水飞蓟素对大鼠急性酒精性肝损伤的保护作用_陈世林

水飞蓟素对大鼠急性酒精性肝损伤的保护作用陈世林,洪汝涛,刁 磊,阮海玲,徐 娟,梅 俏2009-10-16接收作者单位:安徽医科大学第一附属医院消化内科,合肥 230022作者简介:陈世林,男,硕士研究生;洪汝涛,男,教授,主任医师,硕士生导师,责任作者,E m ai :l hongrutao888@yahoo .co m摘要 目的 探讨水飞蓟素对大鼠急性酒精性肝损伤的保护作用及其作用机制。

方法 32只雄性SD 大鼠被随机分为4组,以乙醇灌胃法建立大鼠急性酒精性肝损伤模型,检测血清谷丙转氨酶(ALT )、谷草转氨酶(A ST )、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG )和肝匀浆超氧化物歧化酶(S OD )、丙二醛(M DA )含量,观察肝脏病理形态学改变,并测定肝组织中TN F 和I L 1 表达。

结果 与模型对照组比较,水飞蓟素各剂量组肝脏脂肪变性明显减轻,血清ALT 活性、肝匀浆M DA 水平明显降低(P <0 01和P <0 05),SOD 活性升高(P <0 05),肝组织中TNF 和I L 1 表达明显减少(P <0 01),水飞蓟素高剂量组血清A ST 活性也明显降低(P <0 05)。

结论 水飞蓟素对大鼠急性乙醇所致肝损伤具有保护作用。

主题词 水飞蓟素;氧化性应激;肝疾病,酒精性中图分类号 R 575;R 979 9文献标识码A 文章编号1000-1492(2010)02-0209-04大量乙醇摄入会使肝脏受到不同程度的损伤,尤其是短期内大量酗酒可引起肝脏严重损伤,目前临床上对于酒精性肝损伤的治疗还不十分理想,对于药物的确切作用机制也还不十分明确。

因此,开发对急性酒精性肝损伤,尤其是暴发型酒精性肝损伤具有保护作用的药物非常重要。

水飞蓟素(Sily m arin)是从菊科植物水飞蓟种子中提出的黄酮类天然化合物,其主要成分为水飞蓟宾(Silyb i n )、异水飞蓟宾(Isosil y bin)、水飞蓟宁(S ilyd i a n i n )等。

水飞蓟素具有消除自由基、抑制活性氧自由基活性、抗氧化应激等作用,并具有稳定肝细胞膜、保护肝细胞酶系统和提高肝脏解毒功能等生物活性[1-2]。

水飞蓟素具有较广泛的药理学特性,已发现其可能有抗酒精性肝损害的作用,但目前对急性酒精性肝损伤相关报道仍较少见,且其具体作用机制尚不明确。

本研究以急性酒精性肝损伤大鼠为模型,观察该药对急性酒精性肝损伤的保护作用,并进一步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法1.1 主要药物、试剂 水飞蓟素(商品名利加隆,每粒含140m g 水飞蓟素)为德国马博士大药厂生产,使用前根据剂量将胶囊内粉末状药品分别用蒸馏水稀释成10m g /m l 和20m g /m l 。

乙醇(分析纯)购自上海中试化工总公司,使用前用蒸馏水配成60%的体积分数。

丙二醛(MDA )、超氧化物歧化酶(SOD )检测试剂盒及考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

兔抗鼠I L 1 多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司,兔抗鼠TNF 多克隆抗体、羊抗兔Ig G 二抗试剂盒、DAB 显色剂均购自武汉博士德生物工程有限公司,内源性生物素阻断试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。

1.2 试验动物 SD 雄性大鼠32只(普通级)购自安徽省试验动物中心,体重(200 20)g ,标准环境适应性饲养1周,给予正常饮食。

1.3 方法 32只大鼠随机分为4组:正常对照组、模型对照组、水飞蓟素低剂量组和高剂量组,每组8只。

各组每日灌胃前禁食6h ,除正常组等量以生理盐水灌胃外,其余各组均以乙醇灌胃,5g /kg ,连续5d(1次/d),水飞蓟素各剂量组在乙醇灌胃1h 后再给予水飞蓟素100m g /kg 和200m g /kg 灌胃,在末次乙醇灌胃并禁食6h 后将全部大鼠麻醉并处死,腹主动脉取血,送生化实验室,瑞士Roche M odu lar DPP 全自动生化分析仪测定大鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆固醇(TC )、甘油三酯(TG )水平。

取肝右叶约1g 肝组织液氮下保存,并制10%肝匀浆测定SOD 、MDA 。

取肝左叶相同部位,用10%中性甲醛固定,石蜡包埋,H E 染色后于光学显微镜下观察肝组织病理学改变,并依据酒精性肝病诊疗指南,评估肝脏的脂肪变性程度,评估标准为:F0<5%肝细胞脂肪变;F15%~30%肝细胞脂肪变;F230%~50%肝细胞脂肪变性;F350%~75%肝细胞脂肪变;F4>75%肝细胞脂肪变。

免疫组化(SABC)法测定肝组织中TNF 和I L 1 表达,以细胞内有明显黄色/棕黄色颗粒判定为阳性细胞。

平均光密度(OD)测量:在N i k on Ec lipse 8ic 显微镜下,每张切片随机选取5个不连续视野( 400),用N i k on D i g ital ca m era摄像并保存待测量图片,I m age Pro P l u s6 0图像分析系统测OD值,取每张切片平均OD值作为每张切片测量值。

1.4 统计学处理 采用SPSS11 5统计软件处理,试验数据用 x s表示,计量资料采用单因素方差分析,两组间比较采用LSD方法检验。

等级资料差异性测定采用秩和检验进行统计学处理。

2 结果2.1 水飞蓟素对酒精性肝损伤大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平的影响 与正常对照组比较,模型对照组血清中ALT、AST活性明显增高,TC、TG 增高不明显。

