Western Blot操作步骤及说明
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Western Blotting操作方法 1).Protein extraction Extraction buffer: Sucrose 0.7 M Tris/HCl 0.5 M EDTA 50 mM KCl 0.1 M 配制成母液pH 9.4 -mercaptoethanol 2% (freshly added) Protease Inhibitor 25× (freshly added) 注：Protease Inhibitor：使用罗氏Protease Inhibitor Cocktail Tablets，一片用于50ml工作液，所以一片药片溶于2ml水中配成25×母液，4℃储存时，在水中可以稳定存放1-2周，-20℃可以存放12周。 取100-200 mg植物叶片，用液氮速冻后用研磨仪打碎（若量比较大可用液氮研磨，分装到多管中） ，加入500 µl 提取缓冲液，涡旋； 完全混匀后加入500 µl 苯酚（分层，取下层酚层）, 涡旋； 在3000 g 的转速下离心10 min, 4 °C 拿两只新的EP管，各取200 µl 离心后的上清液； 向两只EP管中各加入1 ml 0.1 M NH4Ac（用甲醇溶解配制）；
在-20°C下沉淀放置至少2 h过夜放置； 在13000 rpm转速下离心5 min， 4 °C； 用 0.1 M NH4Ac（用甲醇溶解配制）洗涤，用枪头将蛋白吹散，洗净杂质； 在13000 rpm转速下离心5 min， 4 °C； 取上清后空甩EP管，去除多余的溶液； 室温干燥蛋白（不能过度干燥）, 用1% SDS（100ul左右）溶解蛋白。 2). 测定总蛋白浓度。 The protein concentration of the extracts was determined with the BCA protein Assay kit. (1)Protein concentration 1. Coomassie brilliant blue（考马斯亮蓝G250） 通过与蛋白质内的氨基和羧基基团间的静电结合作用以及范德华力，考马斯亮蓝与蛋白质形成强但非共价键连接的复合物。蛋白-染料复合物的形成稳定染料携带的负电荷阴离子（如磺酸基），从而产生在膜上或者胶上肉眼可见的蓝色 2. BCA（选用） 二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和独特的BCA Solution A(含有BCA)相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。 1测定总蛋白浓度步骤：按照BCA试剂盒说明书进行操作 1.配制标准曲线的标准样品--胎牛血清蛋白（BSA）浓度 BSA原液浓度：5mg/ml
原液浓度 原液体积 1%SDS体积 终浓度
5mg/ml 100 900 500ug/ml 500ug/ml 80 20 400ug/ml 500ug/ml 60 40 300ug/ml 500ug/ml 50 50 250ug/ml 500ug/ml 80 120 200ug/ml 200ug/ml 75 75 100ug/ml 100ug/ml 50 50 50ug/ml 100 0ug/ml 2. 待测样品稀释 用Nanophotometer初步测一下待测样品的浓度，计算好稀释的体积，使得终浓度在标准曲线区间内。 3.加样准备测定 标准样品和待测样品各准确吸取20μl溶液于酶标孔中（注意标准曲线样品做三个重复），加入BCA工作液200μl。 4.配制BCA工作液 计算好所有样品需要的BCA工作液总体积[(标准品的个数+待测蛋白样品的个数)×（实验重复次数）×（用于每个样品的工作液的体积）=所需工作液总体积]，按照A:B=50:1的比率来配制工作液总体积（A液的量按照计算的所需工作液总体积来算，加入对应的B液）。 5. 加入BCA工作液时将工作液和每个样品均混匀（注意排枪的最大量程为300ul，先调枪，保证每个枪头的液面平齐即加液量一样），于60保温30min（放入开始计时）或室温放置两个小时，冷却至室温后（十分钟左右）。 6.测定： 拿出来时，样品由绿色变为有梯度的紫色，在酶标仪上562nm处比色。 2. 数据分析 以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。以标准曲线空白为对照，根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量. 3. 根据标准曲线计算原溶液的总蛋白浓度 得到的浓度值要乘以稀释比才得到原浓度。 4. 根据样品体积和浓度，用1%SDS稀释得到终浓度的样品。配制可溶性总蛋白终浓度1ug/ul的溶液 3). SDS-PAGE 配胶
下层分离胶 15% 18% 12% 10%
