ha-syn蛋白核酸疫苗pVAX1-hαSH1-140的构建及其表达

重庆医学２００８年９月第３７卷第１７期　・论　著・　ｈａ－ｓｙｎ蛋白核酸疫苗ｐＶＡＸ１一ｈａＳＨ　。的构建及其表达　

王加才，王少君，彭国光，罗　琴，江思德，王法祥　（重庆医科大学附属第一医院神经内科，重庆市神经病学重点实验室４０００１６）　

１９５３　

摘　要：目的　构建含人ａ一突触核蛋白（ｈｕｍａｎ　ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ｈａ—ｓｙｎ）编码基１１Ｉ的真核重组载体，并在ＣＯＳ－７细胞中表达，为帕　金森病的核酸疫苗开发奠定基础。方法通过ＰＣＲ方法扩增ｈａ—ｓｙｎ基因的ＣＤＳ全长片段，含酶切位点ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ和Ｋｏｚａｋ　序列。扩增产物和真核表达载体ｐＶＡＸ１经双酶切、纯化、连接，转化感受态细胞Ｅ．ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０，筛选含目的基１１Ｉ的重组载体　ｐＶＡＸｌ—ｈａＳ　．，并在ＣＯＳ－７细胞中表达，用ＲＴ—ＰＣＲ法和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测其表达产物。结果　经单、双酶切证实插入的基　因片段大小一致，基因测序证实其序列和方向完全正确。用ＲＴ—ＰＣＲ法和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测表明，重组质粒ｐＶＡＸ１一ｈａＳ　。在　ＣＯＳ一７细胞中能表达目的蛋白，而且具有生物活性。结论　成功构建了核酸疫苗ｐＶＡＸ１一ｈａＳ　。，并在ＣＯ８－７细胞中表达，为帕　金森病的核酸疫苗治疗研究奠定了良好的基础。　关键词：帕金森病；人ａ一突触核蛋白；核酸疫苗　中图分类号：Ｒ７４５、１；Ｒ９７９．ｊ　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７１—８３４８（２００８）１　７—１９５３—０３　

Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｐＶＡＸ１‘ｈａＳ＿＿ｌ４。ｃｏｄｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ａ‘ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ　ＷＡＮＧ　Ｊｉａ—ｃａｉ，ＷＡＮＧ　Ｓｈａｏ—Ｊ“＂，ＰＥＮＧＧ“ｏ—ｇｕａｎｇ，ｅｔ　ａ１．　（ＴｈｅＦｉｒｓｔ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，ＣｈｏｎｇｑｉｎｇＭｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　４０００１６，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ａｎ　ｅｕｋａｒｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｈｕｍａｎａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ（ｈａ—ｓｙｎ）ａｎｄ　ｂｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ＣＯＳ一７　ｃｅｌ１．ａｎｄ　ｌａｙ　ｔｈｅ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｏｆ　Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ　ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ（ＰＤ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｆｕｌｌ—ｌｅｎｇｔｈ　ＣＤＳ　ｏｆ　ｈａＳ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　ｗｅｒｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ＰＣＲ，ｗｈｉｃｈ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｓｉｔｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅｓ　Ｋｐｎ　Ｉ　ａｎｄ　Ｘｂａ　Ｉ　ａｎｄ　Ｋｏｚａｋ　ｃｏｎｓｅｎ—　ＳＵＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃｏｎ　ａｎｄ　ａ　ｅｕｋａｒｙｍｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＶＡＸ１　ｗｅｒｅ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｋｐｎ　Ｉ，Ｘｂａ　Ｉ　ｓｉｍｕｌｔａｎｏｕｓｌｙ，ａｎｄ　ｗｅｒｅ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｌｉｇａｔｅｄ　ｂｙ　Ｔ４　ｌｉｇａｓｅ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ　ｐＶＡＸ１一ｈａＳ１　ｌ４。ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ、ｃｏｉｌ　ＴＯＰ１０　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｌｏｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ａｎｄ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ，ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎ—　ｃｉｎｇ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ　ｗｅｒｅ　ｔｈｅｎ　ｔｅｓｔｅｄ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ＣＯＳ一７　ｃｅｌｌｓ　ｕｓｉｎｇ　ＲＴ—ＰＣＲ　ａｎｄ　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｐＶＡＸｌ　ｖｅｃｔｏｒ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｃｌｏｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｈａＳ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｃｔ　ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎ—ｆｒａｍｅ．Ｔｈｅ　ＤＮＡ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ　ｐＶＡＸ１一ｈａＳ＿＿ｌ“）ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｈａ－ｓｙｎ　ｇｅｎｅ　ｗｅｒｅ　ｓｈｏｗｎ　ｔｏ　ｂｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ＣＯＳｙ７．Ｔｈｅ　ｈａＳ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　ａｎｄ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ＲＴ—ＰＣＲ　ａｎｄ　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓ—　ｅｎｔ　ｓｔｕｄｙ　ｈａｖｅ　ｐｒｏｍｐｔｅｄ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｔｏ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ　ｌａｙ　ｔｈｅ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ＰＤ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐａｒｋｉｎｓｏｎ　ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ；ｈｕｍａｎ　ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ；ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｖａｃｃｉｎｅ　

