猪皮胶原的酶法提取

hn ics of p ig sk in w ere in t roduced by p ro tea se. It cou ld be concluded tha t hyd ro lyzed p roduct of
p ig sk in m a in ly concen t ra ted in certa in m o lecu la r w eigh t by p ro tea se, w h ich d iffered from indu st ria l
图 1 碱法明胶及两步法酶水解样品 电泳图
表 1 为不同水解工艺产物各分 子量段所占的比例, 3 种工艺条件同 212, 酶用量均为 200U g 皮。从表中 可以看出, 3 种工艺产物的分子量分 布差异较大。 抑活两步法工艺水解 的产物, 集中分布在大于 97kD 分子 量段, 这说明抑活两步法工艺水解
凝胶浓度: 10% ; 染色方法: 银染法; 样品编号: 1# 明胶溶液;
布的影响。相同酶水解工艺中, 随酶 用量的增加, 大分子含量逐渐减少, 而小分子含量逐渐增多。
2# - 5# 不抑活两步法, 酶用量分别为 100、200、500、1 000U g;
6# - 8# 抑活两步法, 酶用量分别为 500、200、100U g
将工业蛋白酶分散于去离子水 中, 搅 拌 60m in 后, 用 布 氏 漏 斗 抽 滤, 收集滤液。向滤液中分批缓慢加 入 研 成 细 末 的 (N H 4 ) 2SO 4, 直 至 75% 的饱和溶液, 静置一段时间后 抽滤得盐析物, 冰箱 4℃下保存待 用, 每次使用前测酶活力。
新鲜猪皮经脱脂、清水洗涤后, 切成大约 10mm ×10mm 的皮块, 冰 箱冷冻保存待用。 11212 一步法水解工艺
Keywords co llagen p ro tea se hyd ro lyzing techn ics lea ther w a ste
胶原蛋白是由动物的成纤细胞 过程中的副产品, 资源丰富, 价廉易 合成的一种生物高分子, 其广泛地 得。这些来自屠宰场的下脚料, 除一 存在于动物骨、腱、软骨、皮及其它 部分用于皮革、食品等行业外, 其它 结缔组织中。 由于其与人体组织良 很大一部分都未能很好利用。同时,
称取预处理好的皮块于圆底烧 瓶中, 加入相应量的酶溶液, 用缓冲 溶液调节其 pH 值, 然后直接在 60 - 75℃的水浴中搅拌 1- 4h, 趁热用
纱布过滤得水解产物。 11213 不抑活两步法水解工艺
称取预处理好的皮块于圆底烧 瓶中, 加入相应量的酶溶液, 用缓冲 溶液调节其 pH 值, 在 16 - 43℃水 浴中搅拌 1- 6h 后, 弃去酶溶液, 并 水洗皮块 2 次, 然后加入蒸馏水, 分 别在 50 - 75℃水浴中搅拌作用 30 - 120m in, 趁热用纱布过滤得水解 产物。 11214 抑活两步法水解工艺[ 4 ]
称取预处理好的皮块于圆底烧 瓶中, 加入相应量的酶溶液, 用缓冲 溶液调节其 pH 值, 在 16 - 43℃水 浴中搅拌 1- 6h 后, 弃去酶溶液, 用 含 N aC l 的稀盐酸或酸性缓冲溶液 作用皮块 2 次, 直至皮内残存的酶 全部失活, 水洗皮块 2 次, 然后加入 蒸馏水, 在 50- 75℃水浴中搅拌 30 - 120m in, 趁热用纱布过滤得水解 产物。 113 猪皮酶水解产物的分析 11311 SD S- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 分析[ 5- 8 ]
图 3 不同酶水解工艺水解产物黏 度与酶用量的关系
中图分类号 TS 51 文献标识码 A
A bstrac t A k ind of indu stria lized p ro tea se w a s u sed a s raw m a teria l. T h ree k ind s of d ifferen t hyd ro lyzing tec2
