拮抗菌B_FS06的鉴定及其发酵产物对黄曲霉的抑制作用

黄瓜枯萎病拮抗菌的筛选鉴定及其生物防效

韦巧婕;郑新艳;邓开英;王小慧;高雪莲;沈其荣;沈标

【期刊名称】《南京农业大学学报》

【年(卷),期】2013(36)1

【摘 要】从生长健康的黄瓜根际土壤中分离筛选得到1株对黄瓜枯萎病病原菌——尖孢镰刀菌黄瓜专化型具有较强拮抗作用的细菌菌株B,根据其生理生化特性及16S rRNA基因序列分析,初步鉴定其为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。菌株B含有fenB、bam和ituA、ituB、ituC、ituD基因,它们分别是Fengycin、Bacillomycin和Iturin生物合成的相关基因。菌株B还对棉花黄萎病、甜瓜枯萎病、辣椒疫病等病原菌也有较强的拮抗作用。盆栽试验表明:拮抗菌B与有机肥发酵制成的微生物有机肥(BIO)对黄瓜枯萎病有显著的防治作用,发病率降低了66.7%,病情指数下降了67%,防治效果达到80.7%;而单纯使用有机肥(OF)发病率不仅不能降低,而且还有所上升。施用BIO能促进根际细菌及放线菌数量,抑制真菌及尖孢镰刀菌数量。施用BIO显著提高黄瓜植株的生物量及其体内SOD、POD及CAT等酶的活性。结论:微生物有机肥能有效防治黄瓜枯萎病病害,促进植株生长。

【总页数】7页(P40-46)

【关键词】黄瓜枯萎病;拮抗细菌;抗生素合成基因;生物防治;微生物区系

【作 者】韦巧婕;郑新艳;邓开英;王小慧;高雪莲;沈其荣;沈标

【作者单位】南京农业大学资源与环境科学学院/江苏省固体有机废弃物资源化高技术重点实验室 【正文语种】中 文

【中图分类】Q939.92;S476.9

【相关文献】

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2.黄瓜枯萎病拮抗菌株的筛选及其生物防效 [J], 王丽丽;朱诗君;金树权;周金波;徐强

