毛冬青根中木脂素配糖体提取工艺及纯化鉴定研究

时珍国医国药２００８年第１　９卷第４期ＬＩＳＨＩＺＨＥＮ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ　ＡＮＤ　ＭＡＴＥＲＩＡ　ＭＥＤＩＣＡ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ　２００８　ＶＯＬ．１　９　ＮＯ．４　

毛冬青根中木脂素配糖体提取工艺及纯化鉴定研究　周中流　，邹节明　，王力生　，曾　立　，尹文清　（１、广西师范大学化学化工学院，广西桂林　５４１００４；　２．桂林三金药业股份有限公司，广西桂林５４１００４）　

捅要：目的研究毛冬青总木脂素配糖体最佳提取工艺，并将总木脂素配糖体进行纯化鉴定。方法采用正交实验，考察　乙醇浓度、提取温度、固液比及提取时间４个因素对该工艺的影响；利用Ｄ１０１大孔树脂分离纯化毛冬青总木脂素配糖　体。结果确定了毛冬青木总脂素配糖体的最佳提取工艺为：提取时间为１．５　ｈ，提取温度为８０℃，乙醇浓度７０％，固液比　１：５；纯化后的总木脂素配糖体经红外光谱初步鉴定与ｔｏｒｔｏｓｉｄｅ　Ａ对照品都具有木脂素母核的基本结构特征。结论优　选出的最佳提取工艺条件及纯化总木脂素配糖体的方法，对进一步的工艺开发有较好的参考价值。　关键词：毛冬青；木脂素配糖体；提取工艺；纯化；　鉴定　中图分类号：Ｒ２８４．１　文献标识码：Ａ　文章编号：１００８－０８０５（２００８）０４－０８６８－０２　

Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉＯｎ　Ｏｆ　Ｔｏｔａｌ　Ｌｉｇｎａｎｓ　ｆｒｏｍ　Ｉｌｅｘ　ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ　Ｈｏｏｋ．ｅｔ　Ａｒｎ．　ＺＨＯＵ　Ｚｈｏｎｇ—ｌｉｕ　，ＺＯＵ　Ｊｉｅ—ｍｉｎｇ　，ＷＡＮＧ　Ｌｉ—ｓｈｅｎｇ　，ＺＥＮＧ　Ｌｉ　，ＹＩＮ　Ｗｅｎ—ｑｉｎｇ　’　（１．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆＣｈｅｍ￣ｔｒｙ＆Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅ￣ｉｔｙ，Ｇｕｉｌｉｎ　５４１００４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｇｕｉｌｉｎ　Ｓａｎｆｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．．Ｇｕｉｌｉｎ　５４　１　００４．Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｌｉｇｎａｎｓ　ｆｒｏｍ　Ｐｕｂｅｓｃｅｎｔ　Ｈｏｌｌｙ　ｒｏｏｔ，ａｎｄ　ｌｉｇｎａｎｓ　ｗａｓ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂｙ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ，ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｔｈａｎｏｌ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｓｏｌｉｄ　ｔｏ　ｌｉｑｕｉｄ　ａｎｄ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｌｉｇｎａｎｓ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｗｅｒｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｌｉｇｎａｎｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｂｙ　Ｄ一１０１　ｐｏｒｏｕｓ　ｒｅｓｉｎ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｗａｓ　ａｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｆ　８０　ｏＣ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｗａｓ　７０％，ｓｏｌｉｄ／ｌｉｐｕｉｄ　ｒａｔｉｏ　ｗａｓ　１：５　ａｎｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ＷａＳ　１．５　ｈ．Ｉｔｓ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｗａｓ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ｂｙ　ＩＲ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ，ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｂｏｔｈ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｌｉｇｎａｎｓ　ａｎｄ　ｔｏｒｔｏｓｉｄｅ　Ａ　ｈａｄ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｅｔｕｒｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉ—　ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ａｒｅ　ｖｅｒｙ　ｕｓｅｆｕｌ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｉｌｅｘ　ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ　Ｈｏｏｋ．ｅｔ　Ａｒｎ．；Ｔｏｔａｌ　ｌｉｇｎａｎｓ；　Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ｐｒｏｃｅｓｓ；Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　