图 2 反映了不同酶水解工艺皮 的溶解率与酶用量的关系。3 种工艺 酶的作用时间均为 2h, 热溶解温度 为 65℃, 其中抑活两步法和不抑活 两步法工艺的第一步酶作用温度为 39℃, 热溶解时间为 60m in。 从图中 可以看出: 3 种工艺中, 相同酶用量 时不抑活两步法工艺的皮溶解率最 大, 抑活两步法工艺皮溶解率最小; 3 种工艺皮的溶解率均随酶用量的 增加而增加, 但 3 种工艺皮的溶解 率随酶用量的变化幅度却有明显的 差异: 其中不抑活两步法的热溶解 率, 随酶用量的增加增幅最大, 抑活 两步法的热溶解率随酶用量的增 加, 增长的幅度相对较小。
度, 均随酶用量的增加而降低, 其中 抑活两步法得到的皮降解产物的黏 度, 要比另 2 种ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ法得到的产物的
色深浅有所差异, 这说明该位置处 黏度大得多, 其黏度随酶用量增加 各条谱带蛋白质的量发生了变化。 而降低的幅度也要明显得多。
试验条件下, 抑活两步法和不抑活
两步法 2 种水解工艺对分子量分布
的 影响, 要大于酶用量对分子量分
猪皮胶原蛋白及其水解物的提 取, 通常有酸法、碱法、酶法以及酸、 酶 法 结 合 使 用, 碱、酶 法 结 合 使 用 等。用蛋白酶水解猪皮胶原, 作用条
好的生物相容性、生物可降解性和 制革工业中也有大量的边角余料未 件温和, 所需设备简单, 可以减少环
低抗原性等性质, 故作为一种生物 医学材料, 已广泛应用于组织工程 及临床中; 作为化妆品原料, 胶原蛋 白具有良好的保湿性及修复组织、 活化真皮组织、美白等作用; 同时,
第
32 卷 第 5 2003 年 3 月
期 C中H IN A国 L E皮A TH革ER
V
o l. M
32 a r.
N o. 2003
5
猪 皮 胶 原 的 酶 法 提 取Ξ
Hydrolyz ing techn ics of p igsk in collagen by protea se
制成革就被抛弃, 造成环境污染。而 鲜猪皮中[1], 除去 70% - 75% 的水 分和 1% 的脂肪外, 约含有 21% 23% 的蛋白质, 在医药、化妆品等领 域已得到广泛应用的胶原蛋白, 占
境污染, 具有其它方法所没有的优 点。尤其重要的是, 酶法水解产物分 子量的分布特点, 使其有利于开发 成高附加值产品[2]。 本文对从猪皮 中提取胶原蛋白的一步法、抑活两
根据水解产物样品分子量的大 小, 调整分离胶浓度为 6% - 10% , 使样品中的组分尽可能在电泳图上 完全展开, 采用银染和考玛斯亮蓝 R - 250 两种染色方法。 11312 电泳图谱薄层扫描分析[ 9 ]
首先选定由 11311 得到的电泳 图上的一点进行光谱扫描, 确定电 泳图最大的反射波长, 然后在此波 长条件下对电泳图进行色谱扫描, 并用标准分子量的蛋白质确定位 置, 计算样品各分子量段分子所占 的比例。 11313 黏度测定[10- 11 ]
·6·
第 5 期 胡胜等 猪皮胶原的酶法提取 专题研究
工业化的蛋白酶, 成本较低, 为工艺 的最后产业化奠定了基础。 1 试验部分 111 主要试验原料及设备
中性蛋白酶 (无锡酶制剂厂); 新鲜猪皮 (成都地区); 酪素 (化学 纯, Sigm a 公司) ; 明胶 (食用级, 河北 省阜城明胶厂) ; SD S- 聚丙烯酰胺 电泳低分子量标准蛋白质 (中国科 学院上海生物研究所) ; T ris, SD S, 巯基乙醇, 琼脂糖, 丙烯酰胺, 甲叉 双丙烯酰胺, 甘氨酸 (生化纯, Sigm a 公司) ; Fo lin 试剂 (自制) ; 其余试剂 均为分析纯。
gela t in a t ta ined by ba se. A nd hyd ro lyzed p ropo rt ion of p ig sk in and m o lecu la r w eigh t d ist ribu t ing of
it s p roduct s w ere d ifferen t in d ifferen t react ion cond it ion.