3.尖镰孢黄瓜专化型枯萎病菌拮抗菌的筛选、鉴定及培养条件优化 [J], 张美君;吴庆;尹翠;王妮;马晓庆;马晓霞;曹云娥

张玉申，仝文君，陈晓璐，等. 黄曲霉毒素B1降解菌的筛选鉴定及有效降解组分初探[J]. 食品工业科技，2023，44（9）：177−182.doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022110090ZHANG Yushen, TONG Wenjun, CHEN Xiaolu, et al. Screening and Identification of Aflatoxin B1 Degradation Strains andPreliminary Exploration of Effective Degradation Components[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(9): 177−182. (inChinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022110090 · 生物工程 · 黄曲霉毒素B1降解菌的筛选鉴定及有效降解组分初探张玉申，仝文君，陈晓璐，雷　瑶，周云静，都立辉*（南京财经大学食品科学与工程学院，江苏南京 210023）摘　要：黄曲霉毒素B1（AFB1）是具有强毒性、强致癌性的一种真菌毒素。为了筛选出AFB1降解菌，将实验室保藏的真菌菌株与AFB1共培养，选取降解率最高的菌株，经形态学和ITS rDNA分析确定其种属，分离菌株不同组分（菌悬液、菌体、孢子液、发酵液）后探究其降解AFB1的有效组分，并将有效组分菌体破碎后作进一步探究。结果表明：培养72 h后的郝克氏青霉MD1菌悬液和未破碎菌体对AFB1降解率分别为98.15%和28.20%，菌体破碎后对AFB1的降解效果更好，培养24 h后对AFB1的降解率为55.40%。因此，郝克氏青霉MD1的菌悬液和菌体内的活性组分能有效降解AFB1。本研究筛选出的郝克氏青霉MD1扩大了AFB1降解菌的菌种库，为AFB1的生物降解提供了一定的参考价值。关键词：黄曲霉毒素B1，郝克氏青霉，生物降解，活性组分，鉴定本文网刊: 中图分类号：TS201.3 文献标识码：A 文章编号：1002−0306（2023）09−0177−06DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2022110090Screening and Identification of Aflatoxin B1 Degradation Strains andPreliminary Exploration of Effective Degradation ComponentsZHANG Yushen，TONG Wenjun，CHEN Xiaolu，LEI Yao，ZHOU Yunjing，DU Lihui*（College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China）Abstract：Aflatoxin B1 (AFB1) is a type of fungaltoxin with strong toxicity and strong carcinogenicity. To screen degradingbacteria of AFB1, co-culture of fungi strains which were stored in laboratory and AFB1 was carried out and the strains withthe highest degradation rate were chosen. Species of the chosen strains were determined through morphology and ITSrDNA analysis. After separation of different components (bacterial suspension, thalli, spore suspension and fermentationliquor) in strains, the effective components for AFB1 degradation were explored, and the effective components thalli wasbroken for further investigation. Results showed that the AFB1 degrading rates by Penicillium herquei MD1 bacterialsuspension cultured by 72 h and the unbroken thalli were 98.15% and 28.20%, respectively. The degradation of AFB1 wasbetter after the fragmentation of the thalli, and the degradation rate of AFB1 was 55.40% after 24 h of incubation. Therefore,the active components in MD1 bacterial suspension and thalli can degrade AFB1 effectively. The screened MD1 expandsthe degrading bacterial library of AFB1 and provide some references to biological degradation of AFB1.Key words：aflatoxin B1； Penicillium herquei；biodegradation；bioactive ingredients；identification黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFs）主要是由黄曲霉和寄生曲霉产生的一种聚酮合酶类次级代谢产物[1]。目前已经发现20余种黄曲霉毒素，主要包括B1、B2、G1、G2、M1、M2等，其中黄曲霉毒素B1（AFB1） 收稿日期：2022−11−09 基金项目：国家重点研发计划子课题（2020YFC1606801）；江苏省研究生科研与实践创新计划（KYCX21_1526）。