不同降温速度对保存的角膜内皮细胞活性的影响

眼科研究２００７年５月第２５卷第５期　・实验研究・　不同降温速度对保存的角膜内皮细胞活性的影响　

贾艳红　王丽娅杜连心　赵承彦　Ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｏｆ　ｃｏｒｎｅａ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｊｉａ　Ｙａｎｈｏｎｇ，Ｗａｎｇ　Ｌｉｙａ，Ｄｕ　Ｌｉａｎｘｉｎ，Ｚｈａｏ　Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ　４５０００３，Ｃｈｉｎａ　

ｃｅｌｌ　ｖｉａ　ｌｏｎｇ・ｔｅｒｍ　ｃｒｙ０ｐｒｅｓｅｒＶａｔｉ０ｎ　Ｃｈｅｎｇｙａｎ．Ｈｅｎａｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，　

３４３　

Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｃｏｒｎｅａ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ　ｂｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｏｆ　ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１５０　ｒａｂｂｉｔ　ｃｏｒｎｅａｓ　ｗｅｒｅ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ，ａｎｄ　１４７　ｃｏｒｎｅａｓ　ｉｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　ｓｕｂｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　４９　ｇｒｏｕｐｓ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆｒｏｚｅｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．Ｆｏｕｒ　ｖｉａｌｓ　ｏｆ　ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　Ｄｒｅｐａｒｅｄ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｂｕｔｔｏｎｓ　ｗｉｔｈ　ａ　１—２　ｍｍ　ｓｅｌｅｒａ　ｒｉｍ　ｗｅｒｅ　ｓｏａｋｅｄ　ｉｎ　ａｂｏｖｅ　ｆｏｕｒ　ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ　ｆ０ｒ　１０　ｍｉｎ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｆｒｅｅｚｅｒ．Ｔｈｅ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｂｕｔｔｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｆｒｏｚｅｎ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ－　ｒａｔｅｄ　ｆｒｅｅｚｅｒ　ｔｏ一８０℃．ａｎｄ　ｗｅｒｅ　ｓｔｏｒｅｄ　ｉｎ　ｌｉｑｕｉｄ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ．Ｏｎｅ　ｍｏｎｔｈ　ｌａｔｅｒ，ｔｈｅ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｂｕｔｔｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｔｈａｗｅｄ　ｉｎ　ｗａｔｅｒ　ｂａｔｈ，ａｎｄ　ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｒｅｍｏｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｖｉａｌ　ｏｆ　ｃｏｒｎｅａ．Ｔｈｅ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｂｕｔｔｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｅｌｕｔｅｄ　ｉｎ　ＤＭＳＯ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　２５％ＦＢＳ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ．　Ｃｏｒｎｅａｌ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ　ｗａｓ　ｄｕａｌ　ｓｔａｉｎｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ａ　０．２５％ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｒｙｐａｎｅ　ｂｌｕｅ　ａｎｄ　０．４％ｓｔｏｃｋ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｌｉｚａｒｉｎ　ｒｅｄ　Ｓ（ｐｈ４．２）．　２．５％ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｆｉｘ　ｅａｃｈ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｂｕｔｔｏｎｓ　ｆｏｒ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｌｏｗｉｎｇ－　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　２．０℃／ｍｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｐｈａｓｅ　ａｎｄ　５．０℃／ｍｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｅｃｏｎｄ　ｐｈａｓｅ．ａｄｕｍｂｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ｒｅｄ　ｓｔａｉｎｉｎｇ，ａｎｄ　ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ　ｔｉｇｈｔ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ．Ｎｏ　ｂｌｕｅ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｅｎ．Ｃｏｒｎｅａｌ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ　ｃｅｌｌｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｏｖｅｒ　７５％　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ．Ｂｕｔ　ｉｎ　ｏｔｈｅｒ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，ａｄｕｍｂｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｓｈｏｗｅｄ　ｒｅｄ　ｃｏｌｏｒ　ａｎｄ　ｒｏｕｎｄ　ｉｎ　ｓｈａｐｅ，ａｎｄ　ｍａｎｙ　ｂｌｕｅ－ｓｔａｉｎｅｄ　ｎｕｃｌｅｕｓ，ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ　ｏｆ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ａｎｄ　ｎａｋｅｄ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ｗｅｒｅ　ｆｏｕｎｄ．Ａ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｉｎ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｅｄ．ｃｏｒｎｅａｌ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　２．０℃／ｍｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｐｈａｓｅ　ａｎｄ　５．０℃／ｍｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｅｃｏｎｄ　ｐｈａｓｅ　ｉｎ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｏｗｉｎｇ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｖｅｌｏｃｉｔｙ　ｆ尸＜０．０５）．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｌｏｗｉｎｇ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｖｅｌｏｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｐｈａｓｅｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ　ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ａｆｆｅｃｔ　ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｏｆ　ｃｏｒｎｅａ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌ１．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ｃｏｒｎｅａｌ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ；ｌｏｗｉｎｇ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ；　ｃｒｙ。ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉ０ｎ　

