中枢神经系统疾病的基因治疗

基因治疗(genetherapy)是向功能缺陷或病变的细胞及组织引入互补的正常基因或治疗性功能基因,使其表达而达到治疗疾病的方法。

中枢神经系统(centralnervoussystem,CNS)作为一个高度独立化器官,因其独特的生理特征及细胞之间相互作用的复杂性,不易进行基因操作。

近年来,由于神经遗传学研究的进展、CNS疾病发病机制的进一步阐明、导入外源性基因载体的改进及其基因转移技术的进步,使基因介导CNS疾病的治疗越来越趋近现实,CNS作为基因治疗的靶器官正逐步实现[1]。

1CNS疾病基因治疗的方法和途径111exvivo途径exvivo 途径即体外细胞介导法,通过移植携带靶基因的工程细胞完成,是基因转移技术和脑内移植技术的结合。

首先将目的基因转入体外培养的靶细胞内,进行筛选、鉴定后,行体外扩增,然后将其移植入脑内治疗靶区,使其在脑内充当分泌营养因子、神经递质和代谢酶等基因产物的生物学“微泵”(minipump),此细胞称为基因修饰细胞或工程细胞。

这种方法比较经典、安全,效果较易控制,但是存在操作步骤多、技术复杂、难度大及若采用人类胚胎细胞则涉及伦理学问题,故不易推广。

exvivo途径中靶细胞的筛选是至关重要的,既要易于获得、容易转染及稳定表达,又要避免发生免疫反应。

应遵循以下原则:①基因转导的细胞必须能长期在宿主脑内存活,且无侵袭性;②修饰后的靶细胞应具有稳定表达治疗性产物的能力;③可体外控制治疗性产物有效、适量的表达;④能预设某一安全机制,在必要时可激活以阻止修饰细胞在体内有害的生长和Π或有害功能的发挥,以避免肿瘤发生。

目前,应用于CNS基因治疗研究的靶细胞主要有成纤维细胞、原代骨骼肌细胞、胶质细胞、胚胎中脑细胞、条件永生性神经细胞(conditionallyimmortal2izedneuralcell)及神经干细胞。

112invivo途径invivo途径即体内直接转染法,是体内基因治疗的直接途径。

包括:①非病毒介导途径即通过物理法、化学法或融合法直接将目的基因导入体内。

具有安全、操作简单、插入容量不受限制及可通过物理方法实现靶向性转移(如基因枪)等优点。

但是直接导入的DNA通常难以整合入基因组,基因表达存在不稳定性,且在非分裂细胞中基因的转染效率不高,使其应用受到限制。

②病毒载体介导途径即通过构建复制缺陷的重组病毒将靶基因引入体内。

迄今为止,病毒载体用于CNS细胞基因传递取得了许多进展,尽管其安全性及效率仍有待提高,但invivo方法已成为目前CNS基因转移的主要研究方向,只有invivo方法取得成功,CNS基因治疗才能走向临床。

2CNS基因治疗的病毒载体211RNA病毒载体21111逆转录病毒载体:逆转录病毒载体是目前研究最成熟的一类RNA病毒载体。

常用的逆转录病毒载体主要来自Moloney小鼠白血病病毒。

它具有以下优点:宿主范围广,能感染包括胶质细胞、神经前体细胞在内的各种分裂细胞,感染效率高;在正常生理状态下可以单拷贝的形式整合入宿主细胞基因组,并随宿主细胞的分裂而增殖;病毒与细胞结合后,病毒表面的糖蛋白即结合于细胞表面的受体,故细胞不会被同种病毒重复感染。

但仍存在一些令人担忧的问题,如病毒基因组在宿主细胞染色体上的随机整合可能引起插入突变;载体在辅助细胞中有可能发生同源重组,产生具有致瘤性的野生型病毒;此外逆转录病毒载体不能感染分裂后细胞,故不能直接用于神经细胞的转导。

21112慢病毒载体:慢病毒(lentivirus)属逆转录病毒亚属,是一类非鼠源性逆转录病毒,以人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)为代表。