作者简介：张玉申（1998−），女，硕士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail：*****************。* 通信作者：都立辉（1981−），男，博士，教授，研究方向：食品微生物，E-mail：******************。第 44 卷 第 9 期食品工业科技Vol. 44 No. 92023 年 5 月Science and Technology of Food IndustryMay 2023Copyright©博看网. All Rights Reserved. 的毒性最强[2]。由于AFB1具有强毒性、强致癌性并且污染普遍，世界卫生组织国际癌症研究机构（Inter-national Agency for Research on Cancer，IARC）将其划为IA类致癌物[3]。研究表明，AFB1对饲料和粮食作物的污染极为广泛，且污染范围还在不断扩大，给食品和畜禽养殖等行业造成了严重的危害和巨额的经济损失[4] 。因此，寻找可以降解甚至消除AFB1的方法至关重要。目前脱除黄曲霉毒素的方法主要分为物理法、化学法与生物法[5−7]。然而物理法和化学法在处理食品的过程中会使食品变质变性，产生化学物质残留[8−9]，由此引发的一系列安全问题，使得这些技术难以实施推广。生物法由于不产生残留毒性，不改变食品或饲料特性等优势，成为了研究热点。利用微生物，特别是具有益生菌性质的微生物进行AFB1脱毒，是一种安全、绿色、环保和高效的方法[10−12]。Ali等[13]研究了10株从土壤和家禽粪便中分离的细菌，其中荧光假单胞菌SZ1对AFB1的降解率为99%。Li等[14]分离鉴定出一株耐盐嗜盐四球菌，其对AFB1污染的酱油的降解率为92%。Ragoubi等[15]发现保加利亚菌CIP 101027T可有效降解AFB1，菌株在MRS培养基中比在PBS中降解效果更好，降解率提高了18%。本研究从真菌菌株中筛选出一株能够高效降解AFB1的菌株MD1，通过形态学和ITS rDNA分析鉴定菌株MD1为郝克氏青霉；进一步分离菌株不同组分（菌悬液、发酵液、孢子液、菌体），确定郝克氏青霉MD1有效降解AFB1的组分为菌体；破碎菌体后差速离心得到各体系，检测各体系对AFB1的降解效果，初步分离有效降解组分。本研究为谷物粮食和动物饲料中黄曲霉污染所带来的巨大经济损失提供了生物防治的新思路，郝克氏青霉首次被发现可用于降解AFB1，这为黄曲霉毒素的生物降解提供了的优良种质资源和技术支持。1　材料与方法1.1　材料与仪器微生物样品　实验室研究人员前期从稻谷中分离保藏的真菌菌株[16]；AFB1标准品　源叶生物科技有限公司；色谱级甲醇、乙腈　美国TEDIA公司；色谱级甲酸　上海Macklin生化科技有限公司；2×TaqMix　广州东盛生物科技有限公司；引物（ITS1/ITS4）、DNA分子量标准Maker S（100~5000 bp）、DNA纯化试剂盒、T载体、PCR产物快速连接试剂盒、4SGreen Plus无毒核酸染料　上海生工生物工程有限公司；分散固相萃取填料　安谱实验科技股份有限公司。PDB培养基（g/L）：4 g马铃薯浸粉，20 g葡萄糖，121 ℃高压灭菌 20 min。PDA培养基：PDB培养基中加入14 g/L琼脂　购于海博生物技术有限公司。WATERS H-Class/Xevo TQ-S串联四级杆液质联用仪　美国沃特世公司；H1650-W高速冷冻离心机　湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；THZ-D台式恒温振荡器　上海百典仪器设备有限公司；GI54DP立式高温高压灭菌锅　致微公司；EX30显微镜　舜宇光学科技有限公司；日立SU8020扫描电镜　日本日立公司；EDC-810梯度PCR仪　北京东胜创新生物科技公司；DYC-Mini4琼脂糖凝胶电泳仪　伯乐生命医学产品上海有限公司。1.2　实验方法1.2.1 降解AFB1菌株的活化与筛选　参照Ragoubi等[15]的方法并略作修改，菌株接种在PDA平板上，28 ℃培养5 d后，用生理盐水洗下孢子并调整孢子液浓度为106 CFU/mL。2% 孢子液接种至含有AFB1的PDB培养基（AFB1-PDB），AFB1-PDB中AFB1终浓度为100 ng/mL。以不含孢子液AFB1-PDB作为空白对照，分别在0 h和28 ℃、160 r/min培养72 h后取上清液检测AFB1含量（ng/mL），其中，0 h取AFB1-PDB体系中上清液检测AFB1含量作为初始 AFB1浓度，28 ℃、160 r/min培养72 h后取AFB1-PDB体系中上清液检测AFB1含量作为反应后 AFB1浓度。1.2.2 AFB1的提取与检测　参照刘烁等[17]、Maxwell等[18]和Ji等[19]的方法，取1 mL 1.2.1中上清液过0.22 μm滤膜后−20 ℃保存待测。参照熊超平[20]和Ran等[21]的方法并略作修改，LC-MS-MS条件为：WATERS H-Class/Xevo TQ-S串联四级杆液质联用仪，C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相为0.1%甲酸水:甲醇=1:1（V/V）；进样量为0.5 μL，流速为0.4 mL/min，柱温40 ℃，梯度洗脱如表1所示。 表 1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase时间（min）流速（mL/min）A（%）B（%）0.0~3.00.490103.0~3.50.440603.5~4.60.410904.6~6.00.49010 质谱条件为ESI+离子化模式，毛细管电压3 kV，温度500 ℃，雾化气流量1000 L/Hr，采集模式为MRM（多反应监测模式）。AFB1的质谱信息如表2所示。 表 2 AFB1的保留时间、监测离子及质谱采集参数Table 2 Retention time, monitoring ion and mass spectrumacquisition parameters of AFB1目标物保留时间（min）监测离子对锥孔电压（V）碰撞能量（V）驻留时间（s）AFB13.37313.2>241.140360.017313.2>285.1*40240.017注：*为定量离子对。 用甲醇配制5、25、50、100、200、300 ng/mL的AFB1标准系列工作液。经检测所得标准曲线方 · 178 ·食品工业科技2023年 5 月