毛冬青ｌｌｅｘ　ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ　Ｈｏｏｋ．ｅｔ　Ａｒｎ是冬青科冬青属下的一种　植物，常绿灌木，产于广东、广西、安徽等地。毛冬青的根是我国　江南一些省区民间常用药，经现代药理实验和临床应用证明，是　治疗心血管疾病较好的药物…。据文献报道　，毛冬青根中含　ｌｉｒｉｏｄｅｎｄｒｉｎ、ｔｏｒｔｏｓｉｄｅ　Ａ、（＋）一ｍｅｄｉｏｒｅｓｉｎｏｌ　ｄｉ—Ｏ—ｐ—Ｄ—ｇｌｕｃｏ—　ｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、（＋）一ｐｉｎｏｒｅｓｉｎｏｌ一４，４　一Ｏ—ｂｉｓｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ等木　脂素成分，都是以木脂素为苷元的配糖体，结构在局部有高度的　对称性。据报道　它们用来制备补药，能够降压，调节神经系　统，增强身体抵抗力，且对血压有双相调节等功效。　毛冬青根中总木脂素配糖体的提取工艺尚未见报道，本文拟　通过正交实验研究毛冬青根中总木素配糖体的最佳提取工艺条　件，以总木脂素配糖体提取率为指标，系统地考察了溶剂浓度、固　液比、提取时间、提取温度等因素的影响，最后优选出最佳提取方　案，并对采用该方案提取的毛冬青总木脂素配糖体进行分离、纯　化及鉴定，为本地毛冬青及毛冬青木脂素配糖体的开发利用提供　实验数据和理论指导。　１器材与方法　１．１　材料与试剂毛冬青干燥根由广西柳州市中药饮片厂提　供，药材经由广西师范大学生命科学院唐绍清教授鉴定为冬青科　植物毛冬青ｌｌｅｘ　ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ　Ｈｏｏｋ．ｅＬ　Ａｍ的干燥根；木脂素配糖体　ｔｏｒｔｏｓｉｄｅ　Ａ对照品系笔者从广西毛冬青根中分离得到的单体，其　它试剂均为分析纯。　１．２仪器ＴＵ一１９０１双光束紫外可见分光光度计（北京普析通　收稿日期：２００７－０７－０３；修订日期：２００７—１１—１８　基金项目：桂林三金药业股份有限公司横向课题［２００４］　作者简介：周中流（１９８１一），男（汉族），湖南邵阳人，现为北京中医药大学　在读博士研究生，硕士学位，主要从事天然有机化学研究工作．　通讯作者简介：尹文清（１９６８一），女（汉族），湖南郴州人，现任广西师范大　学化学４￣－ｘ－学院副教授，博士学位，主要从事天然产物研究与开发工作．　・８６８・　用仪器有限责任公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；电　子天平（沈阳龙腾电子称量仪器有限公司）。　１．３方法　１．３．１样品提取工艺称取毛冬青干燥根粗粉１００．０　ｇ，按表１　所示的正交条件，采用不同体积分数的乙醇加热回流提取，合并　所得浸膏加水溶解，依次用石油醚、水饱和的正丁醇萃取，减压蒸　干萃取液，干燥得到粗提物用１５０　ｍｌ甲醇溶解，作为待测液。　１．３．２　毛冬青干燥根中总木脂素配糖体的定量测定以木脂素　配糖体ｔｏｒｔｏｓｉｄｅ　Ａ为对照品，用分光光度法测定木脂素配糖体含　量并计算毛冬青总木脂素配糖体提取率。　总木脂素配糖体提取率（％）＝［（提取液中木脂素配糖体　总量）／（所用毛冬青干燥根原料量）］×１００％　１．３．３　正交实验选取乙醇浓度、提取温度、固液比及提取时间　四因素作ｋ（３　）正交实验，（见表１，２）。并对结果进行方差分　析和显著性检验。见表３。　２结果　２．１　毛冬青总木脂素配糖体的定量测定　２．１．１　标准溶液和标准曲线的测定ｔｏｒｔｏｓｉｄｅ　Ａ对照品经无水　甲醇溶解后于ＴＵ一１９０１双光束紫外可见分光光度计上作最佳　吸收波长扫描并绘制扫描曲线，实验结果显示在２７５　ｎｍ处有最　大吸收且反应３　ｈ内其吸光度保持稳定。　精确称量木脂素配糖体ｔｏｒｔｏｓｉｄｅ　Ａ对照品５　ｍｇ，用无水甲醇　溶解并定容至２５　ｍｌ，再依次配制成５，１０，１５，２０，４０，８０　ｍｌ的　标准溶液，以无水甲醇为空白，在２７５　ｎｍ处测定吸光度，回归分　析得到标准曲线为Ｙ＝０．０２１　４Ｘ＋０．０３５，式中】，为吸光度，　为　ｔｏｒｔｏｓｉｄｅ　Ａ含量（　ｍ１），　的取值在５～８０　ｇ范围内线性关　系良好，相关系数ｒ＝０．９９８　９。　２．１．２　毛冬青总木脂素配糖体的提取率测定精确吸取　“１．３．１”项下待测液０．２　ｍｌ并稀释定容至２５　ｒｎｌ，在２７５　ｎｍ处测　定吸光度，从而可以得到毛冬青总木脂素配糖体的提取率。结果　