帕金森病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ　ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）是一种常见于中老年　人的渐进性神经变性疾病，其主要的病理改变是黑质多巴胺　（ＤＡ）能神经元严重缺失和残存神经元内出现一种嗜酸性包涵　体，即ｌ　ｅｗｙ小体。ｌ　ｅｗｙ小体是ＰＤ的特征性病理改变，主要　由ａ一突触核蛋白（ａ—ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａ—ｓｙｎ）等多种蛋白质的异常聚集　而形成。目前ＰＤ的各种疗法还无法针对此病理的关键环节　开展治疗，药物治疗仅能在ＤＡ代谢水平进行对症处理。ＰＤ　的治疗是世界医学难题，其免疫治疗已成为当今的研究热点，　如ｈａ－ｓｙｎ肽类疫苗主动免疫能清除ｈａ－ｓｙｎ转基因小鼠脑内异　常的ｈａ—ｓｙｎ　。，但主动免疫可能激发有害的炎性反应一　。核　酸疫苗和佐剂的兴起为ＰＤ的免疫治疗开辟了一条新途径。　本文将构建ｈａ—ｓｙｎ核酸疫苗，并探讨疫苗在真核细胞中的表　达，为ＰＤ的免疫治疗奠定理论和实验基础。　１材料与方法　１．１实验材料　在前面的实验中，已克隆ｈａ—ｓｙｎ目的基因　ＰＡＲＫ１的编码区序列，并经亚克隆装入ｐＶＡＸ１质粒，ｐＶＡＸｌ　质粒由欧阳应松博士赠送，编码基因两端分别有Ｋｐｎ　Ｉ、　ＸｂａＩ的酶切位点。ＣＯＳ－７细胞（非洲绿猴肾成纤维细胞）、大　肠杆菌ＴＯＰ１０由重庆医科大学基础研究所保存。ＤＮＡ聚合　酶、Ｔ４　ＤＮＡ连接酶、限制性内切酶Ｋｐｎ　Ｉ、Ｘｂａ　Ｉ及ＴｆｘＴＭ　阳离子脂质体等购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司，无内毒素质粒小量　抽提盒购自Ｏｍｅｇａ公司。卡那霉素、核酸相对分子质量标准、　蛋白相对分子质量标准购自Ｔｉａｎｇｅｎ公司，胎牛血清购自杭州　四季青生物公司。总ＲＮＡ抽提盒、ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒购自　Ｔａｋａｒａ公司。ａ—ｓｙｎ抗体和辣根过氧化酶（ＨＲＰ）标志的兔抗　羊二抗ＩｇＧ购自Ｋｅｍｉｃｏｎ公司，标准蛋白ｈａ—ｓｙｎ购自北京博　奥森生物技术有限公司，化学发光试剂购自Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司，　其他试剂均为国产分析纯。　１．２方法　１．２．１　ＰＣＲ引物的设计、合成及目的片段的扩增与纯化　根　据ｐＶＡＸ１质粒的特点优化目的片段，以已连接目的基因的　ｐＶＡＸ１的重组质粒为模板，用Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ　５．０软件设计　引物，在引物的５　端加酶切位点Ｋｐｎ　Ｉ和Ｋｏｚａｋ结构，引物交　由上海生工生物工程公司合成。上游引物：５　ＣＧＧ　ＧＧＴ　ＡＣＣ　ＡＣＣ　ＡＴ　ＧＧＡ　ＴＧＴ　ＡＴＴ　ＣＡ一３　，下游引物：５．＿ＧＣＧ　ＧＧＴ　ＴＴＡ　ＡＡＣ　ＧＧＧ　ＣＣＣ　ＴＣＴ　ＡＧ－３　（注：ＰＣＲ模板上终止密码　后已带Ｘｂａ　Ｉ的酶切位点）。以已装入目的基因的ｐＶＡＸ１的　重组质粒为模板，ＤＮＡ聚合酶，９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性　