H2O 2.3ml 1.3ml 3.3ml 4.0ml 30%丙烯酰胺 5.0ml 6.0ml 4.0ml 3.3ml 上层浓缩胶 4% H2O 6.0ml 30%丙烯酰胺 1.3ml PH=6.8 0.5M Tris-HCl 2.5ml 10% SDS 100ul APS 100ul TEMED 8ul 注：APS在半月内使用，TEMED易被氧化变黄； 根据蛋白大小确定胶浓度 6%胶 50-150kD 8%胶 30-90kD 10%胶 20-80kD 12%胶 12-60kD 15%胶 10-40kD TEMED和APS是促凝剂，加入后迅速混匀，用1ml枪头加入夹好的玻璃板中，沿内侧壁加入，约4ml，加2ml75%乙醇液封，轻弹防止分离胶有气泡。待下层分离胶凝固后，倒掉乙醇，晾干，再配制上层浓缩胶，每块胶需约2ml。若有气泡，将气泡吸走后，插上梳子（从一侧插入，慢慢完全插进去，可以防止起泡的产生），观测梳子周围有无气泡，若有，重插梳子。 上样 将装好的玻璃板夹好，中间倒入SDS-PAGE电泳缓冲液（不漏液），液面超过上样孔，拔出梳子； 样品处理：准备好的样品100℃或沸水浴加热其10分钟，以充分变性蛋白。 冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。 上样量至少2ug，根据自己的蛋白表达量确定。
PH=8.8 1.5M Tris-HCl 2.5ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml 10% SDS 100ul 100ul 100ul 100ul APS 100ul 100ul 100ul 100ul TEMED 8ul 8ul 8ul 8ul 恒流 上层胶：20mA/板 下层胶：40mA/板 恒压 上层胶：80V 下层胶：120V 溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳（此时可用于考马斯亮蓝染色，观测目的蛋白的表达情况）。 4). Western blotting 转膜 电泳结束后，将凝胶放入transfer buffer 中浸泡； 准备PVDV膜，将膜剪成5*8cm（由胶大小决定）大小，切角标记，在甲醇中浸泡10秒，浸于transfer buffer中； 将滤纸和海绵也用transfer buffer浸泡（不要和胶，膜放在一起）； 按顺序夹好凝胶：黑板-海绵-滤纸-凝胶-膜-滤纸-海绵-白板，放置凝胶和滤纸时注意要轻轻赶走气泡，转膜90V,1h。（注意转模时蛋白涌动方向为由负极到正极，即由黑到红（白），放入湿转槽中时，颜色要对应）； 洗膜：用TBST洗膜2min，向盒子中加入足量TBST淹没膜，盒子放在平行摇床上洗涤； 封闭： 将膜在5%的block buffer(5%脱脂奶粉，1*TBST)中封闭1h，用脱色摇床转，转速不要太大； 附一抗： 将一抗用5%脱脂奶粉按1：3000稀释后，将膜用杂交袋封好，加入含有一抗的牛奶将膜完全封闭，室温附一个半小时到两个小时，或者4℃过夜（可以回收抗体）； 洗膜：将膜在1*TBST中漂洗3次，盒子放在平行摇床上洗涤，每次10分钟； 附二抗：用5%脱脂奶粉稀释HRP标记的二抗（1：3000），将膜用杂交袋封好，加入含有二抗的牛奶，室温附一个半小时； 洗膜： 将膜在1*TBST中漂洗3次，每次10分钟； 配制ECL反应液（A:B=1:1各取500ul加到1.5mlEP管中，加时注意换枪头以免污染，混匀后使用），将反应液混合均匀涂在膜正面，黑暗条件处理两分钟，用AI600显示结果。 Western相关试剂 （1）5xTris-Glycine buffer(1L)（SDS-PAGE电泳缓冲液） Tris 0.125M 15.1g Glycine 1.25M 94 g SDS 0.5% 5.08g 200 ml buffer +800 ml H2O 1L （2）SDS-PAGE loading buffer 5x SDS-PAGE loading buffer 10 ml 2 x SDS-PAGE loading buffer Tris-HCl PH6.8 250mM 2.6ml 100 mM SDS(W/V) 10% 1g 4% 甘油(W/V) 50% 5ml 20% BPB(溴酚兰) 0.5% 50mg 0.2% 巯基乙醇(W/V) 5% or 500ul 或者 500mmol/L DTT 加入巯基乙醇的loading buffer可在室温下保存一个月左右 （3））Transfer buffer (1L 10×母液) 39mM甘氨酸 48mM Tris 0.037% SDS 29g 58g 3.7g 先配制电转液10×母液，用时需要现配电转液，取700ml去离子水，加入100ml 10×电转液母液，加入200ml甲醇混匀（现配现用）。 （6）5*TBS:（1L） 100 mM Tris-HCl（PH7.5） 2.5M Nacl 100 ml 1M Tris-HCl PH7.5 146.1g 配制1M Tris-HCl PH7.5作为母液。 （7）1*TBST（1L）现用现配