摘要　目的　通过调节程序控制降温仪的降温速度保存兔角膜，以提高保存角膜的内皮细胞的存活率（ＥＳＲ）。　方法供体角膜１５０只随机分为对照组和实验组。对照组不做冷冻处理；实验组冷冻１４７只角膜，带巩膜缘１～２　ｍｍ的　角膜片分别在４种不同浓度梯度的冻存液中预处理各１０　ｍｉｎ，再经过两个阶段（０～一１８℃，一１８～一８０℃）４９种不同程　序逐步降温至一８０℃，最后放人液氮中保存。１个月后水浴复苏供体角膜，洗脱冻存液、染色、同定，行镜下形态学观察　并计算角膜内皮细胞存活率。　结果镜下观察第一阶段降温速度为２℃／ｍｉｎ、第二阶段降温速度为５℃／ｍｉｎ时的方法　较好，计数细胞的存活率达到７５％以上，与其他不同速度下比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。　结论　不同阶段不同　降温速度下，深低温保存兔角膜对角膜的内皮细胞存活率有明显影响。　关键词　角膜内皮细胞；降温程序；深低温保存　分类号　Ｒ　７７２　文献标识码Ａ　文章编号１００３—０８０８（２００７）０５－０３４３－０４　

在致盲性眼病中，角膜病居首位…，而感染性角　膜炎是我国角膜病中的主要致盲性眼病之一。角膜移　植术是角膜肓复明治疗的主要手段，手术成功与否　有赖于供体角膜的质量，而供体材料优劣的关键在于　本课题为河南省省属科研机构研究开发专项资金资助（０６４１　１３０３１０）　作者单位：４５０００３郑州，河南省眼科研究所（贾艳红，郑州大学医学　院在读研究生）　通讯作者：王丽娅（Ｅｍａｉｌ：ｌｉｙａｗａｎｇ５５＠１２６．ｃｏｎ）　保存的技术。截至目前唯有深低温保存的角膜材料优　良、保存期限长、细胞活性接近新鲜角膜，用于穿透角　膜移植术后透明率与新鲜角膜相仿　。此方法能随　时为临床提供高质量的角膜移植材料，为ＨＬＡ组织配　型创造有利的条件，是眼库长期保存角膜的理想方法　之一　ｊ。本实验通过对不同阶段的降温速度的探索，　希望找到最佳的降温速度。　