维普资讯 http://www.cqvip.com １９５４　４０ｓ，６Ｏ℃退火４０ｓ，７４℃延伸３０ｓ，３０个循环，７２℃延伸５ｍｉｎ，　扩增ｈｃ￣－ｓｙｎ的基因片段。ＰＣＲ产物经２　琼脂糖电泳鉴定其　大小，用回收试剂盒经胶回收纯化，并将此重组子命名为　ｐＶＡＸ１一ｈａＳｌ—ｌ４０。　１．２．２重组质粒的构建用限制性内切酶ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ双　酶切ｈｃ￣－ｓｙｎ和ｐＶＡＸ１质粒载体，再胶回收纯化，Ｔ４　ＤＮＡ连　接酶连接，制备感受态细胞，然后转化感受态细胞ＴＯＰＩＯ，用　质粒小量抽提盒抽提质粒，经Ｋｐｎ　Ｉ、Ｘｂａ　Ｉ单、双酶切后，用　２　琼脂糖电泳鉴定其大小，并交北方同正科技公司测序鉴定　其方向和序列的完整性。　１．２．３重组质粒转染细胞　将处于对数期的ＣＯＳ－７细胞接　种于６孔培养板内，次Ｅｔ在单层细胞上加入２：１的ＴｆｘＴＭ　阳离子脂质体和重组质粒ｐＶＡＸ１一ｈａｓ　ｔ。混和物，置ＣＯ　培养　箱中培养１ｈ后，加入含胎牛血清的新鲜ＤＭＥＭ培养液培养　４８ｈ。　１．２．４表达产物的ＲＴ－ＰＣＲ鉴定　根据ｈａ—ｓｙｎ的表达基因　ＰＡＲＫ１的ＣＤＳ序列和猴　ａｃｔｉｎ内参照序列设计引物，目的　基因的上游引物为：５　一ＡＴＧ　ＴＴＧ　ＧＡＧ　ＧＡＣ　ＣＡＧ　ＴＧＧ　ＴＧ一　３　，下游引物为：５　一ＧＴＴ　ＣＧＴ　ＡＧＴ　ＣＴＴ　ＧＡＴ　ＡＣＣ　ＣＴＴ　ＣＣＴ　（２－３　。　ａｃｔｉｎ的上游引物为：５，＿ＧＣＣ　ＴＣＴ　ＧＧＣ　ＣＧＴ　ＡＣＣ　ＡＣＴ　ＧＧＣ－３　，下游引物为：５　一ＣＣＡ　ＧＧＡ　ＡＧＧ　ＡＡＧ　ＧＴＴ　ＧＧＡ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　Ｃ－３　。抽提已转染ＣＯＳ－７的总ＲＮＡ，进行逆　转录反应得到ｃＤＮＡ。以ｃＤＮＡ作为模板，用上述引物，９４℃　预变性５ｍｉｎ，９４℃变性６０ｓ，６Ｏ℃退火３０ｓ，７４℃延伸３０ｓ，３Ｏ次　循环，７２℃延伸５ｍｉｎ，扩增ｈａ—ｓｙｎ目的基因片段。扩增产物用　２　琼脂糖凝胶电泳，ｈｃ￣－ｓｙｎ基因和８一ａｃｔｉｎ的扩增产物分别为　２１９、３７３ｂｐ。　１．２．５重组质粒表达产物的Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测　将ＣＯＳ－７　细胞、ｐＶＡＸ１和ｐＶＡＸＩ－ｈｃ￣Ｓｌ＿１４０转染的Ｃ０　７细胞培养４８ｈ　后，分别收集细胞，用裂解液提取细胞株蛋白后，用紫外分光光　度计测样品蛋白浓度作初步定量。