慢病毒源性载体(lentivirus2basedvector,LV)最主要的优点是它能将外源基因整合入非分裂细胞的基因组内,对有丝分裂后神经元转基因治疗提供了一个潜在的传递系统。

但其严格的宿主范围、滴度低及HIV21独特的致病性,限制了它作为转基因载体的应用。

为了最大限度降低其通过重组产生有复制能力野生病毒的可能性,重组病毒的产生采用三质粒包装系统,为了进一步增强这一系统的安全性,一种自我失活(self2inactivating,SIN)慢病毒载体最近已被构建成功。

应用LV向脑内引入基因已取得了诱人的结果,转染细胞(主要为神经元)在所有时间点上均明显高于腺相关病毒载体和逆转录病毒载体,而且这种载体存在长期的转基因表达,无明显免疫反应。

因此LV有可能成为未来CNS 基因治疗的最佳载体[2,3]212DNA病毒载体21211单纯疱疹病毒载体:I型单纯疱疹病毒(herpessimplexvirustype1,HSV21)含有152kb双链DNA,基因组包含80个以上基因。

HSV来源载体有重组子载体(HSV2RV)和扩增子载体两大类型。

HSV2RV含有全部病毒基因组,其中一个或多个基因已突变,以降低其毒性和提供转基因空间。

最新版本HSV2RV删除了多个含转录激活因子的即刻早期基因,基本消除了病毒基因的表达。

HSV扩增子载体由一个含有HSVDNA复制起点序列oris和包装信号pac的质粒组成。

在HSV辅助病毒作用下被允许以串联体形式包装入HSV病毒,无HSV辅助病毒时,这些载体可以通过与一组已删除HSV基因组保留pac信号序列的粘粒或BAC质粒共转染而得到包装。

这些载体的优点有:基本上无毒性或免疫原性;较大的转基因容量,通常可达22kb,最大可达150kb;相当高的滴度;对神经细胞的高度感染性,在非分裂细胞中潜伏达数月。

此外,HSV载体感染神经元时,可沿着神经元突起向其胞体快速逆向运输,故可提供一种间接的靶向性基因转移途径。

但HSV存在神经细胞毒性作用和免疫反应,可引起较明显的局部炎症和坏死,故HSV作为CNS转基因载体还有待于进一步研究和改进。

21212腺病毒载体:腺病毒(adenovirus,Ad)是目前被较广泛使用的一类DNA病毒载体,其基因组长约36kb,从左至右可分为4个基因功能区即E12E4区。

第一代复制缺陷型Ad因存在较强的宿主免疫反应,使其应用受到限制。

改进后的新型Ad载体删除了表达病毒蛋白的E2a和E4基因或E4基因上特殊的开放性阅读框,故具有长期的转基因表达和较低的炎症反应。

最近产生了一种“无内核”(gutless)、高容量的Ad载体,删除了病毒基因组所有的结构基因,仅保留了复制和包装的必需序列。

这种“无内核”Ad载体具有转基因容量大、滴度高、宿主范围广,可感染分裂和非分裂细胞、感染效率高、无野生腺病毒污染等优点,在体研究已显示其长期的转基因表达活性和较低的宿主炎症反应。

其另一个特点是具有随机整合人类或非人类染色体的能力,但整合效率较低,多数仍以附加子形式存在,而且已整合的载体序列容易发生重新组合。

21213腺相关病毒载体:腺相关病毒(adeno2asso2ciatedvirus,AA V)是一种缺陷型非病原性人类细小病毒,是目前发现的最小、结构最简单的DNA病毒,含有一条线状单链DNA,其复制依赖于辅助病毒(腺病毒或单纯疱疹病毒)。