维普资讯 http://www.cqvip.com ＬＩＳＨＩＺＨＥＮ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ　ＡＮＤ　ＭＡＴＥＲＩＡ　ＭＥＤＩＣＡ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ　２００８　ＶＯＬ．１９　ＮＯ．４　时珍国医国药２００８年第１９卷第４期　见表２。　２．２正交实验的设计及结果用乙醇为溶剂提取的４因素、３水　平正交实验因素、水平见表１，结果见表２。对表中总木脂素配糖　体提取率进行方差分析和显著性实验，结果见表３。表２中出现的　ｋ　，ｋ　，ｋ３分别代表某个因素的不同水平的指标值加和，　，　，　墨分别代表某个因素的不同水平的指标平均值，Ｒ代表极差。　通过比较各因素的极差值（Ｒ）可以看出，影响总木脂素配　糖体提取率的因素顺序为Ｄ＞Ａ＞Ｃ＞Ｂ，具体见表２。从表３可　以看出，乙醇浓度和提取时间对毛冬青总木脂素配糖体的提取有　显著性影响，并考虑总木脂素配糖体的提取率和实际生产情况，　最终确定的最佳提取工艺条件为：Ｄ。Ａ　ｃ　Ｂ，，即乙醇的体积分数　为７０％，固液比为１：５，提取时间为１．５　ｈ，提取温度为８０℃。此　条件下提取后测得总木脂素配糖体的含量为０．４３８％。　２．３最佳提取工艺的验证精密称取３份干燥的毛冬青干燥根　５０．０　ｇ，按最佳工艺条件平行操作，按照“１．３．１”项下和“１．３．２”　项下测定吸光度，根据回归方程得出毛冬青总木脂素配糖体的含　量，其结果见表４。由表４最佳工艺验证结果表明，用最佳工艺　条件提取，毛冬青总木脂素配糖体提取率均高于其它各正交实验　值，故本最佳工艺条件合理。同时ＲＳＤ＝２．２％也表明此工艺重　复性好，具有较好的稳定性。　

表１正交实验因素水平　

实验号　Ａ　Ｂ　ｃ　。　

９９（２，２）＝９１．Ｏ１，　９５（２，２）：１９．００，Ｐｏ　９（２，２）＝９．００；　代表　显著；一代表特别显著　

２．４　毛冬青总木脂素配糖体的纯化称取５００　ｇ的毛冬青干燥　根粉末按正交实验中确定的方法提取，减压浓缩至无醇味，加蒸　馏水溶解，静置过夜，过滤，将滤液稀释定容至１　０００　ｍｌ。定量取　１００　ｍｌ溶液，加到已经预处理好的Ｄ１０１大孔树脂柱上，先用蒸　馏水洗脱，除去糖类、无机盐等不易被吸附的物质，然后用３０％　的乙醇水溶液进行洗脱，合并洗脱液并浓缩至干，得到干燥浸膏。　然后按“２．１．２”项操作，测定吸光度，根据回归方程计算纯化后　上述浸膏中总木脂素配糖体的含量，所得总木脂素配糖体的纯度