蛋白用９５℃变性５ｍｉｎ，经　１５　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，常规将蛋白转移至ＰＶＤＦ膜上，５　脱　脂奶粉封闭６０ｍｉｎ，羊抗人ｈａｓ一抗１：２　０００室温下孵育过　夜，用ＴＢＳＴ洗涤ｌＯｍｉｎ￣３次，加二抗（兔抗羊ＩｇＧ－ＨＲＰ，１：　１　０００）室温下孵育２ｈ，用ＴＢＳＴ洗涤ｌＯｍｉｎ×２次，用ＴＢＳ洗　涤ｌＯｍｉｎＸ１次，然后用ＥＣＬ显色，以ｈｃ￣－ｓｙｎ标准蛋白为内参　照，进行Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测表达目的蛋白的生物学活性。　２结　果　２．１　目的片段的ＰＣＲ扩增　通过ＰＣＲ方法扩增目的片段，　扩增片段长度为４６１ｂｐ。用琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见一约　４６０ｂｐ的条带，与预期片段一致，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回　收，见图１。　２．２重组质粒的构建　抽提的质粒ｐＶＡＸ１一ｈａｓ“　经Ｋｐｎ　Ｉ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ单、双酶切鉴定其大小。目的基因连入载体　后连接产物为３　３７０ｂｐ，如重组质粒被双酶切完整切下，会有　２　９４０、４３０ｂｐ　２个条带。重组质粒经Ｋｐｎ　Ｉ、ＥｃｏＲ　Ｉ双酶切，　如完整切下，会有３　０３３、３３７ｂｐ　２个条带。电泳可见到单酶切　有１条３　３７０ｂｐ的条带，Ｋｐｎ　Ｉ、Ｘｂａ　Ｉ双酶切有２　９４０、４３０ｂｐ　的条带各１条｝ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ双酶切有３　０３３、３３７ｂｐ条带各１　条，同预期片段大小一致，从而证实重组质粒的大小和方向均　正确。经测序也证实其序列完全正确，无移码，见图２。　２．３重组质粒表达产物的ＲＴ－ＰＣＲ鉴定扩增产物经２　琼　重庆医学２００８年９月第３７卷第１７期　脂糖凝胶电泳，ＰＡＲＫ１扩增产物和￣－ａｃｔｉｎ的扩增产物分别为　２１９、３７３ｂｐ。将ＣＯＳ－７细胞、ｐＶＡＸ１和ｐＶＡＸ１一ｈａＳｌ＿１４０转染的　ＣＯＳ－７细胞培养４８ｈ后抽提ＲＮＡ。只有ｐＶＡＸ１一ｈａＳ　。转染　的ＣＯＳ一７细胞能扩增出相应的条带，而ｐＶＡＸ１转染的ＣＯＳ－７　细胞培养４８ｈ后及ＣＯＳ－７细胞抽提ＲＮＡ未出现相应的条带，　说明ｐＶＡＸ１一ｈａＳ　。转染是成功的，见图３。　２　ｌ　Ｍ