野生型AA V能选择性整合入人类19号染色体的特定部位,建立溶源性感染。

与其它基因载体系统相比较,AA V载体的主要优点有:①它是一种非病原性的人类病毒,与人类疾病无关,②AA V能感染的细胞类型范围较广,可感染分裂后细胞,转染效率极高;③载体中仅保存AA V的ITRs,而ITRs基本上又是转录中性的,不干扰外源基因的表达和调控;④rAA V缺乏病毒基因,对超感染没有免疫原性,故可以向同一细胞引入两种不同的基因,或对同一细胞反复感染;⑤转基因可获得长期稳定的表达。

新的包装技术已明显提高rAA V载体滴度,而且可排除辅助腺病毒的污染[4]。

此外,可调控基因表达载体及针对不同细胞的靶向性载体的成功开发,使其应用前景更加广泛。

213杂交型病毒载体由于目前的病毒载体系统不能自主复制,无法达到稳定的CNS转基因表达,而反复向脑内注射载体会给患者带来较高的危险。

为了使CNS转基因获得长期、稳定的表达,根据现有病毒载体的优点,将其不同的病毒元件组合而产生的杂交型病毒载体,目前正在研究、开发,主要包括HSVΠAA V杂交型扩增子载体、AdΠEBV和HSVΠEBVΠ逆病毒杂交型扩增子载体、AdΠAA V杂交型载体、AdΠ逆病毒杂交型载体等几种类型。

不同载体系统优缺点的客观比较少见文献报道,目前尚没有一种载体可以作为所有疾病类型转基因研究的通用工具,而且在以后的数年内也不可能出现这种万能的载体。

在现阶段Ad仍可能是以短期表达为治疗目标invivo途径基因研究最合适的载体,特别是那些单次剂量就能达到临床治疗效果的方案。

如能实现Ad靶向性细胞摄取及表达,降低免疫原性,无疑将扩展其用途,但不适合慢性疾病的长期治疗。

在未来的几年里,AA V可能是功能缺陷蛋白长期替代治疗最常用的载体[5]。

3CNS疾病基因治疗概况许多实验动物模型已应用于CNS疾病基因治疗研究,包括神经系统遗传病、神经退变性疾病、脑缺血、脑创伤及脑肿瘤等。

这些模型均可通过药物诱导或损伤诱发,脑肿瘤模型可通过体外培养的肿瘤细胞移植动物脑内而产生。

随着许多神经系统疾病致病基因的明确,应用转基因小鼠复制具有人类疾病相同遗传病因的转基因动物模型已成为现实。

CNS疾病的基因治疗主要有三种策略:①应用反义技术或核酶降低非显性突变蛋白的活性。

针对CNS疾病基因缺陷引起的非显性突变蛋白表达,需要选择性阻断其生物合成,可采取反义核苷酸技术或核酶,阻断特异性mRNA 转录而达到。

②应用转基因产物替代脑内缺陷的酶或功能蛋白。

③应用保护性蛋白对神经元的存活提供支持,包括营养因子、抗氧化酶、热休克蛋白和抗凋亡因子等[6,7]。

311遗传性神经疾病31111Huntington病:Huntington病(Huntington’sdisease,HD)是一种以基底节和大脑皮层变性为主要病变的常染色体显性遗传病,主要临床特征是慢性进展性舞蹈样动作和痴呆。

目前研究表明HD与IT15基因的单一型突变有关,Huntington蛋白中的多聚谷氨酰胺纤维大量增加,使纹状体GABA能输出神经元细胞群对兴奋性毒性、氧化应激和线粒体功能障碍的敏感性增加。

几种HD基因治疗方案已分别在DNA、RNA和蛋白水平上探索,包括移植能分泌保护或替代因子的工程细胞,例如产生神经生长因子(NGF)的成纤维细胞或神经前体细胞。

Bemelmans等[8]将克隆脑源性神经生长因子(BD2NF)基因的Ad注射至Huntington病模型鼠的纹状体内,发现BDNF的存在能促进纹状体神经元的存活。

31112溶酶体蓄积病:溶酶体蓄积病(lysosomalstoragedisease,LSD)是一种以溶酶体酶缺陷为特征的非显性遗传病。