与模型对照组比较,水飞蓟素各剂量组均使ALT活性显著降低,水飞蓟高剂量组AST活性明显降低,水飞蓟素各剂量组对TC、TG无明显影响。

见表1。

表1 水飞蓟素对大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平的影响(n=8, x s)组别A LT(U/L)A S T(U/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)正常对照63.12 13.40146.12 27.341.69 0.390.41 0.17模型对照81.00 15.84 196.37 31.33 1.73 0.170.43 0.35水飞蓟素(mg/kg)10046.63 6.57 164.00 33.221.68 0.390.96 0.4620048.89 14.89 143.00 34.54 1.72 0.250.65 0.26与正常对照组比较: P<0 05, P<0 01;与模型对照组比较: P<0 012.2 水飞蓟素对酒精性肝损伤大鼠肝匀浆MDA、S OD含量的影响 与正常对照组比较,模型对照组肝组织匀浆中MDA含量显著增高;与模型对照组比较,水飞蓟素各剂量组均使肝组织匀浆中MDA 含量降低,SOD活性升高。

见表2。

表2 水飞蓟素对大鼠肝匀浆MDA、S OD含量的的影响(n=8, x s)组 别M DA(nm ol/m g prot)SOD(U/mg prot)正常对照 2.24 0.70116.58 18.36模型对照 3.63 0.40 90.61 23.20水飞蓟素(m g/kg)100 2.63 1.12 123.12 32.77200 2.46 1.07 128.40 31.09与正常对照组比较: P<0 01;与模型对照组比较: P< 0 05, P<0 012.3 水飞蓟素对酒精性肝损伤大鼠肝脏病理组织学变化的影响 肉眼观察可见正常对照组大鼠肝脏色泽正常,肝被膜有光泽,腹腔肠管间无粘连。

模型对照组大鼠肝脏色泽略变黄,腹腔肠管间可有肠管轻度粘连。

水飞蓟素各剂量组大鼠肝脏肉眼观察与正常对照组比较无统计学意义(P>0 05)。

光镜下可见正常对照组肝小叶结构清晰,肝细胞索排列整齐,肝小叶内偶见脂肪变性的肝细胞,肝细胞无坏死,无炎症细胞浸润,整个肝脏无明显病理改变。

模型对照组肝细胞可见明显脂肪变性,肝细胞肿胀明显,胞质内出现弥漫性的圆形脂滴,肝小叶界限模糊,肝小叶内散见肝细胞点状坏死,汇管区可见炎症细胞浸润。

与模型对照组比较,水飞蓟素各剂量组肝细胞肿胀显著减轻,脂肪变性、炎症细胞浸润及坏死程度均降低,肝组织病理变化程度明显减轻。

见表3、图1。

表3 水飞蓟素对大鼠肝脏组织病理学变化的影响(n=8)组 别肝细胞脂变程度分度F0F1F2F3F4z值P值*正常对照71000 3.548<0.01模型对照00341-水飞蓟素(m g/kg)10002510 2.227<0.05 20003410 2.348<0.05 *与模型对照组比较2.4 水飞蓟素对酒精性肝损伤大鼠肝组织中TNF 和I L 1 表达的影响 肝细胞内可见黄色/棕黄色颗粒沉着,间质着色,主要分布于中央静脉周围及部分肝小叶内。

与正常对照组比较,模型对照组中央静脉周围及部分肝小叶内可见大量棕黄色颗粒沉着,且TNF 和I L 1 OD值较正常对照组明显升高。

与模型对照组比较,水飞蓟素各剂量组中央静脉周围及肝小叶内黄色/棕黄色颗粒明显减少,且TNF 和I L 1 OD值较模型对照比较明显降低。

见表4和图2、3。

表4 水飞蓟素对大鼠肝组织中T NF 和I L 1 表达的影响(n=8,OD, x s)组 别TNF I L 1正常对照0.193 0.0320.147 0.014模型对照0.263 0.018 0.228 0.019水飞蓟素(m g/kg)1000.223 0.016 0.202 0.0172000.208 0.011 0.183 0.017与正常对照组比较: P<0 01;与模型对照组比较: P< 0 01图1 大鼠肝脏病理变化 HE 400 A:模型对照组;B:飞蓟素低剂量组;C:水飞蓟素高剂量组 图2 TNF 的表达 SABC 400 A:模型对照组;B:水飞蓟素低剂量组;C:水飞蓟素高剂量组 图3 I L 1 的表达 SABC 400 A:模型对照组;B:水飞蓟素低剂量组; C:水飞蓟素高剂量组3 讨论水飞蓟素临床上常用于治疗肝炎、肝硬化等疾病,且临床使用未见明显的副反应,其对CC l4和氨基半乳糖(D G al n)所致的实验性肝损伤模型小鼠,也具有明显保护作用[3-4],但其对急性酒精性肝损伤的保护作用目前研究不多,且具体作用机制也尚不明确。

本试验依据酒精性肝损伤的生化和病理特征,在禁食与乙醇灌胃同时使用的基础上成功建立了大鼠急性酒精性肝损伤模型并研究水飞蓟素对肝损伤的保护作用,初步探讨其可能的作用机制。

大量乙醇摄入可导致肝脏脂质过氧化增加,肝细胞膜脂质过氧化反应可导致肝细胞损伤。

同时,大量乙醇进入机体后,被进一步脱氢氧化为乙醛和乙酸盐,使三羧酸循环障碍和脂肪酸氧化减弱而影响脂肪代谢,乙醛又能和细胞内大分子物质如蛋白质反应形成复合物,导致肝细胞空泡变性[5]。