第２５卷第６期　２０１０年１２月　天津科技大学学报　

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｖｂ１．２５　ＮＯ．６　Ｄｅｃ．２０１０　

解淀粉芽孢杆菌ＢＩ２的鉴定及其对黄曲霉的抑制作用　

王德培　，孟　慧　。，管叙龙　。，罗学刚　

（１．天津科技大学生物工程学院，天津３００４５７；２．工业微生物教育部重点实验室，天津３００４５７；　３．天津市丁业微生物重点实验室，天津３００４５７）　

摘要：菌株ＢＩ２是从青贮玉米秸秆饲料中分离得到的一株苹兰氏阳性芽孢杆菌．经１６Ｓ　ｒＤＮＡ序列分析，发现该菌　

株与解淀粉芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（ＮＣ　００９７２５）的相似性达到９９．６％；进一步结合Ｂｉｏｌｏｇ及生理生化分　析，将该菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌．以番茄叶霉病菌、黄瓜枯萎病菌等１２种植物病原菌及部分霉菌、酵母、食品乳酸　

菌和人类致病细菌为指示菌进行抑菌实验．结果表明：ＢＩ２主要抑制丝状真菌，而对细菌无拮抗作用；ＢＩ，菌株生长３６　ｈ　

的上清液能明显抑制黄曲霉孢子萌发及其菌丝生长，抑制率分别达到６７．４％和７４．８％；而且该上清液经１２０℃高温处理　２０　ｍｉｎ后对黄曲霉的抑制效果基本没有影响．　

关键词：解淀粉芽孢杆菌；菌株鉴定；黄曲霉；抑菌潘　

中图分类号：Ｑ９３９．１２４　文献标志码：Ａ　文章编号：１６７２—６５１０（２０１０）０６—０００５—０５　

Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　ＢＩｚ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　

Ａｇａｉｎｓｔ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｌａｖｕｓ　

ＷＡＮＧ　Ｄｅ—ｐｅｉ　，ＭＥＮＧ　Ｈｕｉ　，ＧＵＡＮ　Ｘｕ—ｌｏｎｇ　，ＬＵＯ　Ｘｕｅ—ｇａｎｇ　，　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＴｉａｎｊｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３００４５７　Ｃｈｉｎａ；　２．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３００４５７，Ｃｈｉｎａ；　３．Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３００４５７，Ｃｈｉｎａ）　

玉米黄曲霉毒素污染拮抗菌的筛选·鉴定及控制效果

作者：杜立武 高素艳 杜瑞焕 张立田 王玉丽 项爱丽 董李学

来源：《安徽农业科学》2019年第20期

摘要;黄曲霉毒素是饲料等农副产品中重要的有毒有害污染物，是一类强致癌性、剧毒性真菌毒素，对畜禽健康危害巨大。该研究对黄曲霉毒素污染拮抗菌开展研究，为黄曲霉毒素污染治理提供技术支持。从河北迁安、迁西、遵化、玉田及丰南饲用玉米或饲料中分离细菌，通过室内外试验，获得对黄曲霉具有较强拮抗力的菌株B45和B6。经分子生物学及理化性质鉴定，菌株B45和B6为解淀粉芽孢杆菌。进一步开展了B45和B6对黄曲霉菌丝生长的抑制作用、黄曲霉毒素的消减作用及黄曲霉毒素的分解作用研究，结果表明，拮抗菌可以显著抑制产毒黄曲霉菌丝生长，降低黄曲霉毒素的产生及消除黄曲霉毒素。

关键词;农产品;饲料;黄曲霉毒素污染;拮抗菌;抗菌活性

中图分类号;TS210.1文献标识码;A 文章编号;0517-6611（2019）20-0007-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.20.002

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Screening，Identification and Control Effects of Aflatoxin;contaminated Antagonistic Bacteria

in Corn

DU Li;wu;GAO Su;yan2， DU Rui;huan2，3 et al

（1.The Agricultural and Pastoral Bureau of Qianxi County，Tangshan，Hebei064000;2.Tangshan City Food and Drug Comprehensive Inspection and Testing Center，Tangshan，Hebei 063000;3.Hebei Province Agricultural Products Quality and Safety Engineering