胶原蛋白在食品、保健品等领域也 有广泛的应用。
另一方面, 猪皮作为猪肉加工
了蛋白质总量的 80% 以上。因此, 研 究从猪皮中提取胶原蛋白, 具有重 大经济价值和环保意义。
步法和不抑活两步法等 3 种不同酶 法工艺进行了研究, 并对各工艺的 特点进行了比较。 采用的原料为已
Ξ 国家自然科学基金资助项目, 批准号: 29876025; 教育部骨干教师基金资助项目, 教技师[ 2000 ]143 号 ΞΞ 第一作者简介: 胡胜, 男, 1974 年生, 工学硕士
胡胜ΞΞ 1, 2 李志强1 陈敏1
(11 四川大学皮革化学与工程教育部重点实验室, 成都 610065; 21 四川西普油脂化工有限公司, 绵阳 621000)
H u S hen g 1, 2, L i Zh iq ia n g 1, Chen M in 1 (1. The Key Labora tory of L ea ther Chem istry
CS - 930 型 双 波 长 薄 层 扫 描 仪, Sh im adzu 公 司; U V - 2501PC 型紫外分光色度仪, Sh im adzu 公司; 722 型分光光度计, 上海分析天平仪 器厂; pH S- 2C 型精密酸度计, 萧山 市科学仪器厂; D YY - - 28A 型 电泳槽, 北京六一仪器厂; 乌氏黏度 计 (毛细管内径 0145mm ) , 上海玻璃 仪器一厂。 112 试验工艺及方法 11211 粗 酶 及 新 鲜 猪 皮 的 预 处 理[ 3 ]
将 水 解 样 品 在 35℃水 浴 中 解 冻, 测样品的固含量, 然后稀释样品 到合适浓度, 然后按照文献方法测
定黏度。 2 结果与讨论 211 碱 法 明 胶 与 酶 法 提 取 皮 胶 原 分子量分布的差异
图 1 中 1# - 8# 分别是碱法明 胶及抑活两步法和不抑活两步法酶 水解工艺产物的 SD S- 聚丙烯酰胺 凝胶电泳图。从图中可以看出: 碱法 明胶和酶水解产物的凝胶电泳图有 明显的区别。 酶法水解产物的电泳 图能够看到一条条可以明显区分开 的谱带, 而碱法明胶的电泳图是一 条完全连续的带, 找不到能够分开 的谱带。 这是由于酶对蛋白质的作 用通常是选择性的, 它只作用蛋白 质的某些位点, 因此其水解产物只 是集中在某些分子量处; 而碱对蛋 白质的作用位点是没有选择性的, 任何酰胺基都可以被水解, 所以最 后水解产物分子量的分布几乎是连 续的, 在电泳图上则表现为一条连 续的带。 碱法明胶分子平均分子量 远小于抑活两步法工艺水解产物平 均分子量, 但大于不抑活两步法工 艺水解产物平均分子量。 212 3 种酶水解工艺皮溶解率差异
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专题研究 中 国 皮 革 第 32 卷
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213 3 种酶水解工艺产物分子量分 试验条件同 212, 样品测定浓度为
布的比较
1%。 3 种方法得到的水解产物的黏
从图 1 还可以看到, 水解工艺 和试验条件的不同, 水解产物电泳 图上的每条谱带在相同位置处的颜
and Eng ineer ing of M in istry of Educa t ion , S ichuan Un ivers ity, Chengdu 610065;
21S ichuan S ipo O il & Fa t Chem ica l Co. L td. , M ianyang 621000)
摘 要 以工业化的蛋白酶为原料, 采用 3 种不同的工艺, 对提取猪皮胶原的生物酶法进行了研究。研究发现: 猪 皮的酶水解产物分子呈不连续分布, 主要集中在某些分子量处, 与碱法工艺明胶分子量的分布明显不 同; 且酶处理条件不同, 水解得率与产物分子量的分布也不同。
关 键 词 胶原 蛋白酶 酶水解工艺 制革废弃物