维普资讯 http://www.cqvip.com １材料与方法　１．１　材料　１．１．１　实验动物　选用清洁级新西兰兔７５只，体重　２．５～３．０　ｋｇ，雌雄不限，由郑州大学动物实验中心提　供，实验前于裂隙灯下检查双眼均正常。　１．１．２　主要仪器与试剂　程序控制降温仪（Ｋｒｙｏ，　３２０—１—７　ＵＳＡ），光学显微镜（ＯＬＹＭＰＵＳ　ＣＸ２１　ＦＳ１），相　差显微镜（ＯＬＹＭＰＵＳ　１×７０一ＳＢＦ２型）。胎牛血清　（ＦＢＳ）由杭州四季青生物工程材料有限公司提供，二　甲基亚砜（ＤＭＳＯ）由北京化工厂提供，其余均为国产　分析纯试剂。　１．２方法　１．２．１　分组　分别配置组１（体积分数分别为ＦＢＳ　２０％、ＤＭＳＯ　２％、Ｓｕｃｒｏｓｅ　２．５％）、组２（体积分数分别　为ＦＢＳ　２０％、ＤＭＳＯ　４％、Ｓｕｃｒｏｓｅ　５．０％）、组３（体积分数　分别为ＦＢＳ　２０％、ＤＭＳＯ　６％、Ｓｕｃｒｏｓｅ　７．５％）、组４（体积　分数分别为ＦＢＳ　２０％、ＤＭＳＯ　７．５％、Ｓｕｃｒｏｓｅ　１０％）不同　体积分数梯度　的冻存液各２０　ｍｌ，置于４℃保存备用。　将１５０只兔角膜随机分组：３只正常未冷冻处理的新　鲜兔角膜作为对照组；根据不同的降温程序将剩余兔　分为４９个亚组，每个亚组均采用３只兔角膜。　１．２．２实验方法耳缘静脉空气栓塞兔子，摘除完整　眼球，在超净台上沿角巩膜缘外１～２　ａｍ将角膜全层剪　下，放于在４℃已备好的角膜瓶中，分别将４个组的保　存液各２　ｍｌｊＪｌ入其中，４℃浸泡１０　ｍｉｎ…，最后放于程控　降温仪中，调至起始温度０℃，第一阶段终止温度一１８　℃，第二阶段终止温度一８０℃。第一阶段分为７种降温　速度（０．５　ｃ（＝／ｍｉｎ、１．０℃／ｍｉｎ、１．５℃／ｍｉｎ、２．０℃／ｍｉｎ、　２．５℃／ｍｉｎ、３．０℃／ｍｉｎ、３．５℃／ｍｉｎ），第二阶段将第一　阶段的每一种再用７种降温速度（２．０℃／ｍｉｎ、　３．０℃／ｍｉｎ、４．０℃／ｍｉｎ、５．０℃／ｍｉｎ、６．０℃／ｍｉｎ、　Ｃｈｉｎ　Ｏｐｈｔｈａｌ　Ｒｅｓ，Ｍａｙ　２００７，Ｖｏｌ　２５，Ｎｏ．５　７．０　ｏＣ／ｍｉｎ、８．０℃／ｍｉｎ）降温。总共４９种不同程序逐　步降温至一８０℃结束后，将角膜瓶放入液氮中保存。　１个月后复温，将角膜瓶从液氮中取出，在４０℃下复苏　融冻约２　ｍｉｎ后即刻取出，最后移除角膜瓶中的冻存液　并再加入含有２５％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ一１６４０洗脱ＤＭＳＯ，时间　为１０　ｍｉｎ，最后去除洗脱液。染色固定，０．４％茜素红和　０．２５％苔盼蓝各数滴加入到内皮面上染色后生理盐水漂　洗　，２．５％戊二醛２　ｍｌ浸泡角膜片固定后生理盐水漂　洗，镜下观察。　１．３统计学处理　运用ＳＰＳＳ　１　１．０软件分析包进行统计分析处理。　染色后的角膜在显微镜下计算，每个角膜片均计算中　央４个不同视野，数据采用两因素的方差分析，Ｐ＜　０．０５为差异有统计学意义。　

２　结果　２．１形态学观察　显微镜检结果见未经过冷冻处理的新鲜兔角膜片　内皮细胞排列整齐、紧密连接，茜素红和苔盼蓝联合染　色法可见细胞膜呈红色的六边形轮廓，未见蓝染的胞　核（图１）。经过各种不同降温速度处理的角膜片镜检　可发现，细胞间隙稍增大，有些细胞排列仍然整齐，细　胞轮廓大多呈现圆形或不规则形状（图２），但其余不同　速度下保存的部分角膜内皮细胞排列已经不规则，轮廓　不清，可见较多蓝染的细胞核，有些部分细胞成片缺失，　甚至可见大片融合的细胞，仅残留裸核（图３～５）。　２．２镜下计数　统计分析发现，第一阶段各种降温速度及第二阶段　各种降温速度结果均显示第一阶段的降温速度　２．０　ｏＣ／ｍｉｎＨ￣的存活率高。在第一阶段降温速度为　２．０℃／ｍｉｎＨ￣第二阶段降温速度５．０℃／ｍｉｎＨ￣角膜内皮　细胞的存活率达到最高，而其他不同降温速度下可见染