备生物传感器具有良好的重现性和稳定性。

本研究将为食品中农药残留检测技术的改良提供一种新的思路。

关键词食品安全农药残留生物传感器二氧化硅脂质体Fabrication of acetylcholinesterase biosensor based on assembly of nano-SiO2 on to liposomebioreactorsHuanan Guan*Jialiang Jiang Dandan Chen Wei Wang Yan Wang Jiaying Xin（College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076）Abstract Pesticides residue in food not only had caused the enormous risks to the public health, moreover seriously had also restricted the economy in China.It was essential to develop a rapid and sensitive screening method to ascertain the presence of hazardous compounds for food safety. In this paper, acetylcholinesterase liposomes bioreactor (ALB) were prepared by encapsulating the enzyme AChE in L-α-phosphatidylcholine liposomes resulting in spherical bioreactor with a mean diameter of 7.3± 0.85 µm. A novel amperometric biosensor for organophosphate pesticides based on multilayer films containing SiO2and ALB was developed based on layer-by-layer. Micrographs of SiO2/ALB multilayer films were obtained by scanning electron microscope, and properties of the resulting biosensors were measured by electrochemical measurements. Among the resulting biosensors, the biosensor based on six bilayers of multilayer films was best. Based on the inhibition of organophosphate pesticides on the AChE activity, using dimethoate as a model compound, the inhibition of dimethoate was proportional to its concentration ranging from 0.25 to 1.75 and from 2.00 to 10.00 μM, with a detection limit of 10 μg/L estimated at a signal-to-noise ratio of 3. The developed biosensor exhibited good reproducibility and acceptable stability, thus providing a new promising tool for analysis of pesticide residue.Key words Food safety Pesticide residue Biosensor SiO2Liposomes农药残留检测是保障食品安全的基础，是监督管理的重要手段。

为了有效地保障食品安全，就必须对食品中的农药残留进行快速准确的分析监测[1]。

近年来，农药残留检测技术的开发一直是研究的热点，其中利用胆碱酯酶生物传感器检测农药残留的研究十分活跃。

胆碱酯酶通过催化底物水解生成电活性或光活性的物质，当有机磷和氨基甲酸酯类农药残留物加入后会与胆碱酯酶特异性结合，从而使得电活性或光活性物质的产量降低。

因此通过检测光作者简介：关桦楠，男，1983年生，博士，副教授，食品质量安全研究方向，E-mail: guanhuanan3@ 基金资助：黑龙江省教育厅科研项目(12531152)；国家自然科学基金资助项目(31201376)；或电信号的衰减即可推算出被检测的农药残留物的量[2-4]。

与此同时，将纳米材料作为固载酶的基底材料已成为当前生物传感器构建研究的热点方向之一[5]。

纳米二氧化硅(SiO2)是一种生物相容性良好的半导体材料，其微结构呈絮状和网状的无定形结构，以SiO2作为固载酶的基底物质可以大大提高酶的有效固载量[6-8]。

脂质体是一种在水相中由磷脂双分子层定向排列而成的直径几纳米至几十微米的超微粒子。

脂质体的内部水相可以包裹几乎任何标记物，脂质体表面也可以通过各种物理或化学方法修饰官能团[9,10]。

为了克服常见胆碱酯酶生物传感器酶活性差和精确度低的缺陷，本文拟采用脂质体技术仿造细胞结构，制备出一种类似于细胞的密闭式的球形生物反应器，并采用穿孔蛋白（Porin）在磷脂层上进行随机打孔，构造出反应物进出“细胞”的孔道，并以乙酰胆碱酯酶为核心元件构建出新型生物反应器，用于提高酶抑制反应时稳定性。

再采用层层自组装技术制备SiO2为基底物质的纳米多层酶膜修饰电极，集成电化学系统成功构建出一种新型的用于检测食品中农药残留的电化学酶生物传感器。

1 材料与方法1.1 材料与仪器乙酰胆碱酯酶（AChE）、Porin蛋白、壳聚糖（CS，脱乙酰度85%）、氯化硫代乙酰胆碱(ATChCl)、铁氰酸钾(K3[Fe(CN)6]) 、带负电荷的氢化大豆卵磷脂，胆固醇，荧光黄标记物购自于Sigma-Aldrich公司；碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)购自于Merck China公司；硅酸钠（分析纯）和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)购自于国药集团化学试剂有限公司；敌敌畏标准品生产于北京恒信生物技术公司（货号：BW7022）。

1.2 乙酰胆碱酯酶生物反应器的制备精确称取处方量卵磷脂、胆固醇、AChE溶液、荧光黄标记液以及吐温20共溶于10 mL 的二氯甲烷中，所得溶液置于茄形瓶中，于旋转蒸发仪上37°C减压蒸馏，烧瓶转速50-200 rpm。

待烧瓶中二氯甲烷去除干净且在烧瓶壁上形成均匀透明的薄膜后，加入5%的葡萄糖溶液5 mL，继续旋转30 min，使薄膜溶胀水和完全。

悬浮液过滤去杂质，将滤液置于液氮当中1 min，待冷冻完全后迅速放入37°C的水浴锅内，待完全融化后再次放入液氮中冷冻，如此冻融一定数量的循环次数。

冻融结束后，室温驯化10 min，于4°C下保存待用。

1.3 纳米二氧化硅的制备室温条件下，在搅拌状态进行中(150 rpm)，向20 mL浓度为 1 mol/L的硅酸钠溶液中加入0.1 g CTAB，再加入10 mL（10%，V乙醇/V反应液，V/V）的无水乙醇，然后加入提前配制好的硫酸稀释溶液，充分混合后调节pH值为5，恒温陈化1 h。

以上实验操作在超声波震荡的条件下完成。

将沉淀抽滤，用去离子水清洗至体系中没有酸根离子（滤液不与BaCl2形成白色沉淀时为止），将过滤物干燥，并用马弗炉煅烧，获得纳米二氧化硅颗粒。

1.4 酶纳米传感器的构建将电极置于壳聚糖溶液中，与恒电位-3.0 V的条件下，静电沉积2 min，在表面形成一层带有正电荷的壳聚糖膜，使用去离子水清洗电极探头表面2遍，去除未沉积的壳聚糖。

然后，将电极再置于纳米氧化硅（SiO2）的水分散液中，静电吸附2 min，再将电极重新放置于壳聚糖溶液中，静电吸附2 min，清洗两次。

放置于5 mg/mL的AChE脂质体生物反应器（ALB）的稀释液中，静电吸附2 min，使用去离子水清洗电极探头表面2遍，去除未被吸附的脂质体生物反应器，此为一个双层，即(ALB/SiO2)1。

通过实验的循环操作，可以根据实验要求实现多层膜的制备。

将吸附有多层膜的滤膜片固定于玻碳电极表面，这种修饰电极被定义为GCE-(ALB/SiO2)n。

1.5 表征利用激光散射粒度仪测定AChE脂质体生物反应器和纳米二氧化硅的粒径及分布；利用Zeta电位仪测定AChE脂质体生物反应器和纳米氧化硅的表面电位。

采用扫描电子显微镜对传感器形貌、大小以及整体分布进行测定。

1.6 电化学检测电极预处理后，将吸附有不同层数酶膜的滤膜片固定于玻碳电极表面置于10 mL的pH 为7.6的磷酸缓冲液（PBS）中，利用循环伏安法对电极进行2次线性伏安扫描，待结果稳定后开始下一步实验。

向反应池中缓慢加入浓度为1 mM的ATChCl底物溶液1 mL，测定不同修饰层数的GCE-(ALB/SiO2)n 电流响应特性，以确定n的合适数值。